羧丁酰壳聚糖/氧化普鲁兰复合水凝胶的制备及其性能

Preparation and Properties of N-Succinyl Chitosan/Pullulan Oxide Composite Hydrogels

摘要

将壳聚糖亲水化改性制备羧丁酰壳聚糖（NSC），以转谷氨酰胺酶为催化剂，在羧丁酰壳聚糖上接枝小分子胶原蛋白肽（COP），并与氧化普鲁兰多糖（OPL）通过Schiff碱反应交联，制备得到一种新型羧丁酰壳聚糖/氧化普鲁兰（NSC-COP/OPL）复合水凝胶。采用红外光谱和扫描电镜对水凝胶的结构与形貌进行分析，同时考察了该水凝胶的凝胶时间、溶胀率、水蒸发率、溶血率和生物相容性等性能。结果显示，该水凝胶具有三维网状结构，凝胶时间随氧化普鲁兰多糖的加入量呈先减小后增大的趋势，最短为32 s；最大溶胀率可达574%；水蒸发率随氧化普鲁兰多糖加入量的增加而逐渐减小；不同比例的水凝胶溶血率均在5%以下；同时，具有良好的生物相容性。

Abstract

N-succinyl chitosan (NSC), hydrophilically modified from chitosan, was grafted with the small molecule collagen peptide (COP) using transglutaminase as catalyst, and then was cross-linked with pullulan oxide (OPL) to prepare a novel N-succinyl chitosan/pullulan oxide (NSC-COP/OPL) composite hydrogel through Schiff base reaction. The structure and morphology of hydrogels were analyzed by infrared spectroscopy and scanning electron microscopy. The properties of hydrogels, such as gelation time, swelling rate, water evaporation rate, hemolysis rate and biocompatibility, were also investigated. The results show that the hydrogel has a three-dimensional network structure; the gel time decreases first and then increases with the amount of OPL, and the shortest gel time is 32 s; the maximum swelling rate can reach 574%; the water evaporation rate decreases with the increase of the amount of pullulan oxide; the hemolysis rate of the hydrogels with different proportions is all below 5%. In addition, the composite hydrogel has excellent biocompatibility.

Graphical abstract

关键词

羧丁酰壳聚糖 / 氧化普鲁兰 / 胶原蛋白肽 / 水凝胶 / 伤口敷料

Key words

N-succinyl chitosan (NSC) / pullulan oxide (OPL) / collagen peptide / hydrogel / wound dressing

0　 引 言

皮肤是人体最大的器官，人体的隔热、体液保留和对外源性病原体的保护都取决于完整的皮肤屏障功能^［1］。当皮肤受到创伤时，伤口敷料的使用可以减少创面感染的风险，为伤口提供一个良好的愈合环境。水凝胶具有可吸收大量伤口渗出液^［2］、允许气体交换以及良好的生物相容性等优点，其类似细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的聚合物网络还可能产生额外的生物活性^［3，4］，在新型敷料的研究中具有广阔的前景。

壳聚糖（chitosan，CS）具有良好的生物相容性、生物降解性和低毒性，广泛应用于生物医药、食品、化工等领域。将亲水基团引入壳聚糖分子可以使其衍生物具有良好的水溶性^［5］。羧丁酰壳聚糖（N-succinyl chitosan，NSC）是通过丁二酸酐与壳聚糖的酰化反应得到的，与壳聚糖相比，其水溶性大大增强。同时，羧丁酰壳聚糖良好的吸湿保湿性、生物相容性和低毒性也使其备受关注^［6］。胶原蛋白肽（collagen peptide，COP）是从胶原蛋白中提取的生物活性肽，由至少两个氨基酸分子通过肽键连接而成。胶原蛋白肽具有趋化作用，能促进细胞迁移和增殖^［7，8］，促进伤口愈合。

普鲁兰（pullulan， PL）多糖是由出芽短梗霉分泌的胞外多糖，能与水以任意比例互溶，其分子结构的最简单元是葡萄糖氨α-1，4-糖苷键结合成的麦芽三糖，两端再以α-1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合。由于其具有无毒性、非免疫原性、非致癌性和非诱变性，普鲁兰多糖被普遍认为是安全的辅料^［9］。普鲁兰多糖与高碘酸钠反应生成具有醛基结构的氧化普鲁兰多糖，可作为优良的交联剂与羧丁酰壳聚糖交联制备水凝胶。

本文将壳聚糖亲水化改性制备羧丁酰壳聚糖，然后将小分子胶原蛋白肽接枝到羧丁酰壳聚糖上，以氧化普鲁兰多糖为交联剂，制备了一系列具有良好生物相容性、无毒无害的新型医用水凝胶材料，并考察了水凝胶的各项理化性质。

1　 实验部分

1.1　材料及仪器

材料：壳聚糖（脱乙酰度92%）、普鲁兰多糖（食品级）、丁二酸酐（分析纯）、高碘酸钠（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；胶原蛋白肽（食品级）、转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase，食品级）、胎牛血清、DMEM高糖培养基，青链霉素混合液、CCK-8试剂购自武汉华顺生物科技有限公司；SD大鼠3只购自三峡大学动物实验中心；人皮肤成纤维细胞购自北京北纳创联生物技术研究院；其他试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

仪器： UV1700PC型紫外可见分光光度计（上海科学仪器有限公司）、LGJ-10型冷冻干燥机（北京松源华兴生物技术有限公司）、170SX型Fourier变换红外光谱仪（FT-IR，KBr压片，扫描范围500~4 000 cm^-1，Nicolet公司）、TM-3000型扫描电镜 （SEM，日立公司）、Multiskan FC型酶标仪（Thermo Scientific公司）。

1.2　羧丁酰壳聚糖/氧化普鲁兰水凝胶的制备

NSC-COP的制备过程如图1所示。

按照文献方法^［10］制备羧丁酰壳聚糖（NSC）。

TGase的纯化：称取5 g TGase溶解于300 mL 0.2 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，在4 000 r/min转速下离心10 min，取上层清液透析3~4 d，浓缩冷冻干燥得到纯化的TGase粉末，于4 ℃保存^{［11，12］}。

NSC-COP的制备：根据Xiao等^［13］的方法制备羧丁酰壳聚糖（NSC）接枝胶原蛋白肽（COP）。将NSC固体、TGase酶和COP粉末分别溶解于适量PBS（0.2 mol/L，pH 7.0 ）中，其中，NSC与TGase的质量比为1∶0.2，NSC与COP粉末的质量比为1∶1.4，于40 ℃连续搅拌反应2 h，然后将温度升高至100 ℃，继续搅拌15 min，将TGase酶灭活。反应完成后，冷却至室温，将反应液在4 000 r/min转速下离心10 min，取上层清液透析3~4 d，浓缩冷冻干燥得到NSC-COP。

氧化普鲁兰的制备：称取5 g普鲁兰多糖充分溶解于500 mL蒸馏水中，按照重复单元摩尔比1∶1.2的比例加入高碘酸钠，搅拌下反应24 h，加入2 mL乙二醇中止反应^［14］，将反应液减压抽滤，滤液用去离子水透析3~4 d后，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到氧化普鲁兰（OPL）。反应如图2所示。

NSC-COP/OPL的制备：称取一定量NSC-COP，溶解于pH 7.4的PBS中，配制5%（m/V）的溶液。同样称取一定量OPL，溶解于pH 7.4的PBS中，配制5%（m/V）的溶液。分别将NSC-COP和OPL溶液按照质量比1∶0.2，1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1.0混合均匀，当溶液处于不流动状态后，即凝胶形成，5个样品分别标记为NCPL-1、NCPL-2、NCPL-3、NCPL-4、NCPL-5。复合水凝胶的形成过程如图3所示。

1.3　性能测试

1.3.1　凝胶时间

采用试管倒置法记录了凝胶化时间。将NSC-COP和OPL溶液分别按照质量比m_NSC-COP∶m_OPL：1∶0.2，1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1.0加入到试管中，开始计时，加入过程中不断搅拌，使其混合均匀，直至倒置试管液体不流动为止，记录凝胶化时间。每组实验重复3次，取平均值。

1.3.2　溶胀性能

将复合水凝胶样品于-35 ℃冷冻干燥48 h，称其质量（m₁），然后将冻干水凝胶浸泡在pH 7.4的PBS中，保持在37 ℃，每间隔一定时间取出，用滤纸吸干其表面水分，称其质量（m₂），直至溶胀达到平衡。根据（1）式计算水凝胶的溶胀率（equilibrium swelling ratio，ESR）：

\mathrm{E}\mathrm{S}\mathrm{R}=\frac{m_{\mathrm{2}}-m_{\mathrm{1}}}{m_{\mathrm{1}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

1.3.3　水蒸发率

将复合水凝胶样品在-35 ℃下冷冻干燥后，称其质量记为m_c，溶胀48 h后，再称其质量记为m_a，然后放入37 ℃的恒温水浴箱中，在特定时间点取出样品并称其质量记为m_b。根据（2）式计算水凝胶的水蒸发率（water evaporation rate，WER）：

\mathrm{W}\mathrm{E}\mathrm{R}=\frac{m_{\mathrm{b}}-m_{\mathrm{c}}}{m_{\mathrm{a}}-m_{\mathrm{c}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

1.3.4　溶血性能

先从健康大鼠的鼠尾上静脉采血4 mL， 加入到含抗凝剂的试管中，加入5 mL生理盐水，充分摇晃试管使血液混合均匀，制得稀释后的抗凝全血，于4 ℃保存。将复合水凝胶样品在-35 ℃下冷冻干燥48 h，取出，研磨成粉末。分别称取25 mg复合水凝胶样品粉末放入离心管中，加入10 mL生理盐水，放入恒温箱中37 ℃保温30 min，取出，分别加入0.1 mL已37 ℃预热的稀释抗凝全血，摇晃混匀，在恒温箱37 ℃继续保持1 h，取出，在1 500 r/min转速离心15 min，测上清液在545 nm处的吸光度A₁。其阳性对照将生理盐水替换成去离子水，吸光度值为A₂，阴性对照为不加水凝胶样品的生理盐水，吸光度值为A₃。根据（3）式计算水凝胶的溶血率（hemolysis rate，HR）。实验重复3次，取平均值。

\mathrm{H}\mathrm{R}=\frac{A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{3}}}{A_{\mathrm{2}}-A_{\mathrm{3}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（3）

1.4　体外生物相容性

1.4.1　水凝胶浸提液的配制

首先将冻干水凝胶样品研磨成粉末，铺平在无菌表面皿上，置于灭菌台上，紫外灭菌2 h后，将凝胶粉末与培养基按照1∶10（m/V）的比例浸提24 h，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，得到水凝胶样品的浸提液^［15］，于4 ℃密封保存。

1.4.2　CCK-8法测细胞密度

CCK-8法的原理是将WST-8（与MTT类似的化合物）还原成甲臜，甲臜的水溶液为橙黄色，细胞增殖越多，橙黄色越深，细胞毒性也就越小。将置于CO₂恒温培养箱中的96孔板移出（细胞已培养至贴壁），吸出96孔板中的培养基，每孔加入100 μL水凝胶浸提液，置于培养箱中培养1 d，取出，将水凝胶浸提液吸出，每孔换上100 μL新鲜培养基，并加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续培养大约2 h后用酶标仪测定450 nm处吸光度值A_s。以细胞悬浮液和培养基作对照组，吸光度值为A_c，以不加细胞悬浮液的纯培养基作空白对照，吸光度值为A_b，按照（4）式计算细胞存活率（relative cell viability， RCV）：

\mathrm{R}\mathrm{C}\mathrm{V}=\frac{A_{\mathrm{s}}-A_{\mathrm{b}}}{A_{\mathrm{c}}-A_{\mathrm{b}}}×100%（4）

2　 结果与讨论

2.1　样品表征

2.1.1　FT-IR图谱分析

图4为CS、NSC、NSC-COP的FT-IR图谱。CS图谱中3 426 cm^-1处为—OH和—NH₂的伸缩振动吸收峰，2 921 cm^-1和2 863 cm^-1为—CH、—CH₂的伸缩振动吸收峰，1 660 cm^-1和1 323 cm^-1则分别归属于乙酰基中的C=O、C—N伸缩振动，表明CS分子并未完全脱乙酰化；1 599 cm^-1为伯氨基的N—H弯曲振动峰，1 155 cm^-1属于CS环中C6上的C—OH伸缩振动。相较于CS的红外图谱，NSC的红外图谱中出现了一些峰的改变，1 652 cm^-1和1 570 cm^-1分别归属于酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的伸缩振动，1 409 cm^-1归属于羧基的伸缩振动，氨基的酰胺化及羧基伸缩振动的出现表明丁二酸酐成功以酰胺键的方式引入到CS分子上，生成羧丁酰壳聚糖^［10］。而在NSC-COP图谱中，1 655 cm^-1和1 558 cm^-1处的酰胺Ⅰ带—C=O和酰胺Ⅱ带—NH的峰明显变强，表明COP分子以酰胺反应的方式接枝到NSC分子上^［16］，生成NSC-COP。

图5为PL、OPL、NSC-COP/OPL的FT-IR图谱。PL的红外图谱显示出典型的多糖特征，3 436 cm^-1为—OH的伸缩振动，2 926 cm^-1为C—H的伸缩振动，1 641 cm^-1和1 458 cm^-1吸收带归因于—CH₂的对称伸缩振动，1 029 cm^-1归因于C—O—C在-（1→4）-糖苷键处的拉伸，是非晶态区域的标志^［17］。经高碘酸钠氧化后，OPL在1 737 cm^-1处出现一个新的吸收峰，说明了醛基的出现^［18］，OPL与NSC-COP溶液混合反应后形成凝胶，在1 648 cm^-1出现新的吸收峰，属于C=N的特征吸收峰，表明醛基和氨基通过Schiff碱反应形成水凝胶^［19］。

2.1.2　SEM分析

图6为NCPL-1、NCPL-3、NCPL-5冻干水凝胶断面结构放大1 000倍后的SEM图，因5种水凝胶样品微观形貌相似，故此处仅选取其中3个样品的SEM图。由图6可知，所有水凝胶样品都呈现出较均匀且连续的孔洞结构，孔壁光滑，孔洞直径随着OPL加入量的增多而略有减小。这是因为随着OPL含量增大，有更多的醛基与氨基发生交联，使形成的水凝胶的三维网络结构更加致密。水凝胶材料内部的多孔结构能增强其通透性，可以为内外营养物质和代谢物的交换提供通道。

2.2　性能分析

2.2.1　凝胶时间

材料的凝胶时间能够反映其凝胶化速率，是设计可注射水凝胶以满足临床要求的一个重要因素，特别是当涉及到细胞和生物活性分子的封装和传递时，可注射水凝胶应易于注射，并在合理的时间内快速交联。各复合水凝胶样品的凝胶化时间如图7所示。随着OPL用量的增加，凝胶时间呈现出先减小后增大的趋势；交联剂OPL的少量加入使水凝胶交联密度增大，凝胶时间逐渐减小，NCPL-3凝胶时间最短，为32 s；而当OPL与NSC-COP的质量比大于0.6时，凝胶时间逐渐增加，是因为OPL分子中过多醛基来不及与氨基结合，导致体系中组分的整体浓度降低，减慢了反应速率，从而使得凝胶时间增加^［19］。

2.2.2　溶胀性能

溶胀率是表征支架内氧气和营养物质转移效率的重要参数。图8显示了各复合水凝胶在PBS（pH 7.4）中48 h的溶胀率曲线。从单一曲线来看，水凝胶的溶胀率随着时间而持续增加，NCPL-1样品在48 h时基本达到溶胀平衡，最大溶胀率可达到574%，具有较强的吸水性。这是因为该水凝胶分子上有大量的—OH、—NH₂、—COOH等亲水基团，且水凝胶的三维多孔结构使其能够保留大量的水分子。水凝胶的高吸水特性使其在用作伤口敷料时，能够吸收伤口渗出液，加快伤口愈合过程。在同一时间点对不同水凝胶样品进行比较，其最大溶胀率有逐渐减小的趋势，当OPL与NSC-COP的质量比从0.2增加至1.0时，水凝胶的溶胀率从574%减小至170%，推测是因为随着醛基加入量的增多，水凝胶的交联程度增大，内部结构更加致密，能够容纳水分子的含量减少，导致溶胀率降低。该结果与SEM图表征结果相吻合。

2.2.3　水蒸发率

图9显示了各复合水凝胶的水蒸发率。在同一时间点比较各水凝胶的水蒸发率，实验开始阶段（0~4 h），凝胶表面的水分开始蒸发，各水凝胶水蒸发率几乎相同。4 h之后，当OPL的加入量增多时，NCPL水凝胶的水蒸发率逐渐减小，推测是因为当OPL的加入量增多时，OPL分子中有更多的醛基与氨基发生了反应，得到的凝胶结构更致密，凝胶内部的自由水更不易蒸发。这也进一步证实了SEM的表征结果。同一凝胶样品随着时间增加，水的蒸发的逐渐趋缓，当蒸发至20 h时，凝胶中仍含有5%~18%的水分，表明该水凝胶具有较好的保水性能。

2.2.4　溶血性能

材料的溶血作用是指材料对红细胞的破坏作用。当材料直接用于接触伤口时，需要评价其溶血性能。生物材料溶血性国际标准^［19］为：当材料的溶血性小于5% 时，表明材料的相容性好，可作为皮肤接触材料。如图10中插图所示，阴性对照组上层溶液呈透明无色，所有红细胞均沉积在试管底部，几乎无溶血作用；阳性对照组上层溶液呈透明红色，试管底部无血红细胞沉积，红细胞遭到破坏，溶血作用明显；而实验组上层溶液呈淡黄色，介于两者之间，试管底部也有红细胞沉积，显示部分溶血。通过测定试管上清液中红细胞在545 nm处的吸光度计算各水凝胶样品的溶血率，发现各组样品的溶血率均在5%以下，均具有良好的生物安全性，可作为皮肤伤口敷料使用。

2.2.5　生物相容性

采用人皮肤成纤维细胞实验评价各复合水凝胶样品的生物相容性。如图11所示，各水凝胶样品的细胞相对存活率均在75%以上，表明各复合水凝胶样品对细胞几乎无毒性作用，具有良好的生物相容性。其中NCPL-2和NCPL-3组水凝胶的细胞相对存活率最高，具有最好的生物相容性。

3　 结 语

本文将壳聚糖改性制备了水溶性的羧丁酰壳聚糖，然后以转谷氨酰胺酶为催化剂，通过催化酰基转移的反应将小分子胶原蛋白肽接枝到羧丁酰壳聚糖上，得到复合材料NSC-COP。将普鲁兰多糖经高碘酸钠氧化后制备出氧化普鲁兰多糖，以氧化普鲁兰多糖作交联剂与NSC-COP材料经Schiff碱反应形成NSC-COP/OPL复合水凝胶。采用FT-IR和SEM技术进行结构表征，结果显示，该复合水凝胶材料具有清晰、多孔、稳定的三维网络结构。同时，考察了水凝胶材料的理化性能，发现水凝胶的凝胶时间随OPL加入量的增加呈现先减小后增大的趋势，最短为32 s，最大溶胀率可达到574%；水蒸发率随OPL加入量的增加而逐渐减小；各组水凝胶样品的溶血率均在5%以下；对人皮肤成纤维细胞几乎无毒性作用，具有良好的生物相容性。该新型复合水凝胶在伤口敷料领域具有潜在的应用。

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基金资助

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