基于CdS光电活性材料的无标记凝血酶生物传感器的制备及其性能

An Unlabeled Thrombin Biosensor Fabricated Based on CdS Photoelectrically Active Material and Its Performance

摘要

基于凝血酶（thrombin，TB）对纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）分子中特异性位点的剪切作用，采用光寻址电化学策略，构建了基于CdS光电活性材料的无标记凝血酶生物传感器，实现对凝血酶无标记、简便、快速的检测。通过扫描电子显微镜（SEM）、紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、X射线衍射（XRD）及X射线光电子能谱（XPS）对光电活性材料CdS进行分析，并利用循环伏安法（CV）对生物传感器的性能进行表征。结果表明，在最优实验条件下，本文构建的传感器对凝血酶的检出限为6 fmol/L（S/N=3），在0.01~100 pmol/L范围内具有良好的线性关系，为凝血酶的检测提供了一种简便有效的方法。

Abstract

Based on the cleavage of fibrinogen (FIB) specific site by thrombin (TB),a photo-addressable electrochemical strategy was used to construct an unlabeled TB biosensor based on CdS photoelectrically active material to achieve the unlabeled, simple and fast detection. The photoelectrically active material CdS was analyzed by scanning electron microscopy (SEM), UV-visible absorption (UV-Vis), X-ray diffraction (XRD) and X-ray photoelectron spectrometer (XPS), and the performance of the biosensor was characterized by cyclic voltammetry (CV). The results show that under the optimal experimental conditions, the detection limit of the sensor constructed in this paper for TB is 6 fmol/L (S/N=3), and it has a good linear relationship in the range of 0.01-100 pmol/L, which provides a simple and effective method for TB detection.

Graphical abstract

关键词

光电活性材料 / 凝血酶 / 无标记 / 传感器

Key words

photoelectrically active material / thrombin (TB) / unlabeled / sensor

0　 引 言

凝血酶（thrombin，TB）是一种普遍存在于哺乳动物体内的蛋白质，对诸多心血管疾病诊断起着非常重要的作用^［1，2］。血液中的TB在pmol/L浓度范围内与肿瘤生长、转移的诊断有关。因此，研发针对TB的高特异性和低检出限的分析方法，对于临床诊断和疾病防治具有重要意义。

基于TB与适配体之间特异性的相互识别作用，国内外学者构建了诸多关于TB的适配体生物传感器。Xiao等^［3］通过化学修饰将亚甲基蓝标记到适配体上，并组装到Au电极表面，利用与目标物TB结合前后电信号标记物亚甲基蓝与电极表面距离会发生变化，对电极表面电子传输产生影响这一特性，根据电流信号的变化，实现对TB的检测；Centi等^［4］在磁珠上修饰第Ⅰ适配体作为捕获链，对目标物TB识别后，再对标记酶的第Ⅱ适配体进行识别，构建第Ⅰ适配体/TB/第Ⅱ适配体的夹心结构，通过酶催化底物产生的信号，实现对TB的特异性检测。Zhang等^［5］在电极上构建与文献［4］类似的夹心结构，在第Ⅱ适配体上标记PbS纳米颗粒，采用电化学溶出伏安法检测Pb²⁺信号，实现对TB的高灵敏检测。该类传感器具有较好的选择性和较低的检出限，但需要对适配体进行复杂的化学修饰，并且无法直接获取TB生物活性方面的信息。

基于TB对纤维蛋白原（fibrinogen， FIB）的剪切作用，可构建与TB有关的定性与定量分析方法^{［1，6，7］}，此类方法具有高选择性、高稳定性、高灵敏性等特点，而且不需要对标志物进行复杂的标记^［8］。由于TB剪切FIB上的两条肽链的选择性相互作用是人体生理凝血过程的一部分，此类方法还可以探究TB的生物活性^［1，2］。因此，基于TB对FIB的剪切作用构建生物传感器，不需要复杂的标记就可检测TB的浓度和活性。Wang等^［8］基于TB对FIB上肽链进行特异性位点的剪切作用，通过化学修饰将FIB键合在多通道氧化铟锡（indium tin oxid，ITO）电极上，不但能实现对TB的定量检测，同时还能评估TB的生物活性。但目前，基于TB对FIB的剪切作用构建生物传感器的报道还比较少。

光电活性材料是指能进行光电转化的材料，是光电传感器的核心组成部分。无机半导体光电活性材料因制备简单、形貌丰富、生物相容性较好等特性，广泛应用于生物传感器的构建^［9，10］。基于此，本文构建了一种基于CdS光电活性材料的无标记凝血酶生物传感器（图1）。本研究在ITO电极表面制备CdS光电薄膜，通过壳聚糖（chitosan，CTS）将CdS固定在ITO电极表面，与FIB化学键合后，采用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭电极上的活性位点，通过TB对FIB的特异性剪切作用，引起CdS光电流变化，实现对TB的高灵敏检测。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：TB、FIB和BSA均购自上海生工生物科技有限公司；硫化钠（Na₂S·9H₂O）、抗坏血酸（AA）、氯化镉 （CdCl₂·2.5H₂O）、CTS均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ITO导电玻璃购自深圳市腾恩玻璃制品有限公司。所有化学试剂均为分析纯，实验室用水均为超纯水。

仪器：Merlin Compact型扫描电子显微镜 （SEM，Zeiss公司）；D/Max 2500pc型X射线衍射仪（XRD，Rigaku公司）；ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱仪（XPS，Thermo Scientific公司）；UV-2550型紫外-可见分光光度计（UV-Vis，Shimadzu公司）；CHI 660E型电化学工作站 （上海辰华仪器公司）。

1.2　基于CdS光电活性材料的无标记凝血酶生物传感器的制备

1.2.1　CdS光电活性材料的制备

按照文献［11，12］方法，取1 mL 0.05 mol/L Na₂S，加入3 mL 0.05 mol/L CdCl₂溶液中，超声振荡5 min后，即得到含有光电活性材料CdS的混合液。

1.2.2　CdS/ITO修饰电极的制备

采用打孔胶带将ITO分为8个区域（如图1），每个分区上分别滴凃3 μL含有光电活性材料CdS的混合液。滴涂完毕后，放入60 °C烘箱烘干。上述步骤循环3次后，放入马弗炉200 °C，恒温2 h，冷却至室温后，得到CdS/ITO修饰电极。

1.2.3　FIB/CTS/CdS/ITO修饰电极的制备

取3 μL CTS（质量分数为1%）分别滴涂到制备的CdS/ITO修饰电极的每个分区中，自然风干。用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗未结合牢固的CTS，室温干燥后，每个分区分别滴涂3 μL的戊二醛，20 min后，分别滴加5 μL 0.1 mg/mL FIB溶液（FIB溶解于0.1 mol/L PBS），放入冰箱中4 °C反应16 h，0.1 mol/L PBS冲洗3次，得到FIB/CTS/CdS/ITO修饰电极，放入冰箱中4 °C保存。

1.3　电化学检测

在FIB/CTS/CdS/ITO修饰电极上滴加BSA（质量分数为1%），室温孵育1 h，封闭电极上未反应的活性位点。FIB/CTS/CdS/ITO电极的其中一个区域不加目标物TB，用于对其他区域进行校正；其他7个区域分别滴加5 μL不同浓度的目标物TB（TB溶解于含有25 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl₂、1 mmol/L CaCl₂ 的pH 7.4溶液中），于水浴锅中37 °C恒温孵化2 h。

光电流在电化学工作站上进行采集。三电极体系以FIB/CTS/CdS/ITO为工作电极、铂丝与饱和甘汞分别作为对电极和参比电极。将工作电极浸入含有0.1 mol/L AA的10 mL 0.1 mol/L PBS溶液中，绿色激光笔（λ=520 nm）为激发光源，通过稳压器将其功率调整为50 mW，用其依次照射电极每个区域。在开路电位下，收集ITO电极每个区域前30 s的光电流信号。

2　 结果与讨论

2.1　材料表征

2.1.1　SEM分析

采用SEM技术观察CdS、CTS/CdS、FIB/CTS/CdS及与TB作用后的FIB/CTS/CdS/ITO（记为FIB/CTS/CdS/ITO+TB）修饰层的微观形貌，结果分别如图2A~2D所示。从图2中可以看出，CdS材料的涂层分布均一，膜面较为平整（图2A）；滴加CTS后，涂层的表面变得较为模糊（图2B），说明CTS已均匀附着在CdS表面；在CTS/CdS表面添加FIB与戊二醛后，涂层表面有大分子生物蛋白FIB的堆积物（图2C）；经过TB对FIB的剪切，堆积物明显减少（图2D）。以上结果可为构建检测TB的阻抗型生物传感器提供依据。

2.1.2　UV-Vis分析

利用紫外-可见分光光度计对CdS材料进行表征，结果如图3所示。由图3可知，该材料在波长200~350 nm区域有强吸收，随后吸光强度开始下降，但在510 nm处仍有较强吸收，说明绿色激光（λ=520 nm）可以激发所制备的CdS光电活性材料。

2.1.3　XRD和XPS谱图分析

采用XRD技术对CdS光电活性材料的晶体结构进行表征，结果如图4所示。由图4可知，本文所制备的材料在26.5°、43.7°及51.9°处出现了较强衍射峰，分别对应CdS的（111）、（220）、（112）晶面^［13］，这表明成功合成CdS光电活性材料。

进一步利用XPS分析CdS光电活性材料的化学成分，结果如图5所示。由图5可知，位于160.2 eV和161.3 eV的特征峰归属于S 2p，位于403.8 eV和410. 4 eV的特征峰归属于Cd 3d^［13］，表明电极上沉积物的主要成分是Cd和S。

2.2　不同修饰电极的电化学性能

为了考察本文制备的电极不同分区之间的性能差异，对不同区域的光电转化效率进行测试，结果如图6。图6中1~8对应图1中ITO电极上的8个分区。由图6可知，电极上每个分区的光电信号稳定且有着相近的光电流强度，表明每个分区都可以作为一个单独电极进行光电检测。

以2.0 mmol/L ［Fe（CN）₆］^3-/4-溶液作为介质，采用循环伏安法对裸ITO、CdS/ITO、CTS/CdS/ITO、FIB/CTS/CdS/ITO以及FIB/CTS/CdS/ITO+TB的性能进行测试，结果如图7A所示。虽然在ITO上滴涂一层CdS光电活性材料后，CdS/ITO修饰电极的电阻有所增大，但其仍然具有较好的导电性，这说明ITO上CdS膜层相对较薄，对电子传递的影响较小。交联CTS后，修饰电极CTS/CdS/ITO的电阻变化较小，归因于CTS层比较薄，保证了交联的可靠性且减少了对后续光电测试的影响。将CTS/CdS/ITO电极与FIB交联，修饰电极FIB/CTS/CdS/ITO的电流强度大幅度下降，这是由于FIB分子结构比较大，故其对电子的阻抗较大，说明FIB成功交联到电极上。将目标物TB在FIB/CTS/CdS/ITO上进行孵育后，电极电流信号明显增加，表明TB对FIB进行了剪切，使得FIB上部分肽链脱离电极，进而导致电极上的电子阻抗降低。

图7B为基于CdS光电活性材料的无标记凝血酶生物传感器构建过程中光电流记录曲线。ITO电极上修饰CdS后，光电流信号增至2.32 μA，修饰FIB/CTS后，光电流强度下降到0.38 μA，这归因于FIB结构较大，覆盖了部分CdS电活性材料，进而影响其光电转化效率，这也证实CdS/ITO电极上成功修饰了FIB。通过与0.1 pmol/L TB孵化2 h后，FIB/CTS/CdS/ITO+TB的光电流增加到1.04 μA，说明TB对FIB具有较好的活性，通过剪切作用使得FIB从电极上脱落。

2.3　孵化时间对TB剪切作用的影响

由于TB对FIB特异性位点的剪切作用与孵化时间有关，通过分析光电流强度随时间的变化来探究孵化时间对TB剪切作用的影响。将修饰电极FIB/CTS/CdS/ITO与10 nmol/L TB进行孵化，不同孵化时间（0、10、30 min，1、2、4、8 h）下的光电流响应曲线，光电流峰值随孵化时间的变化曲线分别如图8A和8B所示。由图8A可知，随着FIB/CTS/CdS/ITO与TB孵化时间的增加，光电流变大，结合图8B可知，孵化时间达到2 h后，光电流峰值（I_p）的变化趋于平缓。由此，将TB对FIB/CTS/CdS/ITO上FIB的特异性位点剪切反应时间确定为2 h。

2.4　修饰电极的稳定性

在最优实验条件下，对FIB/CTS/CdS/ITO修饰电极信号的稳定性进行了考察。首先将FIB/CTS/CdS/ITO电极与5 μL 1 pmol/L TB孵化2 h，连续扫描，同一个区域连续收集10次光电流信号，其相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）为4.57%。对ITO不同区域进行FIB/CTS/CdS修饰，再分别与5 μL 1 pmol/L TB进行作用，依次采集8个区域的光电流信号（图9），8个光电流峰值的RSD为5.62%。这表明FIB/CTS/CdS/ITO修饰电极具有较好的稳定性，不同区域之间的差异较小，可以满足多目标寻址检测的要求。

2.5　本文传感器的应用

图10A和10B为在最优实验条件下，应用本文构建的传感器分别检测浓度为0、0.01、0.05、0.1、1、10、100 pmol/L TB所得光电流响应与校准曲线。由图10A可知，光电流信号随着TB浓度的增加而增加，说明TB对FIB进行了有效的剪切，使得FIB/CTS/CdS/ITO电极表面的光电转换效率增加。检测得到的目标光电流与背景光电流之差ΔI与目标物TB浓度的对数lgc_TB在0.01~ 100 pmol/L范围内具有良好的线性关系（R²=0.993）（图10B），检出限为6 fmol/L（S/N=3）。

3　 结 语

凝血酶对纤维蛋白特异性位点的剪切作用会导致电极的阻抗值发生变化，基于此，本文通过简易的方法制备了FIB/CTS/CdS/ITO修饰电极，采用无标记策略实现对目标物凝血酶的寻址电化学检测。该检测方法具有检测范围宽、检出限低的特点，可望用于凝血酶的生物活性诊断和定性分析检测。

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基金资助

湖北省自然科学基金青年项目(2018CFB247)

湖北民族大学高水平科研成果校内培育项目(PY20011)

湖北民族大学研究生教育创新项目(MYK2020015)

湖北省“双一流”建设专项

湖北民族大学博士启动基金项目(MY2015B019)