基于铜纳米簇的谷胱甘肽非标记检测

Label-Free Detection of Glutathione Based on Copper Nanoclusters

摘要

以抗坏血酸为还原剂、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为模板分子，合成了PVP稳定的铜纳米簇（PVP-Cu NCs）。利用谷胱甘肽（GSH）对PVP-Cu NCs荧光信号的增强作用，建立了非标记检测GSH的新方法。该方法对GSH检测的线性范围为30~800 μmol/L，检出限为1.2 μmol/L，具有较好的选择性。PVP-Cu NCs与GSH的作用机理为配体交换，GSH与Cu原子配位形成了更稳定的Cu—S键。该方法应用于药片中GSH的测定，取得了满意的结果。

Abstract

Polyvinylpyrrolidone stabilized copper nanoclusters (PVP-Cu NCs) were synthesized with ascorbic acid as reductant and PVP as template. It was found that the fluorescence signal of PVP-Cu NCs was significantly enhanced by glutathione (GSH). Thus, a sensitive and label-free detection strategy for GSH was established with fluorescence “turn-on”. The detection limit was determined to be 1.2 μmol/L with a linear range from 30 to 800 μmol/L. The fluorescence enhancement of PVP-Cu NCs was originated from a ligand exchange process, followed by the formation of Cu—S bond between GSH and Cu atoms. The constructed detection method showed good selectivity towards GSH. Finally, GSH in reduced glutathione tablets was determined to examine the feasibility of the method in real samples and satisfactory results were achieved.

Graphical abstract

关键词

金属纳米簇 / 聚乙烯吡咯烷酮 / 谷胱甘肽 / 配体交换

Key words

metal nanoclusters / polyvinylpyrrolidone / glutathione / ligand exchange

0　 引 言

金属纳米簇（metal nanoclusters， M NCs）由几个到几十个金属原子构成，大小介于单个金属原子和较大的金属纳米颗粒之间^［1］。由于具有特殊的小尺寸效应，M NCs的能级谱带不连续，形成分立的离散能级，具有与金属纳米颗粒截然不同的荧光性质，如较好的光稳定性、较高的荧光量子产率、可调的荧光发射等^［1］。铜纳米簇（Cu NCs）不但具有与金纳米簇和银纳米簇相似的荧光性能，而且廉价易得、制备简便。这些特点使得Cu NCs的合成与应用研究成为生化分析领域的热点^［2］。Cu NCs已被应用于离子^［3，4］、pH^［5］、小分子^［6~8］、蛋白酶^［9］等的检测和生物成像^［3，8］等领域。在已经报道的基于Cu NCs的检测方法中，大多数是“turn-off”模式，即通过Cu NCs荧光的猝灭进行待测物质的测定，如Bhamore等^［3］利用Hg²⁺对姜黄素（CRE）修饰的Cu NCs的诱导团聚作用构建了Hg²⁺荧光探针，Huang等^［4］基于Fe³⁺对谷胱甘肽（glutathione，GSH）修饰的Cu NCs表面电子的吸引实现了对Fe³⁺的检测。相对于“turn-off”模式、“turn-on”模式通过Cu NCs荧光的增强实现对待测物质的检测，能够降低环境因素的干扰，提高检测的灵敏度。

GSH是一种重要的抗氧化剂，具有抗氧化、清除自由基以及调控细胞内重要生理生化过程的作用^［10］。研发灵敏度高、选择性好且简便的GSH检测方法具有重要的意义。

本文以抗坏血酸为还原剂，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为模板分子，合成了PVP稳定的Cu NCs，并将其作为非标记的“turn-on”型荧光探针用于 GSH 的检测，揭示了PVP-Cu NCs和GSH之间可能的作用机理。

1　 实验部分

1.1　材料及仪器

材料：聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP）、CuSO₄∙5H₂O、L-抗坏血酸、谷氨酸（glutamic acid， Glu）、脯氨酸（proline， Pro）、CaCl₂∙2H₂O、ZnSO₄∙7H₂O均购自国药集团；还原型谷胱甘肽（GSH）、L-半胱氨酸（L-cysteine， Cys）、DL-高半胱氨酸（DL-homocysteine， Hcy）、NaCl、KCl、MgCl₂∙6H₂O、NaH₂PO₄∙2H₂O、Na₂HPO₄∙12H₂O均购自Sigma-Aldrich公司；无水葡萄糖购自阿拉丁公司；还原型谷胱甘肽药片购自重庆药友制药有限责任公司；实验用水为超纯水。

仪器：UV-2450型紫外-可见分光光度计（Shimadzu公司）；RF-5301 PC型荧光分光光度计（Shimadzu公司）；FLS 920型稳态/瞬态荧光光谱仪（Edinburgh公司）；Centrifuge 5418型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；JEM-2100F型高分辨透射电子显微镜（HRTEM，JEOL公司）；pHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）；ContrAA 700型原子吸收光谱仪（Analytik Jena公司）等。

1.2　实验方法

1.2.1　PVP-Cu NCs的合成及纯化

PVP-Cu NCs的合成方法参照文献［11］：在10 mL水中加入0.50 g PVP，超声振荡10 min使其溶解。用1.0 mol/L NaOH溶液调节溶液pH值至6.0，向其中分别加入0.10 mol/L CuSO₄溶液100 μL和0.10 mol/L抗坏血酸溶液1 000 μL。混合液避光反应6 d，然后用截留相对分子质量14 000的透析袋透析48 h，之后置于冰箱4 ℃保存备用。PVP-Cu NCs的浓度以其中Cu元素的浓度表示。

1.2.2　GSH的检测

在pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液（20 mmol/L）中，固定PVP-Cu NCs的浓度为19 μmol/L，向PVP-Cu NCs溶液中加入不同浓度的GSH（0~3 200 μmol/L），将混合物在室温下振荡反应12 h后，以370 nm为激发波长测量PVP-Cu NCs的荧光发射光谱。

1.2.3　选择性实验

检验了不同类型的干扰物质对PVP-Cu NCs荧光强度的影响。其中，金属离子干扰物（K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺）的浓度为2 mmol/L，氨基酸等其他干扰物质（Pro、Cys、Glu、Hcy、维生素C、无水葡萄糖）的浓度为800 μmol/L。将各干扰物质和GSH 分别与PVP-Cu NCs混匀并在室温下振荡反应12 h后，以370 nm为激发波长测定PVP-Cu NCs的荧光强度。

1.2.4　药片中GSH的检测

还原型谷胱甘肽药片的处理步骤如下：取5片药片称重并研磨至细粉，计算药片的平均质量并将一定量的药粉加入到8 mL水中，超声10 min使药粉溶解，然后置于离心机中在12 000 r/min下离心10 min，分离后，取上清液稀释后备用。

向PVP-Cu NCs溶液中加入稀释60倍的GSH药片溶液，室温下振荡反应12 h后，以370 nm为激发波长测定PVP-Cu NCs的荧光强度。加标回收实验中，向PVP-Cu NCs溶液中同时加入稀释60倍的GSH药片溶液和不同浓度的GSH标准溶液（100.0、200.0、300.0 μmol/L），室温下振荡反应12 h后，以370 nm为激发波长测定PVP-Cu NCs的荧光强度。

2　 结果与讨论

2.1　PVP-Cu NCs的表征

聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是合成金属纳米材料常用的稳定剂。PVP的每个单体中都含有一个酰胺基，能够通过氮原子上的孤对电子与Cu²⁺的空轨道进行相互作用而键合Cu²⁺，从而将还原得到的Cu原子固定在其骨架上，避免Cu NCs的团聚^［11］。图1A为所制备的PVP-Cu NCs的HRTEM图。从图中可以看出，PVP-Cu NCs近似球形，分散性良好而且粒径较均一。PVP-Cu NCs的平均粒径约为（3.2±0.6） nm，与文献报道的结果一致^［11］。

图1B为PVP-Cu NCs的紫外-可见吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱。如图1B曲线a所示，PVP-Cu NCs的紫外-可见吸收光谱在300~600 nm之间出现了两个微弱吸收峰，分别位于383 nm和443 nm。这两个吸收峰的产生可归因于PVP-Cu NCs能级间的电子跃迁^［11］。图1B曲线a在560 nm 到600 nm之间未观察到Cu NPs的表面等离子体共振吸收峰，说明成功地合成了Cu NCs，而且其中不存在粒径较大的Cu NPs^［12］。PVP-Cu NCs溶液在日光下呈淡黄色，但在365 nm的紫外光照射下却可以发出明亮的蓝色荧光，表明PVP-Cu NCs具有较好的发光性能。PVP-Cu NCs的最大激发波长位于373 nm（图1B曲线b）。在该波长的光的激发下，PVP-Cu NCs的发射波长位于427 nm左右（图1B曲线c）。从图1C可以看出，当激发波长从350 nm增大到390 nm，PVP-Cu NCs的荧光发射峰逐渐发生蓝移，荧光强度呈现先增大后减小的趋势，说明PVP-Cu NCs的荧光发射具有激发依赖性。PVP-Cu NCs的最佳激发波长约为370 nm（图1C），与图1B的b曲线结论一致。合成的PVP-Cu NCs具有良好的化学稳定性和光稳定性。Wang等^［11］发现PVP-Cu NCs在4 ℃下可稳定存在1个月以上。Rajamanikandan等^［13］用紫外光持续照射PVP-Cu NCs 120 min后，其荧光强度没有明显降低。

2.2　GSH的检测

为了提高GSH检测的灵敏度，优化了GSH和PVP-Cu NCs反应的pH及时间。研究发现，当pH为5.0，反应时间为12 h时，PVP-Cu NCs荧光强度增强的效率（（I-I₀）/I₀，I₀和I分别代表加入GSH之前和加入GSH之后PVP-Cu NCs的荧光强度）达到最大。在后续实验中，pH固定为5.0，反应时间固定为12 h。

在最佳反应条件下，研究了PVP-Cu NCs作为非标记荧光探针与GSH之间的相互作用。从图2A可以看出，随着GSH浓度的增大，PVP-Cu NCs的荧光强度逐渐增强，但其荧光发射峰的位置不变。图2B显示了PVP-Cu NCs荧光强度增强的效率与GSH浓度之间的关系：当GSH浓度较低时，PVP-Cu NCs荧光强度的增强不明显，原因可能是较高浓度的PVP阻止了GSH与Cu NCs的有效结合，从而抑制了GSH和PVP交换的效率；当GSH浓度在30~800 μmol/L范围内，PVP-Cu NCs的荧光强度明显增强，且PVP-Cu NCs荧光强度增强的效率（（I-I₀）/I₀）和GSH浓度的对数（lgc_GSH）之间呈现良好的线性关系，线性方程为y=0.77x-1.04（R² = 0.997 6）；当GSH浓度增大到800 μmol/L时，PVP-Cu NCs荧光强度增强的效率达到最大，之后，（I-I₀）/I₀不再明显增大，说明此时PVP-Cu NCs表面结合的GSH的量已经达到饱和^［14］。根据拟合所得的线性方程，该方法的检出限（LOD）为1.2 μmol/L（3σ/s法），表明该方法能够用于GSH的非标记检测并且具有较高的灵敏度。

2.3　PVP-Cu NCs和GSH的相互作用机理

为了揭示GSH引起PVP-Cu NCs荧光增强的机理，分别测定了PVP-Cu NCs与GSH反应前后的荧光寿命。通过对图3中PVP-Cu NCs加入GSH前和加入GSH后的荧光衰减曲线进行拟合，计算得到加入GSH前，PVP-Cu NCs的荧光寿命为3.10±0.07 ns；加入GSH后，PVP-Cu NCs的荧光寿命增大到3.60±0.07 ns。金属纳米簇的荧光主要来源于金属内核以及金属内核与表面配体间的相互作用^［15］。在PVP-Cu NCs中加入GSH后，由于巯基（—SH）和Cu原子之间的结合能力比较强^{［14，16］}，GSH与Cu原子之间形成了Cu—S键，从而结合到Cu NCs的表面。GSH中含有较多的富电子基，如羧基（—COOH）和氨基（—NH₂），Cu—S键的形成使得GSH作为电子供体实现了与金属内核（Cu NCs）之间的电荷转移（LMNCT），导致Cu NCs的荧光增强^［14］。配体和金属内核之间的电荷转移会影响金属纳米簇的激发态弛豫动力学（如辐射跃迁和非辐射跃迁的速率），从而影响金属纳米簇的荧光寿命^［15］。Zhang等^［14］研究发现，组氨酸修饰的金纳米簇与GSH之间的配体交换会导致金纳米簇的荧光寿命增加。因此，PVP-Cu NCs荧光寿命的增加说明GSH和PVP之间发生了配体交换，产生了GSH-Cu NCs^{［14，15］}。

2.4　方法的选择性

为了研究PVP-Cu NCs对GSH检测的特异性，检验了金属离子、氨基酸、葡萄糖、维生素C等干扰物质对PVP-Cu NCs荧光强度的影响。如图4所示，金属离子、葡萄糖和Pro对PVP-Cu NCs的荧光均没有产生增强效果；Cys、Hcy、维生素C和Glu可以增强PVP-Cu NCs的荧光，但其效果均不如GSH显著。原因可能是GSH中既含有巯基又含有较多的富电子基，如羧基（—COOH）和氨基（—NH₂），导致其和Cu原子的结合能力较强。此外，GSH具有较大的分子结构，能够形成较大的空间位阻效应，从而提高与Cu NCs配位的稳定性^［14］。值得注意的是，尽管Cys、Hcy、Glu和维生素C均会导致PVP-Cu NCs的荧光强度增强，但上述干扰物质在人体中的含量相对于GSH低很多^［17］。上述结果表明PVP-Cu NCs对GSH具有较好的选择性并有望应用于实际样品中GSH含量的测定。

2.5　药片中GSH的检测

将该方法用于实际样品中GSH含量的检测，测得还原型谷胱甘肽药片中GSH的平均含量为标示量的93.3%。此外，还测定了药片溶液中GSH的加标回收率和方法的RSD（相对标准偏差）。表1中显示，GSH的回收率在91.9%~99.2%之间，表明PVP-Cu NCs探针可以应用于实际样品中GSH的定量检测。

3　 结 语

本研究以PVP为模板分子、抗坏血酸为还原剂，合成了PVP-Cu NCs。基于配体交换原理，利用GSH对PVP-Cu NCs荧光的增强作用，建立了“turn-on”型非标记检测GSH的新方法。该方法具有灵敏度高、选择性好、简单方便的优点，用于药片中GSH的测定，取得了满意的效果，未来可望用于细胞中GSH的检测。

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基金资助

国家自然科学基金(31772785)

国家自然科学基金(21205043)