基于三维介孔碳的莱克多巴胺电化学检测方法

Electrochemical Detection of Ractopamine Based on Three-Dimensional Mesoporous Carbon

摘要

以ZnO为硬模板，淀粉为碳源，通过简单的混合干燥-碳化-模板去除策略，构建了一种具有三维内联结构的介孔碳材料。将制备的三维介孔碳（孔径尺寸约为30 nm）作为玻碳电极修饰材料，发现其能极大地增强瘦肉精分子莱克多巴胺的电化学氧化信号。通过物理和电化学表征发现，制备的三维介孔碳具有较大的比表面积和丰富的介孔结构，能显著提高电极表面电子转移速率和目标分子吸附能力。基于三维介孔碳对莱克多巴胺显著的电化学增敏效应，提出了一种高灵敏的莱克多巴胺电化学检测方法，线性检测范围为25 ~ 2 000 nmol/L，检出限为4.39 nmol/L。

Abstract

Three-dimensional interlinked mesoporous carbon was facilely prepared via a combination drying-carbonization-template removing strategy by using ZnO as the hard template and starch as the carbon source. When the glassy carbon electrode was modified by the as-synthesized three-dimensional mesoporous carbon material (pore size around 30 nm), it was found that the electrochemical oxidation signal of ractopamine was greatly increased. Physical and electrochemical characterization demonstrated that the as-synthesized three-dimensional mesoporous carbon material owned a large specific surface and abundant mesoporous structure, which could remarkably improve the electron transfer rate and the adsorption capacity of target molecules at the electrode interface. Based on the significant electrochemical sensitization effect of three-dimensional mesoporous carbon on ractopamine, an electrochemical method for ractopamine sensing was proposed in the range of 25-2 000 nmol/L with a low detection limit of 4.39 nmol/L.

Graphical abstract

关键词

食品安全 / 硬模板法 / 三维介孔碳 / 莱克多巴胺 / 电化学传感器

Key words

food safety / hard template method / three-dimensional mesoporous carbon / ractopamine / electrochemical sensor

0　 引 言

自2011年“瘦肉精事件”被首次曝光以来，食品安全尤其是猪肉安全问题已成为备受关注的民生问题之一。尽管国家食品安全相关执法部门一直对瘦肉精类添加剂采取零容忍态度，但瘦肉精类添加剂莱克多巴胺依然在某些猪肉制品中被零星查验出来。莱克多巴胺是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂，也被称为蛋白质再分配剂，具有调节生物体蛋白，促进生物体肌肉生长等功效。因此，莱克多巴胺经常被用于肌肉萎缩、支气管哮喘、心力衰竭等临床疾病的治疗中^［1］。相比于第一代瘦肉精盐酸克伦特罗，尽管莱克多巴胺具有代谢快、毒性小等特点，但莱克多巴胺的过量摄入同样会造成人体机能异常，例如出现恶心、四肢麻痹和心律失常等症状^［2］。建立猪肉样品中莱克多巴胺的高灵敏、快速检测方法对于食品行业规范发展、人类健康，乃至社会和谐稳定具有至关重要的意义。

电化学传感器，因其相对低廉的制备成本、较短的分析时间和较高的检测灵敏度在食品安全分析、环境监测和生物诊疗等方面展示了巨大的应用潜力^［3~5］。考虑到莱克多巴胺分子中具有电活性官能团，利用电化学传感技术，理论上可以实现莱克多巴胺的高灵敏快速检测。碳材料因其优异的性能已被广泛应用于电化学传感领域^［6，7］。通常而言，碳材料的电化学传感性能会因其形貌、结构和组成发生显著的改变，因此新型碳结构的制备对高性能电化学传感器的构筑至关重要。相对于广泛报道的一维碳纳米管和二维石墨烯，三维多孔碳材料也具有优异的电化学性能，在结构设计方面具有更大的操作空间^［8~10］。基于孔径的差别，三维多孔碳主要分为微孔碳（孔径小于2 nm）、介孔碳（2~50 nm）和大孔碳（孔径大于50 nm）三大类。作为尺寸介于微孔碳和大孔碳之间的三维介孔碳（three-dimensional mesoporous carbon，TMPC），兼具了三维微孔碳和三维大孔碳各自的结构优势，具有相对较大的比表面积和相对适中的孔径，能够为电解质溶液和目标分子的扩散提供丰富的作用位点和通道，因此基于三维介孔碳构筑的电化学传感器通常能表现出相对优异的性能。据相关研究报道表明，三维介孔碳可以通过软模板法和硬模板法制备获得^［11~13］。软模板法虽然无需使用模板刻蚀试剂，但相对苛刻的实验条件和复杂的实验体系限制了其在三维介孔碳材料制备中的广泛应用。相对于软模板法，硬模板法因其可控的模板形貌、尺寸和类型，常被应用于三维介孔碳材料的设计制备中。文献调研发现，基于三维介孔碳构筑的莱克多巴胺电化学传感器还未见报道。

本文通过简单的混合干燥-碳化-模板去除策略，构建了一种具有三维内联结构的介孔碳材料。将制备的三维介孔碳材料用于修饰玻碳电极（glassy carbon electrode， GCE），系统研究了其电化学性能，提出了一种基于三维介孔碳的莱克多巴胺电化学检测方法，并应用该方法检测猪肉样品中的莱克多巴胺。

1　 实验部分

1.1　主要试剂及仪器

试剂：淀粉、铁氰化钾（K₃［Fe（CN）₆］）、二水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）、十二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、无水乙醇均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；氧化锌纳米颗粒（ZnO，直径为30 nm），购自南京埃普瑞材料有限公司；莱克多巴胺标准品（分析纯）购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；实验用水均为去离子水。

仪器：CHI 660D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；OTF-1200X型管式炉（合肥科晶材料技术有限公司）；ZNCL-DL型4联加热搅拌器（武汉科尔仪器设备有限公司）；KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Quanta-200 microscope型场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM，FEI公司）；Tecnai G220 microscope型透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM，FEI公司）；X’Pert PRO型X射线衍射仪（X⁃ray diffraction,XRD，Panalytical公司）；LabRAM HR800型拉曼光谱仪（Raman，Horiba Jobin Yvon公司）；ASAP2020型全自动比表面及孔隙度分析仪（Micromeritics Instrument公司）。

1.2　三维介孔碳材料的合成

首先，称取5.0 g淀粉溶解于40.0 mL二次蒸馏水和20.0 mL无水乙醇的混合溶液中，随后在持续搅拌状态下，缓慢加入5.0 g ZnO纳米颗粒。待ZnO纳米颗粒均匀分散在溶有淀粉的混合液中后，将其置于80 ^oC水浴中搅拌，直至完全干燥。将干燥的氧化锌-淀粉混合物研磨为细小的粉末颗粒后，置于氮气保护的管式炉中进行高温热解，800 ^oC下保温2 h，升温速率为10 ^oC/min。当管式炉温度冷却至室温时，取出产物，并将其置于0.1 mol/L HCl中反应2 h，去除ZnO模板，最后依次采用过滤、洗涤、干燥步骤对产物进行处理，即可获得三维介孔碳材料。

1.3　三维介孔碳修饰玻碳电极的制备

称取5.0 mg的三维介孔碳，将其加入到5.0 mL DMF中，超声处理1 h，即可获得均匀分散的浓度为1 mg/mL的三维介孔碳悬浊液。随后用微量进样器移取4 μL三维介孔碳悬浊液于干净的玻碳电极表面，并将其置于红外灯下干燥，待溶剂DMF完全挥发后，即获得三维介孔碳修饰的玻碳电极（TMPC/GCE）。

1.4　电化学测试

以裸玻碳电极或三维介孔碳修饰的玻碳电极（直径为3 mm）为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极（saturated calomel electrode，SCE）为参比电极，采用循环伏安（cyclic voltammetry,CV）法和差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry， DPV）法对莱克多巴胺进行测定分析。

采用CV法研究电极的电化学活性时，电解液为含有5 mmol/L K₃［Fe（CN）₆］的1.0 mol/L KCl溶液，扫描范围-0.1~0.6 V，扫描速度根据需要设置，记录相应CV曲线。采用CV法研究莱克多巴胺的电化学行为时，电解液分别为不含莱克多巴胺和含有10.0 mol/L莱克多巴胺的0.1 mol/L，pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，扫描速度100 mV/s，扫描范围0~0.9 V，记录CV曲线。

DPV测试中，电解液为0.1 mol/L，pH 7.0 磷酸盐缓冲溶液，在0 V富集电位下富集4 min，记录0~0.8 V范围内的DPV曲线。DPV测试中的其他参数：脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，扫描速度为50 mV/s。读取DPV曲线0.535 V处的氧化峰电流值，并将其作为莱克多巴胺的电化学分析信号。

2　 结果与讨论

2.1　三维介孔碳的表征

图1A为制备的三维介孔碳XRD图，在26^o和43^o附近可以看到典型的碳材料衍生峰，分别对应于石墨化碳材料的（002）晶面和（101）晶面，除此之外，未观察到其他衍射峰，表明ZnO模板已完全去除，制备获得的三维介孔碳材料具有较高的纯度和结晶度^［14］。图1B为制备的三维介孔碳Raman光谱图，可以看到石墨化碳材料典型的D带和G带^［15］，且D带强度与G带强度的比值（I_D/I_G）为0.99，表明获得的三维介孔碳具有丰富的表面缺陷。图1C为三维介孔碳的SEM图，可以观察到大量不规则多孔网络状结构的多孔碳。利用透射电子显微镜对获得的三维介孔碳进行进一步的结构表征（图1D），可以发现获得的三维内联多孔碳具有丰富的孔结构。

为了进一步获取三维介孔碳孔结构信息，利用氮气吸/脱附曲线测试对其比表面积、孔体积和孔径分布进行分析。图2A和2B分别为三维介孔碳的氮气吸/脱附等温线和孔径分布曲线。根据氮气吸/脱附等温线，由 Brunauer-Emmett-Teller （BET）理论和Barrett-Joyner-Halenda （BJH）模型，可计算得到三维介孔碳的比表面积、孔体积和孔径分布。数据显示，获得的三维介孔碳BET比表面积为535 m²/g，孔体积为0.966 cm³/g，孔径集中在30 nm左右，与模板ZnO颗粒尺寸接近。由此可见，获得的三维介孔碳具有大的比表面积和丰富的介孔结构，丰富的介孔结构主要来源于ZnO的模板效应。

以电化学可逆的铁氰化钾（K₃［Fe（CN）₆］）为探针分子，对制备的三维介孔碳修饰电极的电化学活性进行了表征。图3A为裸玻碳电极（Bare GCE）和三维介孔碳修饰的玻碳电极（TMPC/GCE）在含有5 mmol/L K₃［Fe（CN）₆］的1.0 mol/L KCl溶液中的循环伏安（CV）图，扫描速度为100 mV/s。从图3A可以看到， K₃［Fe（CN）₆］可逆的氧化还原电对在TMPC/GCE表面显示出更小的峰电位差和更大的氧化/还原峰电流。由Nicholson理论^［4，16］可知，氧化还原峰电位差越小，异相电子转移速率常数越高，表明三维介孔碳的引入可以显著提高探针分子在玻碳电极表面的电子转移速率。不仅如此，在TMPC/GCE表面，K₃［Fe（CN）₆］探针分子有较大的氧化还原峰电流也说明修饰后的电极具有更高的电化学活性。

图3B所示为Bare GCE和TMPC/GCE在含5 mmol/L K₃［Fe（CN）₆］ 的KCl（1.0 mol/L）溶液中不同扫描速度下还原峰电流I_pc与扫描速度的开方v^1/2的关系。Randles-Sevčik方程^［17］

I_pc=-（2.69×10⁵）n^3/2AD^1/2cv^1/2

其中，n为电子转移数，D为K₃［Fe（CN）₆］的扩散系数，c（mol/cm³）为K₃［Fe（CN）₆］的浓度，A（cm³）为电化学活性面积。

根据Randles-Sevčik方程，结合图3B，通过计算得到Bare GCE和TMPC/GCE的电化学活性面积分别为0.055 2 cm²和0.078 1 cm²。相比于Bare GCE，TMPC/GCE具有更大的电化学活性面积。

2.2　三维介孔碳对莱克多巴胺的电化学增敏效应

为了研究三维介孔碳对莱克多巴胺的电化学增敏效应，比较了莱克多巴胺在Bare GCE和TMPC/GCE表面的电化学行为。图4A为Bare GCE和TMPC/GCE分别在空白溶液（0.1 mol/L，pH 7.0磷酸盐缓冲溶液）和含有10.0 μmol/L莱克多巴胺的0.1 mol/L，pH 7.0磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图，扫描速度为100 mV/s，扫描范围为0 ~ 0.9 V，扫描方向如图4A中箭头所示。从图4A可以看出，空白溶液中，在Bare GCE和TMPC/GCE表面均未观察到任何氧化峰，而在含10.0 μmol/L莱克多巴胺溶液中，Bare GCE和TMPC/GCE的CV曲线上都只有一个氧化峰，说明氧化峰均是莱克多巴胺产生的，且莱克多巴胺在电极表面为不可逆的氧化反应，三维介孔碳能显著增强莱克多巴胺的电化学氧化信号，提高检测灵敏度。

为了验证三维介孔碳在莱克多巴胺痕量分析中的应用潜力，采用DPV方法研究了低浓度莱克多巴胺（1.0 μmol/L）在不同电极表面的氧化行为（图4B）。从图4B可以看到，在空白溶液中，Bare GCE和TMPC/GCE的DPV曲线上均未观察到任何氧化峰；在莱克多巴胺溶液中，TMPC/GCE的DPV曲线上有一个很明显的氧化峰，峰电位为0.535 V，峰电流为10.24 μA，而在Bare GCE的DPV曲线上氧化峰电流较小，峰电位为0.580 V，峰电流为0.181 7 μA，说明氧化峰是由莱克多巴胺产生的，且TMPC/GCE表面的电化学氧化信号是Bare GCE表面信号的56.4倍。很显然，三维介孔碳对莱克多巴胺的电化学氧化表现出了显著的信号增强效应，能显著提高检测灵敏度，可用于对莱克多巴胺的电化学检测。

2.3　三维介孔碳对莱克多巴胺的电化学吸附行为

为了进一步探究TMPC/GCE高电化学活性的根源，采用单电位阶跃计时库仑法研究Bare GCE和TMPC/GCE对莱克多巴胺的电化学吸附行为。测定条件：电位阶跃范围为0.1~0.8 V，脉冲宽度为0.25 s，富集时间为4 min。图5A和5B分别为Bare GCE和TMPC/GCE在空白溶液和含有1.0 μmol/L莱克多巴胺的磷酸盐缓冲溶液中的Q-t^1/2曲线图。其中，Q代表电量（μC），t为时间（s）。在单电位阶跃Q-t^1/2曲线中，拟合的线性曲线截距值为Q_dl +Q_ads的总值，Q_dl为双电层电容电量，Q_ads为活性物质吸附电量。因此，分别在空白溶液和含有莱克多巴胺的溶液中测定得到Q-t^1/2曲线，可以分别获得Q_dl值和Q_dl +Q_ads的总值，通过截距差可计算得到不同电极材料对莱克多巴胺的电化学吸附量。计算可知，Bare GCE和TMPC/GCE在含有1.0 μmol/L莱克多巴胺溶液中的Q_ads值分别为0.325 μC和1.694 μC，表明三维介孔碳对莱克多巴胺具有很强的吸附能力，能显著增强莱克多巴胺的电化学氧化信号。

2.4　TMPC/GCE的传感性能

2.4.1　线性检测范围及检出限

为了评估TMPC测定莱克多巴胺的能力，在最优条件（即1.4节所述条件）下利用TMPC/GCE测定莱克多巴胺的线性检测范围和检出限。利用TMPC/GCE对含不同浓度莱克多巴胺的0.1 mol/L,pH 7.0磷酸盐缓冲溶液进行DPV检测，记录相应的DPV曲线和氧化峰电流值，结果如图6所示。

由图6可知，随着莱克多巴胺浓度c的增加，其氧化峰电流I_pa逐步增加，且浓度随电流的变化呈现良好的线性关系，线性检测范围为25~2 000 nmol/L，线性方程为I_pa（μA）=0.010 41 c（nmol/L），检出限为4.39 nmol/L（S/N=3）。将TMPC/GCE的性能与已报道的类似传感器相比较^{［16，18~21］}（见表1）可知，以TMPC为电极修饰材料制备的传感器，对莱克多巴胺的检测具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。

2.4.2　重现性和重复使用性

为了评估TMPC/GCE的重现性，将制备的11支TMPC/GCE分别在含有1 000 nmol/L莱克多巴胺的0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行DPV测试，记录11次DPV测试中莱克多巴胺氧化峰电流值，计算11支TMPC/GCE氧化峰电流的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），以衡量TMPC/GCE的重现性。通过计算可知，RSD为3.96%，表明TMPC/GCE具有良好的重现性和测量精度。

为了考察TMPC/GCE的重复使用性，将单支TMPC/GCE在含有1 000 nmol/L莱克多巴胺的0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲溶液中进行DPV扫描，连续检测11次，11次氧化峰电流值RSD为4.97%，表明TMPC/GCE具有良好的重复使用性。

2.4.3　抗干扰性能

为评估TMPC/GCE的抗干扰能力，研究了潜在干扰物对莱克多巴胺测定的影响。在最优条件下，以500 nmol/L莱克多巴胺为目标分析物，分别单独加入一定浓度的干扰物，然后记录TMPC/GCE上莱克多巴胺的氧化峰电流。结果表明，10 000倍Cu²⁺、K⁺、Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、蔗糖、D-果糖、葡萄糖，100倍甘氨酸、精氨酸、腺嘌呤、抗坏血酸、对乙酰氨基酚，10倍肾上腺素、谷氨酸均不干扰莱克多巴胺的测定结果（氧化峰电流值变化小于5%）。

2.5　实际样品测定

为了评估构建的TMPC/GCE在实际样品检测中的应用潜力，以市场购买的不同猪肉样品A、B、C为检测对象，对莱克多巴胺含量进行定量检测。

实验开始前需对猪肉样品中的莱克多巴胺进行提取，提取步骤如下^［22］：首先，称取5.0 g搅碎的猪肉样品，加入到10 mL 0.1 mol/L HClO₄溶液中，超声20 min后转移至80 ℃水浴中加热处理30 min。随后，将猪肉样品在10 000 r/min转速下离心5 min，收集上层清液。然后，用10%的Na₂CO₃水溶液将提取的上层清液pH调至10，并加入10 mL乙酸乙酯。最后，向上述溶液中加入2.0 mL 0.1 mol/L的HCl溶液进行反相萃取，重复两次，将所得的萃取液用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释至10.0 mL，在最优条件下进行DPV检测。

由于未在实际猪肉样品中检测到莱克多巴胺，因此采用标准加入法评估本文提出的电化学检测方法的准确性。加标样品均在样品处理前加入一定量的标准品，提取步骤与上述步骤相同，加标量见表2，每个样品平行测定3次，测试结果如表2所示。由表2可知，每份样品3次电化学测定结果的相对标准偏差均低于5%，且加标回收率在92.7%~106.2%范围内，表明测定结果精密度和准确度较高，说明本文提出的基于三维介孔碳的莱克多巴胺电化学检测方法具有较高的可靠性和良好的应用前景。

3　 结 语

以ZnO纳米颗粒为硬模板，淀粉为碳源，采用简单的混合干燥-碳化-模板去除策略，构建了一种具有三维内联结构的介孔碳材料，制备的三维介孔碳具有大的比表面积，将其作为修饰材料能有效提高玻碳电极的电化学活性面积及电子转移速率。受益于三维介孔碳固有的结构优势，其对瘦肉精分子莱克多巴胺的催化氧化表现出高的电化学活性。基于三维介孔碳的莱克多巴胺电化学检测方法具有较高的检测灵敏度及抗干扰能力，在实际猪肉样品的检测中展现了一定的应用前景。考虑到模板及碳源种类的多样性，本文方法可以为其他碳材料及其复合物的结构设计提供一定参考，并且在食品安全分析领域具有一定的实际应用价值。

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基金资助

湖北省教育厅科学技术研究计划青年人才项目(Q20201704)