羧丁酰壳聚糖-丝素肽/氧化魔芋可注射水凝胶的制备及性能

Preparation and Properties of Carboxybutyryl Chitosan-Silk Peptide/Oxidized Konjac Injectable Hydrogel

摘要

利用丝素肽对羧丁酰壳聚糖进行接枝改性，再以氧化魔芋（OKGM）作交联剂，通过Schiff碱反应制备得到一种可注射的羧丁酰壳聚糖-丝素肽/氧化魔芋（NSGM）水凝胶。样品的红外光谱和磁共振氢谱证实了改性、接枝和交联反应的发生，扫描电镜结果表明该水凝胶具有内部连通的孔结构。性能研究结果表明，该水凝胶具有35~70 s可调节的凝胶时间，溶胀率最高可达1 259%，室温下24 h后最多可维持21.1%的水分，同时具有良好的生物相容性。

Abstract

An injectable hydrogel was prepared through Schiff base reaction using silk fibroin peptide (SFP) grafted carboxybutyryl chitosan (NSC) as substrate and oxidized konjac glucomannan (OKGM) as cross linker. Successful modification, grafting and crosslinking reactions with the hydrogel material were confirmed by Fourier transform infrared (FT-IR) and ¹H NMR spectrum. Porous structure of the prepared hydrogel was also verified by SEM images. Afterwards, physicochemical properties of NSGM hydrogel were investigated and results showed that the prepared hydrogel possesses an adjustable gel time varied from 35 s to 70 s. Furthermore, the maximum water absorption capability of NSGM reached as high as 1 259%, and maximum 21.1% water could be retained within the hydrogel even after 24 hours at room temperature. Cytotoxicity study was then conducted to prove the superior biocompatibility of the hydrogel.

Graphical abstract

关键词

羧丁酰壳聚糖 / 丝素肽 / 氧化魔芋 / 可注射水凝胶 / 制备 / 生物活性

Key words

carboxybutyryl chitosan / silk fibroin peptide / oxidized konjac / injectable hydrogel / preparation / biological activity

0　 引 言

可注射水凝胶（injectable hydrogel，IH）是一种流动性聚合物溶液，其状态由溶液转变为凝胶后，可作为敷料与伤口直接接触。近年来，可注射水凝胶因良好的保湿、抗菌和可生物降解等性能而受到广泛关注^［1，2］。可注射水凝胶中水的质量可达到80%~90%，作敷料使用时可保持伤口位点的湿润环境，有利于成纤维细胞迁移和伤口愈合^［3］。此外，可注射水凝胶敷料还可以吸收伤口愈合过程产生的渗出液，降低细菌增殖造成的感染风险^［4］。

天然多糖具有良好的生物相容性，其组成与细胞外基质相似，可以较好地同细胞进行相互作用，是一种极具吸引力的生物医用材料。壳聚糖（chitosan，CS）是一种自然界常见的高分子多糖，具有促进排水、气体交换、组织液渗透等功效，同时具有良好的抗菌性能，被广泛用于制备伤口敷料^［5］。丝素肽（silk fibroin peptide，SFP）是一种具有螺旋型、特殊超微、多级结构的小分子肽，具有良好的透氧和保湿性能，与皮肤有天然亲合性，极易被皮肤组织吸收，被广泛用于皮肤创伤修复领域^［6］。魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）是一种提取自魔芋植物的非离子型水溶性天然多糖，来源广泛，具有高吸水性、增稠性、胶凝性、生物可降解和高生物活性^［7］，已广泛应用于食品加工、化工、生物医学等领域^［8~9］。KGM分子中含有大量活性羟基，可通过改性得到不同功能的魔芋葡甘露聚糖衍生物，应用范围较广^{［10，11］}。Xie等^［12］将羧甲基魔芋葡甘露聚糖（carboxymethyl konjac glucomannan，CMKGM）与壳聚糖交联，制得了具有较高溶胀率、适当水蒸气透过率和良好生物相容性的CMKGM/CS复合海绵，能够促进损伤皮肤的组织再生。Wang等^［13］制备了一种自适应水凝胶敷料，研究发现氧化魔芋葡甘露聚糖（OKGM）的醛基可与质子化壳聚糖，以及质子化氨甲环酸主链上的胺基形成动态共价Schiff键。该水凝胶具有自愈合能力、组织黏附性和抗菌活性，在修复不规则伤口方面有良好的应用前景。

本文利用丝素肽将羧丁酰壳聚糖接枝改性，再以氧化魔芋为交联剂，通过Schiff碱反应制备羧丁酰壳聚糖-丝素肽/氧化魔芋（NSC-SFP/OKGM）水凝胶，利用红外光谱、磁共振氢谱、扫描电镜等技术对水凝胶材料的结构和形貌进行表征，测试了水凝胶材料的凝胶时间、溶胀率、水蒸发率、溶血率，并通过对人皮肤的成纤维细胞体外实验探究了水凝胶材料的生物相容性。

1　 实验部分

1.1　仪器及试剂

仪器：Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱（FT-IR，赛默飞仪器有限公司）；UV1700PC型紫外分光光度计（UV，上海精密科学仪器有限公司）；FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；JSM-IT300型扫描电子显微镜（SEM，日本电子株式会社）；AMX-500型磁共振仪（¹H NMR，Bruker公司）。

试剂：壳聚糖（CS，化学纯）购自国药集团；羧丁酰壳聚糖（NSC）参照文献方法^［14］合成，采用电位滴定法^［15］测得壳聚糖的酰化程度为0.27；丝素肽（SFP，医药级）、转谷氨酰胺酶（MTGase，食品级）均购自武汉华顺生物技术有限公司，并参照文献方法^{［16，17］}纯化；魔芋胶（食品级）购自湖北一致魔芋生物科技股份有限公司；新鲜小鼠血液（添加有少量柠檬酸钠作抗凝处理）由武汉第三医院提供；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；人皮肤成纤维细胞（NS-FB，已传三代）购自北京北纳创联生物技术研究院；其他化学试剂均购自上海国药集团，均为分析纯或更高纯度，使用前未进一步纯化；实验所需溶液均为超纯水配制。

1.2　材料制备

1.2.1　NSC-SFP的制备

羧丁酰壳聚糖-丝素肽（NSC-SFP）的合成如图1所示。按质量比5∶1∶7将NSC、MTGase酶和SFP溶解在50 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中，溶液中反应物的最终浓度均为0.2 mol/L。将溶液转移至250 mL三口烧瓶中，于40 ℃搅拌4 h，升温至100 ℃，继续反应15 min。自然冷却至室温，加入100 mL超纯水，减压抽滤，滤液透析（12~14 ku）3 d，冷冻干燥后制得黄色粉末NSC-SFP，取代度为0.23^［18］。

1.2.2　NSGM的制备

羧丁酰壳聚糖-丝素肽/氧化魔芋葡甘露聚糖（NSC-SFP/OKGM，简称NSGM）系列水凝胶的制备过程如图2所示。取一定量NSC-SFP样品加入到超纯水中，配制质量分数为5%的溶液，于冰箱中4 ℃保存备用。再取一定量OKGM溶解于超纯水中，配制质量分数为5%的溶液。将NSC-SFP和OKGM溶液按照不同体积比（1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1）加入到六孔板中，搅拌均匀，于25 ℃静置24 h，形成水凝胶。根据加入NSC-SFP和OKGM溶液的体积比，将上述水凝胶分别命名为NSGM-1、NSGM-2、NSGM-3、NSGM-4和NSGM-5。NSC-SFP分子中的氨基与OKGM分子中的醛基发生Schiff碱反应。

1.3　性能测试

1.3.1　凝胶时间

采用试管倒置法记录了凝胶时间（gelation time，GT）^［19］。将NSC-SFP和OKGM溶液分别按照体积比1∶0.2，1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1加入到试管中，开始计时。加入过程中持续搅拌，使其混合均匀，直至倒置试管液体不再流动为止，记录凝胶时间。每组实验重复3次，取平均值。

1.3.2　溶胀率

将NSGM样品于-35 ℃冷冻干燥48 h，取出，称其质量（m₁）。将冻干的NSGM浸泡在pH 7.4的PBS溶液中，保持温度37 ℃，每间隔6 h取出，用滤纸吸干表面水分，称其质量（m₂），重复此操作直至溶胀达到平衡。根据（1）式计算NSGM样品的溶胀率（swelling ratio，SR）：

SR=\frac{m_{\mathrm{2}}-m_{\mathrm{1}}}{m_{\mathrm{1}}}×100%（1）

1.3.3　水蒸发率

将NSGM样品于-35 ℃下冷冻干燥48 h，称其质量（m_c），溶胀48 h后，称其质量（m_a），置于37 ℃的恒温水浴箱中，每间隔一段时间后取出再称其质量（m_b）。根据（2）式计算NSGM样品的水蒸发率（water evaporation rate，WER）：

WER= \frac{m_{\mathrm{b}}-m_{\mathrm{c}}}{m_{\mathrm{a}}-m_{\mathrm{c}}}×100%（2）

1.3.4　溶血率

依次将新鲜抗凝小鼠血和5 mL生理盐水加入试管中，摇匀，制得稀释后的抗凝全血，于4 ℃保存。将NSGM样品于-35 ℃冷冻干燥48 h后取出，研磨成粉末。称取25 mg上述NSGM粉末加入离心管中，注入10 mL生理盐水，于恒温箱中37 ℃保温30 min，取出，加入0.1 mL经37 ℃预热的稀释抗凝全血，摇匀，放入恒温箱中，于37 ℃保温1 h后取出，在1 500 r/min转速下离心15 min。取上清液，测其545 nm处的吸光度A₁。在阳性对照中，将生理盐水替换成去离子水，测得吸光度A₂；阴性对照为不加NSGM粉末的生理盐水，测得吸光度值A₃。根据（3）式计算NSGM的溶血率（hemolysis rate，HR）。实验重复3次，取平均值。

HR=\frac{A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{3}}}{A_{\mathrm{2}}-A_{\mathrm{3}}}×100%（3）

1.3.5　生物相容性

1） NSGM浸提液的配制

将冻干NSGM研磨成粉末，平铺于无菌表面皿表面；在灭菌台上紫外灭菌2 h后，将NSGM粉末与培养基按照1∶10（m/V）的比例浸提24 h。使用0.22 μm滤膜过滤除菌，得到NSGM粉末的浸提液，于4 ℃密封保存。

2） 细胞相对存活率的测试

采用CCK-8法测水凝胶的体外细胞相对存活率。其原理是将WST-8（与MTT类似的化合物）还原成甲臜，甲臜的水溶液为橙黄色，细胞增殖越多，橙黄色越深，细胞毒性越小。将置于CO₂恒温培养箱中的96孔板移出（细胞已培养至贴壁），吸出96孔板中的培养基，每孔加入100 μL NSGM浸提液，置于培养箱中培养1 d，取出，吸出NSGM浸提液，每孔加入100 μL新鲜培养基和10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续培养约2 h后，用酶标仪测其450 nm处光密度值OD₁。以细胞悬浮液和培养基作对照组，测定光密度值OD₃，以不加细胞悬浮液的纯培养基作空白对照，测定光密度值OD₂，按照（4）式计算细胞相对存活率（relative cell viability，RCV）：

RCV=\frac{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{1}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{2}}}{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{3}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{2}}}×100%（4）

2　 结果与分析

2.1　表征

图3（a）为CS、NSC和NSC-SFP样品的FT-IR谱图。由CS的谱图可知，3 425 cm^-1处吸收峰为—OH和—NH₂的振动峰；2 924 cm^-1与2 877 cm^-1处吸收峰为—CH和—CH₂—的振动峰，在N-琥珀酰化反应发生后，吸收峰因甲基的引入而明显变宽；1 597 cm^-1处吸收峰为CS链上—NH₂的振动峰。由NSC谱图可知，CS链上—NH₂的振动峰消失，而在1 646 cm^-1和1 571 cm^-1两处新增明显吸收峰为酰胺Ⅰ带—C=O、酰胺Ⅱ带—NH伸缩振动峰；2 970 cm^-1处出现的新峰证实—NH₂发生的酰胺化反应归属于CS的分子链；CS谱图中1 262、1 320 cm^-1处的吸收峰为—OH吸收峰，NSC中的1 070、1 025 cm^-1处吸收峰为伯羟基与仲羟基弯曲振动峰。反应前后，这些特征峰未发生改变，表明CS分子上的—OH未发生反应；1 405 cm^-1处的吸收峰属羧基对称振动峰；而1 720~1 750 cm^-1处未见酯基特征峰，这再次验证其酰胺化反应发生在N-位。进一步分析NSC-SFP的谱图发现，1 648 cm^-1和1 553 cm^-1两处吸收峰差异明显，两者分别为酰胺Ⅰ、Ⅱ带吸收峰，表明NSC是通过酰胺键反应与SFP结合的^［20］。

图3（b）为KGM、OKGM和NSGM-2的FT-IR谱图。由KGM的谱图可知，3 430 cm^-1处特征峰为—OH伸缩振动峰，2 926 cm^-1处特征峰为甲基或者次甲基的C—H伸缩振动峰，1 652 cm^-1处特征峰为乙酰基上C=O键的伸缩振动峰；在OKGM的谱图中出现了两个新峰，分别为1 731 cm^-1处醛基的对称振动峰，890 cm^-1处的半缩醛结构振动收缩峰。这两个新峰证实了醛基的出现，KGM分子的羟基被氧化，OKGM制备成功。在NSGM-2的谱图中，归属OKGM的两个强振动吸收峰（1 731 cm^-1和890 cm^-1）几乎完全消失，说明在制备过程中，醛基被消耗完全。此外，谱图中出现了C=N键的振动伸缩峰（1 641 cm^-1），说明OKGM分子中的醛基与NSC-SFP分子中的氨基产生了交联，形成了复合水凝胶。

图4为NSC和NSC-SFP样品的磁共振氢谱（¹H NMR）。NSC谱图中，δ 1.93 处特征峰为乙酰氨基中甲基的吸收峰；δ 2.32处特征峰为葡萄糖单元中C2—H）；δ 3.50~3.70处特征峰为葡萄糖单元中C3、C4、C5、C6—H的吸收峰；δ 4.50处特征峰为羧丁酰上H的吸收峰。NSC-SFP谱图中除包括NSC中所有特征峰外，因N—CO的受阻旋转，δ 5.26处出现酰胺键上H的吸收峰（旋转异构新峰）。此外，由于SFP的引入，甲基、亚甲基增多，δ 0.9~1.4处出现多个新峰，这进一步说明NSC-SFP已制备成功^［21］。

图5为NSGM-1~NSGM-5的SEM图。由图5（a1）~（e1）可知，NSGM系列水凝胶的孔洞比较均匀，且相对连续。由NSGM-1~NSGM-5的局部放大SEM图（a2）~（e2）可以看出，NSGM的孔壁较厚，整体孔结构比较稳定。NSGM具有通孔结构特征，有利于水分子扩散。同时由于骨架结构牢固，在吸收充足水分后只会溶胀，而不至于破裂。若用于伤口敷料，NSGM将与创面贴合紧密，同时提供优良润湿的愈合微环境，及时、有效吸收伤口渗出液，达到防止感染、快速止血的目的。对比NSGM-1~NSGM-5的SEM图可以看出，5种水凝胶的孔径呈现略微递减的趋势。其原因在于随着OKGM含量的增大，醛基浓度上升，使得NSC-SFP中的氨基可与更充足的醛基结合，反应交联度增加，导致孔径缩小，骨架变得更致密。

2.2　性能

2.2.1　凝胶时间

图6为NSGM系列样品的凝胶时间。由图6可知，NSGM-1~NSGM-5的凝胶时间均小于70 s，满足可注射水凝胶敷料的要求^［1］。NSGM-1~NSGM-5的凝胶时间还表现出先降低后升高的趋势。其中，NSGM-3的凝胶时间最短（35 s）。其原因在于，NSC-SFP和OKGM的反应主要为醛基与氨基的反应，随着OKGM含量的增加（由1∶0.2增加至1∶0.6），聚合反应体系中醛基浓度升高，加快了反应速度，使凝胶时间变短；而当OKGM的含量继续增加（由1∶0.6增加至1∶1）时，体系中醛基的浓度过高，导致氨基的相对浓度偏低，凝胶速度反而变慢，导致凝胶时间增加。

2.2.2　溶胀性能

图7为NSGM的溶胀率。由图7可知，NSGM-1~NSGM-5的溶胀率均大于800%，具有良好的溶胀性能^［2］。对比溶胀率变化情况可发现，NSGM-1、NSGM-2、NSGM-3、NSGM-4和NSGM-5的溶胀率依次变小。其中，NSGM-1的溶胀率最高，达到1 259%。对NSGM而言，随着OKGM含量增加，醛基浓度提高，NSC-SFP的氨基可与更多醛基结合，使得OKGM和NSC-SFP交联程度升高，从而形成更致密的骨架结构，限制自由水进入，进而使可容纳的水分子体积变少，溶胀性能变差^［12］。该结果与NSGM的SEM分析结果一致。

2.2.3　吸水保水性能

表1显示，NSGM-1~NSGM-5在24 h时的水蒸发率均低于86.0%。其中，NSGM-5的水蒸发率最低（78.9%），表明其24 h时后仍可维持21.1%的水分。由表1还可以发现，随着OKGM含量增大，水蒸发率逐渐减小。其原因在于，随着OKGM含量的增加，NSGM内部形成了更为致密的孔洞（图5），使空气对流受限，自由水蒸发速率变缓。

2.2.4　溶血性能

NSGM-1~NSGM-5和小鼠血液接触1 h后，溶血率在0.99%~3.61%范围内，均满足生物材料小于5%的要求^［4］。分析溶血率变化趋势发现，OKGM含量对NSGM的溶血性有一定影响，但未表现出相关性。

2.2.5　生物相容性

图8为NSGM-1~NSGM-5浸提液与NS-FB细胞共培养后的细胞相对存活率。由图8可知，NSGM浸提液的细胞相对存活率与其OKGM含量呈负相关。其中，NSGM-1浸提液的细胞相对存活率最高（99%），NSGM-5浸提液的细胞相对存活率最低（90%），但均远高于生物材料标准（80%）^［20］。细胞相对存活率逐次降低主要是因为：1） OKGM过量时导致残留，溶液中的醛基影响细胞的增殖；2） 随着OKGM含量的增加，NSGM的孔径缩小，对细胞在其内部的迁移和增殖产生不利影响。

3　 结 语

本文利用丝素肽将酰化反应制备的羧丁酰壳聚糖接枝改性，并以氧化魔芋作交联剂，经Schiff碱反应制得一种可注射的羧丁酰壳聚糖-丝素肽/氧化魔芋系列水凝胶。对比传统水凝胶伤口敷料，该系列水凝胶具有35~70 s可调节的凝胶时间，其吸水量最大可达到自身干质量的近12.6倍（溶胀率1 259%），24 h后最多可维持21.1%的水分，同时具有良好的生物相容性，在伤口敷料领域具有潜在的应用前景。

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基金资助

国家自然科学基金(51773161)

湖北省重大专项(2019ABA115)

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