铁死亡细胞中双光子硫化氢荧光探针的构建与应用

Construction and Application of a Two-Photon Fluorescent Probe for Detecting Hydrogen Sulfide in Iron-Death Cells

摘要

传统的消耗型硫化氢荧光探针因灵敏度较低，无法实现铁死亡过程中细胞内硫化氢含量的检测。基于此，设计并合成了一种双光子激发深红光发射的硫化氢荧光探针KS-HS。探针分子中引入了硫代氨基甲酸苄酯的结构单元，可在碳酸酐酶的催化下释放出H₂S从而提高探针的灵敏度。探针分子中的叠氮基与硫化氢发生还原反应，作为触发分子内电荷转移（ICT）效应并释放深红光的开关。该探针对H₂S响应速度快、灵敏度高（检出限低至15 nmol/L）、选择性好，可成功检测基于OGD/R模型模拟的铁死亡过程中细胞内硫化氢含量的变化。

Abstract

The traditional consumable fluorescent probe for hydrogen sulfide could not be used to detect the content of hydrogen sulfide in iron death cells because of its low sensitivity. Herein, a hydrogen sulfide fluorescent probe KS-HS with two-photon excitation and deep red emission was designed and synthesized in this article. The moiety of benzyl thiocarbamate was introduced into the probe molecule, which can release H₂S to improve the sensitivity of the probe under the catalysis of carbonic anhydrase. The azide group in the probe molecule was reduced with hydrogen sulfide and acted as a switch to trigger the intramolecular charge transfer (ICT) and thereby release deep red light. The probe can respond to H₂S with high speed, excellent sensitivity (limit of detection is as low as 15 nmol/L) and good selectivity. In addition, the probe can be successfully applied to detect the change of hydrogen sulfide content in iron death cells which was simulated by OGD/R model.

Graphical abstract

关键词

双光子荧光探针 / 铁死亡 / 硫化氢 / 细胞成像

Key words

two-photon fluorescent probe / iron death / hydrogen sulfide / cell imaging

0　 引 言

硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）是一种内源性的气体信号分子，在许多生理过程中发挥着重要作用^［1］，如血压的调节、心脏的泵血和消化代谢系统功能的调控等^［2~4］。而人体内异常的H₂S水平则与许多疾病相关，如糖尿病^［5］、阿尔茨海默病^［6］、帕金森综合征^［7］等。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡，铁死亡过程中往往伴随着脂质过氧化导致的细胞膜破裂。最新研究表明，铁死亡的发病机制主要是通过抑制细胞膜上的胱氨酸谷氨酸转运蛋白（System Xc^-），降低谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）的活性，从而导致细胞内氧化还原失衡，同时因H₂S合成酶（胱硫醚β-合成酶）活性受到抑制而造成细胞内H₂S含量明显降低^［8~10］。因此，检测铁死亡过程中的H₂S水平对理解铁死亡过程具有重要意义。

传统的H₂S检测方法主要有比色法、电化学分析法、气相色谱法等^{［11，12］}，但这些方法或成本较高、或对样本有一定的破坏，难以实现生物体内H₂S的原位、实时检测。相比之下，以荧光探针为基础的荧光成像技术因具有灵敏度高、非侵入性、时空分辨率高、无损、实时和快速等优点，而成为研究生物体内活性物种及其生物过程的有力工具^{［13，14］}。目前，大多数荧光探针都是紫外-可见光激发的单光子荧光探针，双光子荧光探针在继承了单光子荧光探针优势的基础上利用近红外光激发（700~900 nm），有效地增加了激发光的穿透深度，并减少背景荧光的干扰和探针自身的光漂白现象^{［15，16］}。因此，开发高选择性、高灵敏度的双光子H₂S荧光探针具有重要意义。2017年，Deng课题组^［17］报道了一种基于萘酰亚胺荧光团的双光子荧光探针用于检测细胞内H₂S的含量。2018年，Fei课题组^［18］合成了一种基于氟化硼二吡咯（BODIPY）荧光团的双光子荧光探针用于活细胞内H₂S的原位成像。然而，铁死亡过程中细胞内H₂S含量很低，现有的荧光探针大多由于灵敏度的限制而无法很好地完成H₂S的检测，且这些探针在对H₂S检测时为不可逆消耗过程，不利于维持铁死亡过程中细胞的稳态。Steiger课题组^［19］借鉴氨基甲酸苄酯释放CO₂的过程，构建了硫代氨基甲酸卞酯作为H₂S供体在碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）的作用下释放H₂S的策略，有利于维持细胞内H₂S的稳态。因此，通过碳酸酐酶催化羰基硫原位可控释放H₂S的方法可解决探针灵敏度不足的问题。

基于上述分析，本文设计并合成了一种双光子激发深红光发射的荧光探针KS-HS用于检测铁死亡细胞中H₂S的含量（图1）。探针利用H₂S介导的叠氮苯基发生还原反应作为响应机理，通过引入硫代氨基甲酸苄酯的结构单元以解决铁死亡细胞中探针灵敏度不足的问题。该结构单元的引入可使探针与H₂S反应产生羰基硫，进而在碳酸酐酶的作用下分解为H₂S。加入碳酸酐酶的KS-HS探针与H₂S响应后在675 nm处的荧光强度增强7倍，同时还具有很好的选择性、光稳定性和低细胞毒性，可用于检测铁死亡过程中细胞内H₂S的含量。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：NS-398（环氧合酶-2抑制剂）购自上海麦克林生化科技有限公司，DMEM细胞培养基购自Gibco公司，其余药品均购自上海阿拉丁公司，所有溶剂均购自上海国药集团，所有试剂均为分析纯或更高纯度，使用前无需进一步纯化，实验所需溶液均为超纯水配制。

仪器：RF-6000型荧光分光光度计（Shimadzu公司），LSM780 NLO型双光子激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss公司），BS-20-GJM型35 mm玻底培养皿（Biosharp公司），AL104型分析天平（Mettler Toledo集团），DZF-6030A型真空干燥箱（武汉科尔仪器设备有限公司），FE 20型pH计（Mettler Toledo集团），Multiskan FC型酶标仪（ThermoFisher Scientific公司）。

1.2　实验步骤

1.2.1　探针KS-HS的合成

KS-HS的合成路线如图2所示。

化合物1参照文献方法^［20］合成。

化合物2的合成：将化合物1（2 g， 6.9 mmol）、三乙胺（5.7 mL， 41.6 mmol），60 mL无水四氢呋喃（THF）加入到150 mL反应瓶中，氩气保护，室温搅拌下将N，N'-硫羰基二咪唑（TCDI， 2.4 g， 13.8 mmol）溶于5 mL THF，缓慢滴加到反应瓶中，室温条件下反应，薄层色谱（TLC）监测至反应完全，加入饱和食盐水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，所得粗产品经柱色谱分离纯化（二氯甲烷/乙酸乙酯体积比1/10）得化合物2（1.7 g，产率74%）。磁共振氢谱（¹H NMR，600 MHz，CDCl₃）化学位移值δ： 7.42（d，J=8.4 Hz，2H），7.17（d，J=8.4 Hz，2H），6.93（d，J=16.1 Hz，1H）， 6.89（d，J=16.2 Hz，1H），6.79（s，1H），2.54（s，2H），2.39（s，2H），1.02（s，6H）。磁共振碳谱（¹³C NMR，150 MHz，CDCl₃）化学位移值δ： 169.02，153.11，135.12，134.68，132.14，130.22，128.60，126.42，124.29，113.33，112.58，79.44，42.98，39.20，32.06，28.04。

KS-HS的合成：将化合物2（50 mg，0.15 mmol）和4-叠氮基苄醇（22.5 mg，0.15 mmol）溶于无水THF中，冰浴搅拌下将氢化钠（7.8 mg，0.197 mmol）快速加入到上述反应液中，继续搅拌30 min后，室温条件下反应，薄层色谱（TLC）监测至反应完全后，加入饱和食盐水猝灭反应，反应液用乙酸乙酯萃取3次，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂。所得粗产品经柱色谱分离纯化（二氯甲烷/石油醚体积比3/1）得到固体KS-HS（20 mg，产率27%）。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d₆）化学位移值δ：11.40（s，1H），7.65（m，2H），7.53（d，J=8.1 Hz，2H），7.36（d，J=15.9 Hz，2H），7.25（m，2H），7.16（d，J=8.2 Hz，2H），6.87（s，1H），5.58（s，2H），2.61（s，2H），2.54（s，2H），1.02（s，6H）。¹³C NMR（150 MHz，DMSO-d₆）化学位移值δ：187.25，170.77，156.40，139.93，137.38，132.74，130.78，130.12，129.44，128.89，123.06，121.99，119.69，114.39，113.58，76.54，60.24，42.76，38.61，32.15，27.90。

1.2.2　探针KS-HS的荧光光谱性质检测

水溶液检测分为A、B两个组进行。A组：配制含10 µmol/L KS-HS探针，NaHS溶液浓度分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50 µmol/L的PBS缓冲液（未加碳酸酐酶，pH 7.4，含10%二甲基亚砜（DMSO）），于37 ℃恒温振荡（200 r/min）60 min，使反应进行完全，检测体系荧光光谱的变化（检测条件：采用490 nm 单光子模式激发，激发和发射狭缝宽度均为5 nm）。B组：用含有5 µmol/L碳酸酐酶的PBS缓冲液替代A组的PBS缓冲液，其他检测条件与A组相同。

1.2.3　探针KS-HS的时间依赖性实验

准确配制浓度为10 μmol/L的探针KS-HS检测溶液（含5 µmol/L碳酸酐酶），测试探针与50 μmol/L NaHS溶液分别反应0、5、7.5、10、15、20、30、40、60、90、100 min时的荧光光谱，并以相应的荧光强度对时间作图。

1.2.4　探针KS-HS的选择性实验

准确配制浓度为10 μmol/L的探针KS-HS检测溶液（含5 µmol/L碳酸酐酶），分别测试其与100 μmol/L的活性氧（H₂O₂、O₂^·-、HClO、·OH）、活性氮（NO、ONOO^-）和活性硫（半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、H₂S _n 、H₂S）反应60 min的荧光光谱，以考察探针的选择性。

1.2.5　细胞培养条件

取对数生长期的PC 12细胞，调整细胞浓度，按照1.0×10⁴/皿接种到培养皿中，置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素的高糖DMEM培养基中，在37 ℃、pH 7.4、5% CO₂、95%空气的环境中培育，成像前一天，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化，收集悬浮的PC 12细胞接种于玻底培养皿中贴壁生长，成像前用PBS清洗2次，用共聚焦显微镜成像（设置激发波长为810 nm，收集550~750 nm波段的荧光）。

1.2.6　细胞毒性实验

采用MTT（噻唑蓝）法评估探针的细胞毒性，将PC 12细胞接种在96孔板的高糖DMEM培养基中培育24 h，再分别用含不同浓度（0、5、10、20、30 µmol/L）探针溶液的DMEM培养液替换之前的培养液继续培育24 h，用PBS清洗，每孔中加入0.5 mg/mL MTT继续孵育4 h，反应完成后去除上清液，加入150 µL DMSO，10 min后，用酶标仪测量490 nm处的吸光度，并通过A/A₀×100%（A和A₀分别为实验组和对照组的吸光度）计算细胞的存活率。

1.2.7　OGD/R模型的建立

将PC 12细胞接种在无糖的DMEM培养基中，采用pH 7.4、37 ℃、无氧的条件培养，然后用添加了葡萄糖和血清的DMEM培养液替换原培养液，继续孵育12 h，以此建立氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）细胞模型。共聚焦成像前将PC 12细胞用PBS清洗2次，用共聚焦显微镜成像（设置激发波长为810 nm，收集550~750 nm波段的荧光）。

2　 结果与讨论

2.1　探针的光谱性质

首先考察了探针KS-HS对不同浓度H₂S响应之后的荧光发射光谱（图3A未加入碳酸酐酶，图3B加入碳酸酐酶），结果如图3A~D所示。探针的检测浓度均为10 μmol/L，随着0~50 µmol/L H₂S加入，探针在675 nm处发射峰的荧光强度逐渐增强，在H₂S为50 µmol/L时荧光强度达到最大值。从荧光强度增加的倍数来看，加入碳酸酐酶的B组荧光强度明显高于未加入碳酸酐酶的A组。拟合不同浓度下荧光强度的线性校正曲线（图3C），可看出探针的荧光强度与H₂S浓度呈现良好的线性关系，且加入碳酸酐酶后的斜率大于未加入碳酸酐酶的斜率。根据公式LOD=3σ/k（σ为11组探针KS-HS溶液（5 µmol/L）在675 nm处的荧光强度标准偏差，k表示探针KS-HS滴定光谱曲线在线性范围内的斜率）计算出碳酸酐酶存在时探针的检出限为15 nmol/L，未加入碳酸酐酶时检出限为65 nmol/L。结果表明，探针中硫代氨基甲酸卞酯结构单元的引入可以使探针的灵敏度得到提升。测得探针在加入碳酸酐酶条件下不同波长的双光子活性截面（图3D），最大值为80 GM（1 GM=10^-50 cm⁴·s·photons^-1·molecule^-1），未加入碳酸酐酶时探针的双光子活性截面最大值为60 GM。由此可知，无论是否存在碳酸酐酶，探针的荧光团都具有较好的双光子性质。

2.2　探针的时间依赖性和选择性实验

良好的时间依赖性和选择性是实现探针在复杂细胞环境下成像的前提。图4A、B所示为不同时间探针KS-HS对H₂S的响应以及与不同分析物的响应。如图4A所示，随着时间的延长，可观察到未加H₂S时探针KS-HS的荧光强度基本不变，而随着H₂S的加入，探针的荧光强度逐渐增强，并在60 min时反应完全，荧光强度不再发生明显改变，说明探针对H₂S响应较快。配制10 μmol/L的探针检测溶液分别考察对100 μmol/L活性氧（ROS）、100 μmol/L活性氮（RNS）和100 μmol/L活性硫（RSS）响应后的荧光强度的变化（图4B），发现仅当H₂S加入时探针溶液才产生较强的荧光信号，表明探针KS-HS对H₂S具有较好的选择性。

2.3　探针的细胞毒性实验

根据MTT法测试细胞毒性的结果（图5），探针KS-HS浓度在0~30 μmol/L范围内，PC 12细胞均有94%以上的存活率，表明探针具有较低的细胞毒性。

2.4　探针的光稳定性实验

用5 μmol/L探针KS-HS溶液孵育PC 12细胞30 min后，再与20 μmol/L NaHS溶液孵育30 min的双光子共聚焦成像。在60 min的时间段内，随机选取显微镜视野中的4个位置（a、b、c、d），连续用波长为810 nm的双光子激光照射，收集550~750 nm波段的荧光，每5 min测一次体系的荧光强度。如图6所示，4个位置的细胞荧光强度均趋于平稳，说明探针在细胞环境中具有良好的光稳定性。探针KS-HS的光稳定性为其在细胞中长时间成像提供了可能。

2.5　内/外源性H₂S的检测

在证明了探针具有较低的细胞毒性和光稳定性的前提下，考察探针KS-HS对外源性H₂S的细胞成像。将PC 12细胞用5 μmol/L探针KS-HS溶液孵育30 min，再与不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）NaHS溶液分别孵育30 min，双光子共聚焦成像如图7A所示。从红色通道（red channel）中可以观察到随着NaHS含量的增加，细胞的红色荧光不断增强，荧光强度与NaHS含量的变化呈现正相关（图7B）。这说明该探针具有检测细胞外源性H₂S的能力。

为了考察探针对细胞内源性H₂S的响应能力，分别设立了3组平行实验：第一组用5 μmol/L KS-HS溶液孵育PC 12细胞建立Sham组；第二组用1μg/mL PMA（抑制内源性H₂S产生）与5 μmol/L KS-HS溶液同时孵育细胞30 min建立PMA组；第三组用50 μmol/L SNP（硝普钠）和5 μmol/L KS-HS溶液同时孵育PC 12细胞30 min建立SNP组，SNP可释放NO并同时增加CSEmRNA的表达，增加CSE蛋白酶的量，从而促进H₂S的生成。如图8A所示，仅孵育了探针的细胞荧光很弱（Sham组a₂），加入SNP的探针表现出明显的荧光增强（SNP组e₂），而用PMA孵育过的细胞表现出明显的荧光减弱（PMA组c₂），说明探针KS-HS可以成功检测细胞中内源性的H₂S的产生。接下来，在3组体系中分别加入50 μmol/L碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺（acetazolamide），如图8B中所示，通过对比可发现，细胞的相对荧光强度都在原基础上出现一定程度的减弱，其主要原因是碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺的加入抑制了羰基硫分解产生H₂S，从而使探针灵敏度下降。

2.6　探针在OGD/R模型中的细胞成像

用OGD/R模型来模拟细胞中发生的铁死亡过程，以考察铁死亡过程中细胞内H₂S含量的变化。将PC 12细胞传代到玻底培养皿上贴壁生长，将培养基换为无糖DMEM，并在无氧的三气培养箱中培养6 h，再将细胞换在高糖DMEM、5% CO₂的环境中培育12 h，最后用5 μmol/L探针KS-HS溶液孵育细胞30 min构建Control组；将同批次的PC 12细胞经同样条件的OGD/R过程先用5 μmol/L探针溶液孵育细胞30 min，再与NS-398（50 μmol/L）孵育24 h构建NS-398组。从图9A可以看出，Control组细胞相比于Sham组，细胞荧光强度有明显降低，表明OGD/R过程引起细胞发生氧化应激、炎症反应等细胞损伤而导致还原系统失衡、H₂S合成酶活性被抑制，进而引起H₂S含量降低；使用NS-398孵育的细胞相对Control组荧光强度明显增强，表明NS-398对氧化还原系统的恢复具有良好疗效，从而使H₂S合成酶活性得以恢复，H₂S含量增加，细胞荧光强度增强。在Control组和NS-398治疗组分别加入乙酰唑胺，发现细胞的荧光强度均发生一定程度降低，是由于碳酸酐酶抑制剂的加入中断了羰基硫分解产生H₂S，从而降低了探针的灵敏度^［19］。

基于探针KS-HS可检测内源性H₂S，为了证实OGD/R模型可模拟细胞铁死亡过程中的H₂S减少，进行以下实验：在对照组中加入NS-398，观察细胞内荧光强度随氧糖剥夺时间的变化。如图10所示，实验中用5 μmol/L探针KS-HS和50 μmol/L NS-398溶液在0 h构建治疗对照组，随着氧糖剥夺时间的增加（0、3、6、12 h），可观测到OGD/R模型中H₂S含量随着氧糖剥夺时间的增加而逐渐减少。

3　 结 语

本文设计并合成了一种双光子激发深红光发射的H₂S荧光探针KS-HS，通过向探针分子中引入硫代氨基甲酸卞酯结构单元以提高探针的灵敏度并维持铁死亡细胞的稳态。由于该结构单元的引入，探针具有更好的荧光响应（约7倍荧光强度增强）和更低的检出限（低至15 nmol/L），弥补了传统消耗型H₂S荧光探针在铁死亡细胞中检测灵敏度不足及难以维持细胞稳态的缺陷。探针KS-HS还表现出对H₂S的高选择性和较低的细胞毒性，可用于检测铁死亡过程中细胞内H₂S水平的变化。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金(21561011)

湖北省自然科学基金面上项目(2016CFB400)

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金(PT012003)