黏度和ONOO^-双响应荧光探针的设计及成像应用

Construction and Bio-Imaging of a Viscosity and ONOO^- Dual-Responsive Fluorescent Probe

摘要

细胞内黏度和过氧亚硝酸根离子（ONOO^-）含量影响正常细胞代谢和生理功能，与很多疾病过程密切相关。为此，设计合成了一种新型黏度和ONOO^-双响应荧光探针VI-PN（2-（（6-羟基-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基）亚甲基）丙二腈）。在溶液体系中，该探针随着溶液（PBS/甘油）体系黏度增大，红色荧光（λ_em1=634 nm）显著增强，荧光增强倍数（F/F₀）为14倍；当加入ONOO^-后，探针被氧化，形成一种新的荧光团，产生绿色荧光（λ_em2=559 nm），荧光增强倍数为240倍。该探针细胞毒性低，对黏度和ONOO^-的响应具有选择性好和响应灵敏的特点，可区分和定性地检测黏度和ONOO^-的变化，并应用于细胞内黏度和ONOO^-浓度的共聚焦荧光成像检测。

Abstract

Intracellular viscosity and peroxynitrite (ONOO^-) influences normal cell metabolism and function processes, associated with a large number of diseases. Herein, a novel viscosity and ONOO^- dual-responsive fluorescent probe VI-PN (2-((6-hydroxy-2,3-dihydro-1H-xanthen-4-yl)methylene)malononitrile) was designed and prepared. In a mixture of PBS/glycerol solution, the probe displayed remarkable red fluorescence emission (λ_em1=634 nm) increase with the increasing viscosity and a largest fluorescence enhancement factor (F/F₀) of 14-fold. Upon the addition of ONOO^-, the probe was oxidized to produce another fluorophore and displayed significant green fluorescence emission (λ_em2=559 nm) with a largest fluorescence enhancement factor of 240-fold. Thereby, the probe, featured with low cytotoxicity, can well distinguish and determine viscosity and ONOO^- in buffer solution, respectively. As a result, the probe can monitor the content change of viscosity and ONOO^- in live cells by confocal fluorescence imaging.

Graphical abstract

关键词

荧光探针 / 黏度 / 过氧亚硝酸根 / 生物成像

Key words

fluorescent probe / viscosity / peroxynitrite / bio-imaging

0　 引 言

在生命体中，几乎所有的生化反应都发生在溶液环境（细胞质，血液等）之中，因此，黏度（viscosity）是影响细胞正常功能和生命活动的一个重要参数。细胞内黏度的异常变化通常与一系列疾病相关，如糖尿病、高血压、血管粥样硬化、阿尔兹海默症和肿瘤等^［1，2］。过氧亚硝酸根离子（ONOO^-）是活性氧的一种，在生物体内通过一氧化氮（NO）和超氧根离子（O₂^-）原位反应生成^［3］。 ONOO^-具有极强的氧化和硝化性质，可氧化细胞内蛋白质、酶、磷脂、生物硫醇和核糖核酸等生物分子，从而调控细胞内氧化还原平衡和一系列生理信号传导过程。目前研究发现，ONOO^-在炎症和肿瘤形成过程中发挥着重要作用^［4，5］。因此，同时考察黏度和ONOO^-在炎症和肿瘤等疾病过程中发挥的作用及相互之间关系可促进人们对疾病发生过程和机理的认识和了解，具有重要的研究意义。

基于分子探针的荧光成像方法具有非侵入、无损和可视化等成像特点，可高灵敏地检测细胞、组织和活体水平中目标分析物的浓度和分布^［6］。目前，已有大量荧光探针被报道应用到黏度/ONOO^-在细胞水平上的检测，初步揭示了黏度/ONOO^-在细胞生理和病理过程中发挥的作用^［7~9］。由于缺乏同时检测黏度和ONOO^-的荧光探针，二者在细胞内的作用关系上尚未明确。采用双探针成像的方法（即一个黏度荧光探针和一个ONOO^-荧光探针）可对细胞内的黏度和ONOO^-进行分别检测^［10］， 但由于探针的激发波长不同、发光效率差异、细胞内环境的异质性以及探针在胞内空间分布上的差异，大大降低检测结果的准确性。利用双目标分析物响应的单分子荧光探针在细胞水平内分别对黏度和ONOO^-进行检测，可有效克服双探针同时检测两个目标分析物结果不准确的这一缺点。迄今，黏度和ONOO^-双响应单分子荧光探针鲜有报道。

基于此，经过合理设计，本文合成了一种可以对黏度和ONOO^-分别进行响应的单分子荧光探针。该探针与黏度、ONOO^-反应之后表现出不同荧光发射波长和强度，可分别准确地检测黏度和ONOO^-的变化而不产生相互干扰。细胞共聚焦荧光成像实验证明该探针可对细胞内黏度和ONOO^-的变化情况进行区分和定性检测。

1　 实验部分

1.1　试剂及仪器

试剂：制霉菌素（nystatin）和5-氨基-3-（4-吗啉基）-1，2，3-恶二唑盐酸盐（SIN-1）均购自上海阿拉丁试剂公司。其他化学试剂和溶剂均为商业化分析纯级，购于阿拉丁试剂公司或国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

仪器：RF-6000型荧光光谱仪（Shimadzu公司），UH-4150型紫外可见近红外吸收光谱仪（Hitachi公司），NDJ8S型黏度计（邦西仪器科技（上海）有限公司），Varian Mercury VX400型磁共振仪（400 MHz，Varian公司），LSM-880型多光子共聚焦荧光显微镜（Zeiss公司）。

1.2　合成方法

探针VI-PN（2-（（6-羟基-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基）亚甲基）丙二腈）的合成过程如图1所示。

1.2.1　化合物2的合成

将化合物1（6-甲氧基-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-甲醛，242 mg，1.0 mmol）和丙二腈（120 mg，1.8 mmol）溶于10 mL无水乙醇当中，随后加入0.7 mL哌啶（piperidine）。在氩气保护下，上述混合溶液85 ℃回流反应18 h，反应完成后，减压蒸发浓缩得到粗产物2，用石油醚-二氯甲烷（3∶1，体积比）为洗脱液经硅胶层析柱提纯，得到红色固体2（2-（（6-甲氧基-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基）亚甲基）丙二腈，230 mg， 79.3%）。¹H NMR（400 MHz， DMSO-d₆）谱图数据（δ）：8.18（s， 1H）， 7.44（d， J=8.6 Hz， 1H）， 7.32~7.38（m， 1H）， 7.24（dd， J=2.5， 0.7 Hz， 1H）， 6.89（dd， J=8.6， 2.5 Hz， 1H）， 3.85（s， 3H）， 2.74（t， J=6.0 Hz， 2H）， 2.61（t，J=5.8 Hz， 2H）， 1.75（m， 2H）。

1.2.2　探针VI-PN的合成

将化合物2（290 mg，1.0 mmol）溶于8.0 mL的无水二氯甲烷（DCM）中，冷却至0 ℃后缓慢滴加BBr₃（20 mL），在室温条件下继续搅拌12 h。将混合溶液倒入冰水中，用NaHCO₃溶液调节溶液pH至中性。反应液用二氯甲烷和甲醇（20∶1，体积比）混合溶液萃取（60 mL×4），有机层用无水Na₂SO₄干燥除去残留水分，减压蒸馏得到粗产物。粗产物采用硅胶层析柱法（淋洗剂乙酸乙酯/石油醚（4∶1，体积比））分离提纯，得到深红色固体纯品VI-PN（2-（（6-羟基-2，3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基）亚甲基）丙二腈，150 mg， 42%）。¹H NMR（400 MHz， DMSO-d₆）谱图数据（δ）：10.59（s， 1H）， 8.14（s， 1H）， 7.29~7.40（m， 2H）， 6.90（dd， J=2.3， 0.7 Hz， 1H）， 6.75（dd，J=8.4， 2.3 Hz， 1H）， 2.73（t， J=6.1 Hz， 2H）， 2.60（t， J=6.0 Hz， 2H）， 1.74（m， 2H）。MS：［M+H］⁺ 277.20。

1.2.3　检测方法

ONOO^-储备液根据文献方法^［11］制备，-20 ℃保存备用。探针VI-PN溶于二甲基亚砜（DMSO）制备1.0 mmol/L储备液。测试ONOO^-响应时，1.0 mmol/L探针储备液用10 mmol/L PBS（磷酸盐缓冲溶液，pH 7.4）稀释至5.0 μmol/L，加入不同浓度的ONOO^-，反应0.5 h后测试荧光发射光谱和荧光强度变化；测试黏度响应时，将5.0 μmol/L探针VI-PN溶于不同浓度（0~90%，体积比）的甘油-PBS混合溶液，用黏度计测量其黏度η（mPa·s）大小，考察探针在不同黏度条件下荧光发射光谱和荧光强度的变化。

测试探针VI-PN对黏度响应的选择性。在含5.0 μmol/L VI-PN的PBS溶液中分别加入20 μmol/L干扰金属离子（Zn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、K⁺、Fe³⁺），50 μmol/L活性氧/活性氮（NO₂^-、O₂^-、ClO^-、·OH、H₂O₂、NO）；为了测试黏度对探针荧光的影响，5.0 μmol/L探针加入甘油-PBS（体积比9∶1， η=953.80 mPa·s）混合溶液。将上述溶液于37 ℃孵育30 min后，分别测试荧光强度的变化。

测试探针VI-PN对ONOO^-响应的选择性。在含5.0 μmol/L VI-PN的乙腈-PBS（2∶8，体积比）混合溶液中分别加入20 μmol/L的干扰金属离子（Zn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、K⁺、Fe³⁺），50 μmol/L的活性氧/活性氮（NO₂^-、O₂^-、ClO^-、·OH、H₂O₂、NO）和50 μmol/L ONOO^-，在恒温振荡摇床中 37 ℃孵育0.5 h，分别测试荧光强度的变化。

1.2.4　细胞的培养及成像

MCF-7细胞（湖南丰晖生物公司）在含有10%胎牛血清（Gibco公司）、1%链-青霉素的DMEM培养基（Gibco公司）中培养，置于二氧化碳细胞培养箱中增殖培养。细胞孵育5.0 μmol/L探针后在共聚焦荧光显微镜下利用20倍浸水物镜进行荧光成像。

为了建立细胞内源性黏度变化模型，采用制霉菌素诱导细胞黏度升高的方法。MCF-7细胞孵育0、10、20 μmol/L的制霉菌素0.5 h，随后孵育5.0 μmol/L探针VI-PN 0.5 h，用PBS洗掉多余探针，随后在共聚焦荧光显微镜下荧光成像。为了考察探针在细胞内对ONOO^-的响应性质，MCF-7细胞首先孵育5.0 μmol/L探针0.5 h，然后分别孵育0、200、500、1 000 μmol/L ONOO^-供体5-氨基-3-（4-吗啉基）-1，2，3-恶二唑盐酸盐（SIN-1）0.5 h，随后在共聚焦荧光显微镜下观察成像情况。

2　 结果与讨论

2.1　探针的设计

本研究中设计的黏度和ONOO^-双响应探针VI-PN的响应机理如图2所示。探针中氧杂蒽结构与丙二腈结构通过双键偶联，二者可通过碳碳单键发生自由转动。当探针被激发光激发后，由于碳碳单键旋转使激发态分子通过非辐射跃迁返回基态，荧光猝灭。随着溶液体系黏度增大，碳碳单键自由旋转被抑制，非辐射跃迁被抑制，红色荧光（red fluorescence）发射强度逐渐增强。基于碳碳单键旋转易受到黏度抑制而荧光增强的原理，实现了探针对黏度的特异性荧光响应。由于二氰基乙烯中乙烯双键容易被ONOO^-氧化断裂，加入ONOO^-后，生成了一个新的绿色荧光（green fluorescence）发射的荧光团3，由此实现了对ONOO^-的荧光响应和检测。综上，通过合理设计分子结构、结合黏度和ONOO^-的特性，合成得到一个可分别对黏度和ONOO^-有不同荧光响应的荧光探针。该探针可能用于ONOO^-和黏度的同时检测和成像研究。

2.2　探针对黏度的响应性质

首先考察了探针与黏度的响应关系。采用不同体积比（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、 8∶2、9∶1）的甘油-PBS缓冲混合溶液来模拟不同黏度大小的溶液，并使用黏度计依次测量其黏度η。将5.0 μmol/L探针加入到上述不同黏度的溶液中，测量探针的荧光光谱的变化。结果表明，探针本身在PBS中具有微弱红色荧光（λ_em=624 nm）；随着溶液黏度（1.55~953.80 mPa·s）的增大，探针在634 nm处荧光逐渐增强，最大荧光增强倍数（F/F₀）为14倍（图3A）。利用Forster-Hoffmann方程（lgI=a+xlgη， I为荧光强度，a为常数，η为溶液的黏度）^［12］拟合发现（图3B），探针在634 nm处荧光强度的对数与黏度η的对数呈现出较好的线性关系（R²=0.96），表明探针可对溶液的黏度进行灵敏和准确地荧光检测和分析。

2.3　探针对ONOO^-的响应性质

进一步考察了探针VI-PN对ONOO^-的荧光响应性质。在含5.0 μmol/L探针的乙腈-PBS（2∶8，体积比）缓冲溶液中，加入不同浓度（0~250 μmol/L）的ONOO^-，考察荧光强度与加入ONOO^-的关系（图4A）。结果表明，探针在559 nm处的荧光强度随着ONOO^-浓度的增大而增大；当加入ONOO^-的浓度大于180 μmol/L，体系的荧光强度趋于稳定， 此时荧光强度增大了240倍（F/F₀）（图4B）。当加入ONOO^-浓度在1.0~120 μmol/L浓度范围内，探针在559 nm处的荧光强度与ONOO^-浓度c（μmol/L）呈现出良好的线性荧光响应区间（图4C）。探针与ONOO^-反应随时间的变化趋势图（图4D）表明，探针与ONOO^-反应40 min后，体系的荧光强度不再发生明显变化。以上实验结果表明，探针在溶液中与ONOO^-在40 min反应完全，且具有较大的荧光增强倍数；同时，该探针在溶液中可对1.0~120 μmol/L的ONOO^-进行灵敏的定量检测。

2.4　探针的选择性和pH稳定性

选择性是评价探针在复杂环境下检测结果是否可靠的重要指标之一。如图5A和5B所示，探针对黏度（953.80 mPa·s）表现出14倍荧光增强，对50 μmol/L ONOO^-表现出90倍荧光强度。其他干扰物质如20 μmol/L金属离子（Zn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、K⁺、Fe³⁺），50 μmol/L活性氧或50 μmol/L活性氮（NO₂^-、O₂^-、ClO^-、·OH、H₂O₂、NO）均不能引起明显的荧光增强（荧光强度增强小于36%）。

继续考察溶液pH值变化对探针和ONOO^-（50 μmol/L）反应的影响。结果表明，不同pH值对探针自身荧光几乎没有影响，而对VI-PN和ONOO^-的反应有一定的影响。当溶液pH值为2.7~6.5，探针与ONOO^-反应后的荧光被抑制，与探针本身荧光强度基本保持一致，说明酸性条件下不利于VI-PN和ONOO^-的反应；当溶液pH值为7.4~10.0，探针与ONOO^-的反应加速，荧光增强显著，说明VI-PN和ONOO^-反应更易于在碱性条件下发生（图5C）。探针对pH的响应性质表明探针在生理pH （~7.4）条件下对ONOO^-有很好的荧光响应，可在生理pH条件下对ONOO^-进行灵敏的检测。

上述数据和结果表明探针对黏度和ONOO^-表现出优异的选择性，适合用于复杂细胞环境中特异性地检测黏度和ONOO^-。

2.5　胞内ONOO^-和黏度的荧光成像检测

为了确保探针VI-PN安全地应用到细胞成像，首先利用MTT法（噻唑蓝法）对探针的细胞毒性进行考察。如图6所示，MCF-7细胞和探针共同孵育24 h后仍保持较高的细胞存活率（探针浓度为0~15 μmol/L时，细胞成活率大于90%），证明探针毒性小，适于细胞成像。

紧接着，考察了在胞内环境下探针对黏度的响应情况。共聚焦荧光成像结果表明，探针可很好地进入细胞并主要分布在细胞质中。细胞孵育探针后表现出微弱的红色荧光（图7A）；随着制霉菌素浓度（0、10、20 μmol/L）的增大，细胞的红色荧光信号逐渐增强（图7B，7C和7D）。这一现象可解释为制霉菌素可以诱导细胞内黏度的升高^［13］，抑制探针分子内的单键自由旋转，从而导致红色荧光增强。

随后，考察了在胞内环境下探针对ONOO^-的荧光响应情况。共聚焦荧光成像结果表明，细胞的绿色荧光信号强度随着SIN-1浓度的增大而增大（图8A-D）。这是由于SIN-1进入细胞之后释放出ONOO^-［14］，胞内探针与ONOO^-反应后，发出明亮的绿色荧光。荧光强度的增大程度与SIN-1的剂量成正比，说明该探针可以定性地检测细胞外源性ONOO^-的含量（图8E）。

上述成像数据清楚地表明探针VI-PN可进入细胞质，并且可通过不同通道收集荧光的变化对胞内黏度和ONOO^-浓度的变化进行区分，利用荧光成像实现了对黏度和ONOO^-的同时定性可视化成像检测。

3　 结 语

本工作结合黏度和ONOO^-的物理和化学特性，设计合成了一种黏度和ONOO^-双响应单分子荧光探针VI-PN。该探针分子中的二氰基乙烯结构易被ONOO^-氧化断裂，这一发现为基于氧化反应型ONOO^-探针设计贡献了一个全新的识别位点。该探针对黏度响应后发出红色荧光（λ_em=634 nm），荧光强度增强14倍，与ONOO^-反应后发出强烈绿色荧光（λ_em=559 nm），荧光强度增强240倍。因此，该探针可通过荧光发射光谱变化实现对ONOO^-和黏度的区分检测，有效克服了双探针法检测ONOO^-和黏度结果不准确的缺点。由于具备黏度和ONOO^-双响应荧光性质和较低的生物毒性，该探针可对细胞黏度和ONOO^-浓度分别进行实时动态可视化共聚焦荧光成像研究。本文的工作为探究细胞内黏度和ONOO^-浓度在疾病和生命过程中的作用机制提供了一种新颖且可靠的方法。

参考文献

[1] WANG L， XIAO Y， TIAN W M， et al. Activatable rotor for quantifying lysosomal viscosity in living cells ［J］. Journal of the American Chemical Society， 2013， 135（8）： 2903-2906. DOI：10.1021/ja311688g .

[2] DOU K， HUANG W J， XIANG Y X， et al. Design of activatable NIR-Ⅱ molecular probe for in vivo elucidation of disease-related viscosity variations ［J］. Analytical Chemistry， 2020， 92（6）：4177-4181. DOI：10.1021/acs.analchem.0c00634 .

[3] LI J B， CHEN L L， WANG Q Q， et al. A bioluminescent probe for imaging endogenous peroxynitrite in living cells and mice ［J］. Analytical Chemistry， 2018， 90（6）： 4167-4173. DOI： 10.1021/acs.analchem.8b00198 .

[4] WANG W W， XIONG J H， SONG X J， et al. Activatable two-photon near-infrared fluorescent probe tailored toward peroxynitrite in vivo imaging in tumors ［J］. Analytical Chemistry， 2020， 92（19）：13305-13312. DOI：10.1021/acs.analchem.0c02587 .

[5] XIONG J H， WANG W W， WANG C X， et al. Visualizing peroxynitrite in microvessels of the brain with stroke using an engineered highly specific fluorescent probe ［J］. ACS Sensors， 2020， 5（10）： 3237-3245. DOI：10.1021/acssensors.0c01555 .

[6] LI X H， GAO X H， SHI W， et al. Design strategies for water-soluble small molecular chromogenic and fluorogenic probes ［J］. Chemical Reviews， 2014， 114（1）： 590-659. DOI：10.1021/cr300508p .

[7] 吕维杰， 毛志强， 刘志洪. 红光发射分子转子的设计与合成 ［J］. 分析科学学报， 2017， 33（5）：677-680. DOI：10.13526/j.issn.1006-6144.2017.05.016 .

[8] LÜ W J， MAO Z Q， LIU Z H. Design and synthesis of red emissive molecular rotor ［J］. Journal of Analytical Science， 2017，33（5）：677-680. DOI：10.13526/j.issn.1006-6144.2017.05.016（Ch ）.

[9] FU M L， SHEN W， CHEN Y J， et al. A highly sensitive red-emitting probe for the detection of viscosity changes in living cells， zebrafish， and human blood samples ［J］. Journal of Materials Chemistry B， 2020， 8（6）：1310-1315. DOI：10.1039/C9TB02023C .

[10] YANG M W， FAN J L， DU J J， et al. Small-molecule fluorescent probes for imaging gaseous signaling molecules： Current progress and future implications ［J］. Chemical Science， 2020， 11（20）： 5127-5141. DOI：10.1039/D0SC01482F .

[11] YU L， ZHANG J F， LI M L， et al. Combining viscosity-restricted intramolecular motion and mitochondrial targeting leads to selective tumor visualization ［J］. Chemical Communications， 2020， 56（49）：6684-6687. DOI： 10.1039/D0CC02943B .

[12] WANG Z， ZHANG F， XIONG J H， et al. Investigations of drug-induced liver injury by a peroxynitrite activatable two-photon fluorescence probe ［J］. Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2021， 246：118960. DOI：10.1016/j.saa.2020.118960 .

[13] LI S J， WANG P P， FENG W Q， et al. Simultaneous imaging of mitochondrial viscosity and hydrogen peroxide in Alzheimer’s disease by a single near-infrared fluorescent probe with a large Stokes shift ［J］. Chemical Communications，2020，56（7）： 1050-1053. DOI： 10.1039/C9CC08267K .

[14] YANG Z， HE Y， J-H LEE， et al. A self-calibrating bipartite viscosity sensor for mitochondria ［J］. Journal of the American Chemical Society， 2013， 135（24）：9181-9185. DOI：10.1021/ja403851p .

[15] ZHANG Y Y， LI Z， HU W， et al. A mitochondrial- targeting near-infrared fluorescent probe for visualizing and monitoring viscosity in live cells and tissues ［J］. Analytical Chemistry， 2019， 91（15）：10302-10309. DOI：10.1021/acs.analchem.9b02678 .

基金资助

国家自然科学基金(21804033)

国家杰出青年科学基金(21625503)