自发性肥胖型糖尿病大鼠血浆蛋白组学分析

Plasma Proteomic Analysis of Zucker Diabetic Fatty Rats

摘要

采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术对自发性肥胖型糖尿病（Zucker diabetic fatty，ZDF）大鼠的血浆蛋白组进行分析，比较其与Zucker瘦型（Zuker lean， ZL） 大鼠血浆蛋白质表达的差异，从蛋白质水平分析ZDF大鼠作为2型糖尿病模式生物的特性。分别选取5周龄SPF（无特定病原体动物）级雄性ZDF大鼠和ZL大鼠饲养至12周，饲养过程中记录饮食饮水量，测量体重、血糖、胰岛素水平，处死后取血浆并去除血浆高丰度蛋白质，用iTRAQ试剂标记后进行质谱分析。ZDF大鼠在饲养过程中表现出2型糖尿病典型的多饮多食多尿特征，同时出现高血糖、高胰岛素血症和高胰岛素抵抗指数症状。ZDF大鼠与对照大鼠血浆中表达量差异超出2倍的蛋白质共有405个，其中C反应蛋白上调，一系列载脂蛋白、氧化应激相关蛋白质、凝血相关蛋白质均存在差异。ZDF大鼠还存在脂代谢异常，机体处于氧化应激状态，并且出现一定程度的心血管并发症。

Abstract

In this paper, iTRAQ （isobaric tags for relative and absolute quantification） technology was used for proteomic analysis of Zucker diabetic fatty (ZDF) rat’s plasma. Compared with that of Zucker lean (ZL) rats, the differences in protein expression were characterized for type 2 diabetes at the protein level. Five-week-old SPF male ZDF rats were selected and were bred for 12 weeks. The dietary and water consumption were recorded, and body weight, blood glucose and insulin levels were measured. Plasma was taken after execution and the high abundance of plasma proteins were removed and labeled with iTRAQ reagents for mass spectrometry analysis. ZDF rats showed the typical characteristics of type 2 diabetes, such as excessive drinking, eating and urination, and symptoms of hyperglycemia, hyperinsulinemia and high insulin resistance index. There were 405 proteins with more than 2-fold difference compared with controls in ZDF rat plasma, among which C-reactive protein was up-regulated, a series of apolipoproteins, oxidative stress-related proteins and coagulation-related proteins were differentially expressed. ZDF rats have abnormal lipid metabolism, a state of oxidative stress, and some degree of cardiovascular complications.

Graphical abstract

关键词

2型糖尿病 / 蛋白组学 / 定量分析 / 同位素标记相对和绝对定量方法（iTRAQ）

Key words

type 2 diabetes / proteomics / quantitative analysis / isobaric tags for relative and absolute quantification（iTRAQ）

0　 引 言

自发性肥胖型糖尿病（Zucker diabetic fatty，ZDF）大鼠是一种瘦素受体基因（fa基因）突变的Zucker fatty fa/fa（ZF）大鼠。雄性ZDF大鼠均会经历糖耐量受损、胰岛素抵抗（血糖正常、高胰岛素血症）后形成2型糖尿病^［1］，并出现糖尿病的典型症状，如多饮、多尿和体重增加^［2］等症状，后期则会出现血管病变、视网膜病变、心肌病变、认知功能障碍、神经组织病变等并发症^［3，4］，所以有较多针对2型糖尿病的相关研究采用ZDF大鼠作为模式生物，并基于ZDF大鼠构建糖尿病合并症模型^［5］。

奚赛飞等^［6］发现，ZDF（fa/fa）大鼠适用于胰岛素抵抗引起的2 型糖尿病和代谢综合征的研究。基于ZDF大鼠的研究目前多集中于脂代谢、糖代谢（如骨骼肌糖代谢、肾脏糖代谢、肝脏糖代谢）以及胰岛细胞功能等方面^［7］。Wijekoon等^［8］对ZDF大鼠血浆、肝脏、骨骼肌中的氨基酸水平进行分析，指出ZDF大鼠胰岛素抵抗导致氨基酸代谢异常。Siwy等^［9］对ZDF大鼠尿液多肽分子进行分析，发现180个多肽分子与糖尿病并发症相关。而氨基酸和多肽是蛋白质合成过程中必不可少的物质，因此，研究ZDF大鼠的蛋白质水平十分必要。

本研究拟采用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）法对ZDF大鼠血浆蛋白组进行分析，比较其与Zucker瘦型（Zuker lean， ZL）大鼠血浆蛋白质表达的差异，进一步分析ZDF大鼠作为2型糖尿病模式生物的特性，并对差异蛋白质进行初步探讨。

1　 实验部分

1.1　实验动物饲养

5周龄SPF（specific pathogen free）级雄性ZDF大鼠12只、雄性ZL大鼠12只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2012-0001），饲养于华中科技大学实验动物中心（SYXK（鄂）2016-0057），饲喂专用饲料（Perina#5008）至12周龄。饲养期间记录饮食饮水量，每2周测定空腹血糖及体重，处死前进行糖耐量实验及胰岛素水平测定，处死后取血浆分装-80 ℃保存。

本研究已经过深圳市慢性病防治中心伦理委员会审批。

1.2　试剂与仪器

试剂：胰蛋白酶（Promega公司），乙腈（色谱纯，纯度≥99.9%）、甲酸（纯度≥ 98.0%）购自Merck公司，二硫苏糖醇（DTT，电泳级）、碘代乙酰胺（IAA，生化级）、大鼠血浆高丰度蛋白质去除试剂盒购自Sigma公司。

仪器：高速离心机（Eppendorf公司），超纯水系统（Millipore公司），Triple TOF^TM 5600 型高效液相质谱联用系统（AB SCIEX公司），Multiskan GO 型全波长酶标仪（Thermo公司），Mini-PROTEAN@Tetra System 型电泳仪（Bio-Rad 公司），GS-800 型凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）。

1.3　血浆高丰度蛋白质去除

采集大鼠静脉血2 mL于EDTA抗凝管中，4 ℃ 3 000g（g为重力加速度）离心10 min收集血浆及血细胞。取相同体积的12只ZL大鼠（或12只ZDF大鼠）血浆样品混合，制备ZL（或ZDF）混合样品。用大鼠血浆蛋白质去除试剂盒分别去除上述血浆样品中的白蛋白、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、触珠蛋白、纤维蛋白原等7种高丰度蛋白质。

1.4　蛋白酶解及iTRAQ标记

Bradford法定量去除高丰度蛋白质的ZL及ZDF混合样品，分别取100 μg待测蛋白样品，加入胰蛋白酶（体积比50：1），37 ℃酶切12 h，回收酶切产物。iTRAQ试剂114、116分别标记ZL、ZDF样品，标记完成后等量混合。

1.5　质谱检测

混合后的样品经高pH反向色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm C18柱，Techmate公司）预分级，流动相A为20 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为20 mmol/L醋酸铵的20%乙腈水溶液，流速0.8 mL/min；初始流动相为5% B流动相，55 min内升至90% B流动相，样品共分为18个组分，每组分浓缩复溶至25 μL。采用nanoLC-Triple TOF 5600型高效液相质谱联用系统检测所有组分，上样量8 μL，经脱盐柱（200 μm×0.5 mm，3 μm C18，AB SCIEX公司）、分析柱（75 μm×15 cm，3 μm C18，AB SCIEX 公司）后进行质谱检测，流动相A为含0.1%甲酸的超纯水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；洗脱梯度：起始5%流动相B，105 min内线性升至80%流动相B，维持5 min 后返回至5% 流动相B，流速：300 nL/min。质谱检测参数：母离子质荷比扫描范围为350~1 700，扫描速度为4图谱/秒；子离子质荷比扫描范围为100~1 700，扫描速度为10图谱/s。

1.6　质谱采集数据分析

利用ProteinPilot5.0（AB SCIEX公司）对各样品的一级和二级质谱图进行检索。参数设置：样品类型iTRAQ 2plex；数据库为SwissProt，Rattus norvegicus；半胱氨酸烷基化所用试剂为碘乙酰胺；消化酶为胰蛋白酶。PDST（ProteinPilot Descriptive Statistics Template）数据分析软件对iTRAQ数据进行进一步的整理和分析，ZDF组与ZL组蛋白质定量比值大于2或小于0.5时，认为该蛋白在两组中表达有差异。

2　 结 果

2.1　ZDF与ZL大鼠各项生化指标比较

饲养过程中，ZDF大鼠体重增长幅度明显高于ZL大鼠，ZDF大鼠于7周龄时表现出高血糖症状，此时血糖值为10.94±2.23 mmol/L。至12周龄时，ZDF大鼠空腹血糖显著高于ZL大鼠（血糖：ZDF约为15.17 mmol/L；ZL约为3.89 mmol/L），表现出2型糖尿病典型的多饮多食多尿特征，同时出现高胰岛素血症（胰岛素水平：ZDF约为9.72 ng/mL，ZL约为2.21 ng/mL）和高胰岛素抵抗指数特征。ZDF与ZL大鼠分别在5周龄和12周龄的各项指标如表1所示。

2.2　质谱数据比较分析结果

用iTRAQ试剂分别标记ZDF组和ZL组样品，本研究赖氨酸（lysine，简称K）上的同位素标记效率为100%，N端标记效率约为95%。

标记后的蛋白质混合样品经High pH RP柱预分级为18个组分，在梯度流动相作用下18个组分的多肽分子先后被均匀地洗脱后，进行MS/MS检测。

采集的质谱数据经ProteinPilot5.0软件检索，共鉴定蛋白质1 817个，定量分析结果显示，ZDF组与ZL组相比，表达量差异超出2倍的蛋白质共有405个，如图1所示。图1A为载脂蛋白A-Ⅱ的特征性多肽的二级质谱图，图1B为该肽段的定量报告基团信息，a、b峰分别为ZL和ZDF样品标记的114、116 iTARQ试剂报告基团的质谱峰，可用于该肽段的定量比较。

405个差异蛋白中，在ZDF组中表达量上调的有177个，表达量下调的有228个。经蛋白功能及通路分析，发现其中22种蛋白（多种载脂蛋白、抗氧化蛋白和凝血因子等）与糖尿病发病机制密切相关，例如：表达量上调的C反应蛋白，载脂蛋白A-Ⅱ、A-Ⅳ、C-Ⅰ、C-Ⅱ、M、D，脂肪酸合酶，凝血酶原，凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ；表达量下调的载脂蛋白H、E、B100，血管紧张素原，过氧化物还原酶1、2，谷胱甘肽过氧化物酶1，过氧化氢酶，视黄醛脱氢酶1，详见表2。本文重点讨论这22个蛋白。

3　 讨 论

本研究利用雄性自发性肥胖型糖尿病大鼠，对其血浆差异蛋白质进行分析。目前已有研究针对该类型大鼠的血浆^［10］及胰岛蛋白质^［11］进行鉴定，其中，Wang等^［10］利用串联质谱标签TMT（Tandem Mass Tags）定量蛋白的方法鉴定到697种血浆蛋白质，而本研究采用先去除血浆中的7种高丰度蛋白，再用iTRAQ标记的方法进行质谱鉴定，共鉴定蛋白质1 817个，可为该品种大鼠的相关研究提供更多的蛋白质数据。同时差异蛋白比对结果显示，ZDF大鼠血浆载脂蛋白、氧化应激相关蛋白、凝血相关蛋白存在不同程度的表达差异（与对照组ZL大鼠血浆蛋白质含量差异大于2倍）。鉴定结果主要表现出如下特征：

1） 部分载脂蛋白表达量显著上调。本文研究结果显示，ZDF大鼠血浆中载脂蛋白A-Ⅱ、A-Ⅳ、C-Ⅰ、C-Ⅱ、M、D浓度显著升高。载脂蛋白是血浆中脂蛋白的蛋白质部分，血浆中的脂类均与载脂蛋白结合组成脂蛋白，借助载脂蛋白的亲水性而溶于血浆中。载脂蛋白主要发挥脂类运输作用，同时具有调节酶活性及介导脂蛋白与细胞表面受体结合的功能^［12］。多种载脂蛋白浓度升高表明ZDF大鼠血浆存在血脂及脂代谢异常，需要大量表达载脂蛋白运送脂类，与以往多项研究均发现T2DM患者存在血脂异常且高表达多种载脂蛋白的结果^［13］一致。而异常的血脂水平可能导致机体的氧化损伤。

2） 多种抗氧化蛋白表达量下调。本文研究结果中ZDF大鼠血浆过氧化物还原酶1、2，谷胱甘肽过氧化物酶1，过氧化氢酶均处于较低水平，说明ZDF大鼠的抗氧化功能降低。有研究发现^［14］，高脂血症患者血浆中脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）和蛋白质氧化终产物隐形氧化蛋白产物（AOPP）均处于较高水平，而MDA和AOPP作为机体氧化应激反应的重要标志物表明，高脂血症患者处于氧化损伤状态。同时，有研究发现肥胖会导致载脂蛋白E（APOE）表达量降低，而ROS和氧化应激是抑制APOE产生的重要途径^［15］。本研究中ZDF大鼠血浆APOE浓度仅为ZL大鼠的0.182倍（表2），与上述研究较为一致，表明ZDF大鼠机体存在ROS堆积和较高的氧化应激水平。

长期高浓度的ROS堆积会使细胞膜、线粒体膜等的脂质过氧化，使其失去流动性，还可以攻击蛋白质、DNA等大分子，使其失去生物活性，影响细胞内一系列信号传导，诱导细胞损伤甚至凋亡^［16］。有研究发现在体外用H₂O₂处理3T3L和L6肌肉细胞会使其胰岛素敏感性下降^［17］，培养的胰岛素抵抗细胞在细胞坏死因子处理下会产生大量的ROS^［18］，而用N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂处理则会增加胰岛素敏感性^［19］。当机体发生胰岛素抵抗导致血糖升高时，葡萄糖进入β-细胞诱导合成和分泌胰岛素，在此过程中会产生大量CO₂刺激线粒体呼吸作用产生ROS，而β-细胞的抗氧化能力较弱^［20］，使其对氧化应激状态非常敏感，长期的氧化应激会使β-细胞功能紊乱，导致胰岛素的合成和分泌受阻，加重糖尿病进程。

3） 多种凝血因子水平显著增高。本研究中ZDF大鼠血浆多种凝血因子均显著高于对照组，且ZDF大鼠载脂蛋白H显著低于对照大鼠，结合载脂蛋白H在抑制血小板聚集、抗凝血方面的作用^［21］，表明ZDF大鼠血液处在高凝状态，并出现了一定程度的糖尿病以及心血管并发症。高脂、高糖、高氧化应激会通过糖基化终末产物生成、一氧化氮生物利用^［22］等多种途径影响血管内皮细胞，造成血管内皮功能障碍，凝血功能异常。

4　 结 语

本研究采用雄性自发性肥胖型糖尿病大鼠（ZDF）在饲养过程中表现出2型糖尿病典型的多饮多食多尿特征，同时出现高血糖、高胰岛素血症和高胰岛素抵抗指数症状。采用iTRAQ方法对ZDF大鼠血浆蛋白组学进行分析，结果显示ZDF大鼠与对照大鼠血浆中表达量差异超出2倍的蛋白质共有405个，其中C反应蛋白上调，而载脂蛋白、氧化应激相关蛋白质、凝血相关蛋白质的差异表明ZDF大鼠存在脂代谢异常，机体处于氧化应激状态，并且出现一定程度的心血管并发症。与目前针对2型糖尿病的发病或并发症研究较为一致，表明ZDF大鼠作为2型糖尿病蛋白组学研究的模式生物具有一定优势。所以，除以上重点讨论分析的一系列蛋白外，其他的差异蛋白质与2型糖尿病的相关性值得更深一步的分析。

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基金资助

国家自然科学基金(81673168)

广东省医学科学技术研究基金(A2020179)

深圳市科创委基础研究项目(JCYJ20170307144652484)