基于CuO@Ag碗状阵列可循环SERS检测黄曲霉毒素

CuO@Ag Microbowl Arrays for Recyclable Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Aflatoxin

摘要

采用气-液界面自组装及限域生长的方法，在铜箔表面生长出CuO碗状阵列，再通过Ag靶物理溅射在其表面形成CuO@Ag碗状阵列。以此CuO@Ag碗状阵列为基底，借助表面增强拉曼光谱（SERS）技术用于黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的检测。结果表明：SERS信号峰强度与AFB₁的对数浓度在1×10^-4~1×10^-14 mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为6.5×10^-15 mol/L。CuO@Ag碗状阵列还可以对其表面的AFB₁分子进行可见光催化降解，实现表面自清洁，最终实现可循环SERS检测AFB₁。

Abstract

CuO microbowl array grew on the surface of copper foil by the method of gas-liquid interface self-assembly and confined growth. Then the Ag target physical sputtering method was used to sputter the Ag nanoparticles onto the CuO microbowl array surface, and finally the CuO@Ag microbowl array was formed. The CuO@Ag microbowl array was used as SERS-active substrate for SERS (surface-enhanced Raman spectroscopy) detection of aflatoxin B₁ (AFB₁). The results showed that there was a good linear relation between SERS signal peak intensity and the concentration logarithm of AFB₁ in the range of 1×10^-4~1×10^-14 mol/L, and the limit of detection (LOD) was 6.5×10^-15 mol/L. Apart from the high sensitive SERS detection, the CuO@Ag microbowl array substrate also possessed the high photocatalytic degradation of the adsorptive analytes-AFB₁, which provided the self-cleaning and recyclability for SERS detection of AFB₁.

Graphical abstract

0　 引 言

黄曲霉毒素（aflatoxin， AF）是自然界常见的一类真菌毒素，是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢产物，广泛存在于粮食作物以及食品加工产品中^{［1， 2］}。黄曲霉毒素是目前人类发现的毒性极强的真菌毒素，对人类和动物的健康有极大的危害。其危害主要表现在抑制生长和降低免疫力，可导致组织器官发生癌变或畸形^{［3， 4］}。目前，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁，AFB₁）污染最为常见，其毒性是砒霜的68倍，是氰化钾的10倍，是黄曲霉毒素中最强的，已被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物^［5］。因此，发展高效、灵敏、准确测定AFB₁的方法对食品安全保障尤为重要。

目前，国内外用于检测AFB₁的方法主要有薄层分析法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法、酶联免疫法等。但这些方法存在一些不足，如薄层分析法样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间长，易受杂质干扰，且难以进行准确的定量分析^［6，7］；高效液相色谱-质谱法灵敏度较高，但试剂和仪器较昂贵，对操作人员的技术要求较高^［6，7］；酶联免疫法灵敏、简便、快速、特异性强，对样品中毒素的净化纯度要求不高，能同时对多个样品进行定性或定量检测，适于毒素的批量检测，但检测结果的重现性差、酶稳定性差、试剂寿命短，而且由于存在交叉反应而易造成假阳性结果，干扰检测结果的准确性^{［8， 9］}。

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一种指纹光谱技术，具有高探测灵敏度、高分辨率等优点，且水干扰小、稳定性好，可实现痕量无损检测，在食品安全检测方面应用广泛^［10~12］。本文利用气-液界面自组装技术以及限域生长方法，在商业铜箔表面形成CuO碗状阵列，并借助物理溅射过程，构筑CuO@Ag碗状阵列结构。将CuO@Ag碗状阵列作为可循环活性基底，借助SERS技术对AFB₁进行检测，希望为食品中痕量AFB₁的检测提供一种经济、高效的方法。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：单分散聚苯乙烯微球（PS， 平均粒径1.12 μm，苏州纳微科技有限公司）、黄曲霉毒素B₁（AFB₁，Sigma-Aldrich公司），铜箔（0.1 mm厚度，苏州福田金属有限公司）使用前用丙酮/乙醇/超纯水体积比1∶1∶1的混合溶剂超声清洗，次氯酸钠（NaClO）、氢氧化钠 （NaOH）、无水乙醇 （EtOH）和丙酮（国药集团），实验用水为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。

仪器：EM SCD005型离子溅射仪（样品室106 mm，Leica显微系统）；SU8020型场发射扫描电子显微镜（FESEM，日立高新技术公司）；EMAX evolution X-Max 80型X射线能谱仪（EDX， HORIBA公司）；DX-2700型X射线衍射仪（XRD，丹东浩元仪器有限公司）；ESCALAB™ Xi⁺型X射线光电子能谱仪（XPS，赛默飞世尔科技有限公司）；in Via Reflex型显微共聚焦激光拉曼光谱仪（Raman，扫描范围100~4 000 cm^-1，光谱分辨率≤ 1 cm^-1，雷尼绍公司）。

1.2　CuO@Ag碗状阵列基底的制备

本工作通过界面自组装技术以及限域生长方法，在铜箔表面构筑CuO@Ag碗状阵列基底材料，具体制备过程如图1所示。首先，将单分散聚苯乙烯微球 （PS microspheres）通过气-液界面自组装（self-assembly）在水液面上形成二维有序PS胶体晶。随后，将二维有序PS胶体晶转移至清洁处理后的铜箔（Cu foil）表面，再经过60 ℃热处理30 min，使PS胶体晶牢固结合在铜箔表面。

将上述铜箔浸入到50 mL NaOH（0.5 mol/L）/NaClO （20%）混合溶液中进行氧化反应。由于NaClO氧化剂分子与铜箔之间的氧化反应主要在相邻PS胶体微球的限域空间中进行，故CuO纳米线只能限域生长在PS胶体微球相邻区域。反应30 min后，取出氧化后的基底材料，用超纯水冲洗3遍，干燥，再放入50 mL CHCl₃中静置50 min，待PS胶体微球被完全溶解后取出，洗涤，干燥，在铜箔表面获得结构有序的CuO碗状阵列。借助离子溅射仪通过Ag靶物理溅射60 s，在CuO碗状阵列结构表面形成了一层Ag纳米颗粒薄膜，获得有序排列的CuO@Ag碗状阵列结构，室温储存。

1.3　SERS检测黄曲霉毒素

将CuO@Ag碗状阵列作为SERS活性基底，对AFB₁进行SERS检测。配制不同浓度（1×10^-4~1×10^-14 mol/L）的AFB₁乙醇溶液，分别取3 mL，将尺寸相同的CuO@Ag碗状阵列基底浸渍其中，10 min后取出，干燥，进行SERS检测（激发光源波长为532 nm，光源强度为1 mW，数据采集时间10 s，样品的干燥和测试过程均在暗室内进行）。每个样品随机选择10个不同的点进行SERS信号采集。

进一步研究了CuO@Ag碗状阵列结构对AFB₁分子的光催化降解性能以及可循环SERS检测性能。取1×10^-8 mol/L AFB₁乙醇溶液3 mL，将CuO@Ag碗状阵列基底浸渍其中，10 min后取出，干燥，进行SERS检测。检测完成后，将负载AFB₁分子的CuO@Ag碗状阵列基底在氙灯可见光（390~780 nm）照下催化降解，30 min后降解完全，再将CuO@Ag碗状阵列基底用超纯水洗涤，干燥，用于AFB₁分子的多次循环SERS检测。

1.4　样品表征

采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）表征CuO以及CuO@Ag碗状阵列基底的表面形貌及结构；采用X射线能谱仪（EDX）表征CuO以及CuO@Ag碗状阵列的组成元素种类及含量；采用X射线光电子能谱（XPS）分析CuO以及CuO@Ag碗状阵列的表面化学成分；采用X射线衍射仪（XRD）表征CuO以及CuO@Ag碗状阵列的成分以及晶体结构；采用显微共聚焦激光拉曼光谱仪表征CuO@Ag碗状阵列对AFB₁的SERS检测信号峰。

2　 结果与讨论

2.1　二维有序PS胶体晶的表征

单分散PS微球通常采用自组装方法形成二维有序胶体晶，用作模板或模具构筑功能有序性阵列结构材料，被广泛应用于催化、传感、光电器件以及检测分析等领域。本研究选用单分散PS微球（平均粒径约1.12 μm）为胶体模板，采用气-液界面自组装方法在水液面上形成二维有序PS胶体晶，并通过模板转移技术，将其转移至铜箔表面，其微观形貌的SEM照片如图2（a）（b）所示。可以看到，PS微球在铜箔表面呈紧密的单层排列，形成了六方紧密堆积的单层胶体晶（monolayer colloidal crystal，MCC），且相邻的PS微球排列存在明显的空间间隙。PS胶体晶的EDX谱图（图2（c））中观察到较强的C和Cu峰，其中C主要来源于PS微球，Cu来源于铜箔基底，同时，其XPS谱图中也出现了Cu 2p、C 1s、O 1s特征峰（图2（d））。因此，可以证明PS微球已在铜箔表面组装形成二维有序胶体晶。

2.2　CuO碗状阵列基底的表征

将上述负载二维有序PS胶体晶的铜箔浸入到NaOH/NaClO的混合溶液中，NaClO分子与铜箔之间的氧化反应主要发生在相邻PS微球的限域空间中，最终导致生成的CuO纳米线在PS微球相邻区域内限域生长。当选用CHCl₃溶解移除PS微球模板后，最终在铜箔表面留下结构有序且连续的CuO碗状阵列，如图3（a）所示。从高倍的SEM图（图3（b））可以看出，每个碗状结构主要是由限域空间中形成的CuO纳米线相互编织堆积而成，每个碗状结构的直径约为1.2 μm，并排列形成连续的阵列结构。CuO碗状阵列的表面化学成分通过EDX表征分析。图3（c）中可以观察到较强的Cu和O的信号峰以及较弱的C信号峰。其中，Cu元素信号峰主要来源于铜箔基底以及CuO纳米线，O主要来源于样品中的CuO纳米线，C元素则可能是由于空气中含碳物质的吸附或微量PS微球的残留所造成。元素Mapping表征结果（图3（d））显示，具有特征性的Cu和O元素均匀地分布在CuO碗状阵列上。上述实验结果表明，铜箔表面已形成了均匀的CuO碗状阵列结构。

为了进一步了解CuO碗状阵列的晶型结构，对其进行XRD测试分析，如图3（e）所示。经分析， 位于43.3°、50.4°和74.1°处的衍射峰分别对应于铜箔基底的（111）、（200）和（220）晶面^［13］，而位于35.5°（002）和38.7°（111）处的特征衍射峰与CuO（JCPDS 80-1917）吻合^［13］，也证实了CuO碗状阵列在铜箔表面成功生成。CuO碗状阵列的表面化学成分以及电子结构的研究分析则通过XPS获得，结果如图3（f）、（g）和（h）所示。图3（f）为XPS全谱，可以清楚地观察到CuO碗状阵列表面Cu，O和C元素的信号。图3（g）中显示了分峰的Cu 2p谱图，其中，位于933.6 eV和953.6 eV处的两个主要峰归属于Cu^{2 +}，也证实了铜箔基底上CuO的存在。此外，O 1s的XPS谱图（图3（h））中，530.1 eV和531.9 eV两处的峰分别归属于铜箔表面生成的CuO和羟基基团（hydroxide），也可以证实CuO的存在。

2.3　CuO@Ag碗状阵列基底的表征

通过物理溅射法，可以在CuO碗状阵列表面沉积上一层Ag纳米颗粒薄膜，最终获得CuO@Ag碗状阵列结构。

如图4（a）（b）所示，CuO@Ag样品保留了CuO碗状阵列结构，其表面未发现明显结构变化。图4（c）的EDX能谱显示，样品表面有Ag元素存在，且相应的XRD谱图（图4（d））也显示，位于38.3°（111），44.5°（200），64.7°（220）和82.0°（222）处的特征衍射峰与Ag（PDF 87-0719）的标准衍射峰完全吻合^［14］，这些实验结果均证实了在CuO碗状阵列表面成功沉积了单质Ag。通过CuO@Ag碗状阵列的元素mapping图（图4（e）），也观察到Ag单质均匀地分布在CuO碗状阵列表面。图4（f）为XPS全谱，可以清楚地观察到CuO@Ag碗状阵列表面出现C 1s，O 1s， Cu 2p，Ag 3d以及Ag 3p（Ag 3p_5/2， Ag 3p_3/2）特征峰。图4（g）显示分峰的Ag 3d谱图，位于373.5 eV（Ag 3d_3/2）和367.5 eV（Ag 3d_5/2）处的两个主要峰相差6.0 eV，也表明样品表面沉积了Ag单质。Cu 2p谱图（图4（h））以及O 1s XPS谱图（图4（i））的存在，也进一步说明CuO碗状阵列基底的存在。此外，通过高倍的SEM观察单个CuO@Ag碗状阵列结构（图5），可以清楚地观察到Ag纳米颗粒紧密地沉积在CuO碗状阵列基底中形成致密的Ag纳米薄膜，经统计，Ag纳米颗粒的平均粒径约为27.5 nm。

2.4　CuO@Ag碗状阵列基底SERS检测黄曲霉毒素

贵金属（如Au、Ag、Cu）纳米结构由于其表面等离子体共振效应能产生大量SERS活性“热点”，故作为SERS基底材料时表现出高活性。但这些金属纳米粒子的无规聚集以及活性“热点”的无序分布，会导致贵金属纳米结构基底材料的SERS检测信号重现性差^{［15，16］}。相对于贵金属纳米结构基底，CuO@Ag碗状阵列基底表面具有周期性有序等离子体共振结构，可以产生众多均匀分布的SERS检测活性“热点”，对吸附在表面的目标分子表现出高灵敏度的SERS检测活性以及优异的SERS信号重现性^{［17， 18］}。而且，借助CuO自身的可见光催化降解性能^［19］，可以对SERS检测后残留在基底表面的目标分子实施可见光降解，实现CuO@Ag碗状阵列基底表面的自清洁，循环用于目标分子的SERS检测。CuO@Ag碗状阵列基底可循环SERS检测黄曲霉毒素的示意图见图6。

本研究选用AFB₁为目标分子，考察了CuO@Ag碗状阵列作为SERS活性基底进行可循环检测AFB₁的性能。如图7（a）所示， 在AFB₁的拉曼光谱中，995 cm^-1（β（C—O），ν（C—C）），1 187 cm^-1（γ（C—H）（ring）），1 356 cm^-1（δCH₃），1 440 cm^-1（β（C—H）（CH₃），β（C—H）（ring）），1 592 cm^-1 （ν（C—C）和ν（C—C—C））处均观察到明显的AFB₁特征拉曼信号峰^{［20， 21］}。以不同浓度（1×10^-4~1×10^-14 mol/L）的AFB₁作为目标分子对CuO@Ag碗状阵列基底的SERS检测灵敏性进行了评估。SERS测试结果表明：随AFB₁浓度减小，其拉曼峰强度明显降低，当AFB₁浓度低至1×10^-14 mol/L时，仍然可以收集到明显的AFB₁拉曼信号峰，说明CuO@Ag碗状阵列基底对AFB₁具有优异的拉曼检测性能。选择1 592 cm^-1处拉曼信号峰的强度与AFB₁浓度的变化进行线性拟合作图，从图7（b）中可以看出，拉曼特征峰信号强度与AFB₁的对数浓度之间存在良好的线性关系，在1×10^-4~1×10^-14 mol/L范围内，满足回归方程I=2.84 lg［c/（mol/L）］+40.285，判定系数R²=0.900 0。通过计算可知，CuO@Ag碗状阵列基底SERS检测AFB₁分子的检出限为6.5×10^-15 mol/L。

选用浓度1×10^-8 mol/L的AFB₁为目标分子，考察了CuO@Ag碗状阵列基底对AFB₁分子SERS检测信号的均一性及重现性。在SERS基底表面随机选取20个检测点（在相同条件下制备4个样品，每个样品上随机选取5个点）采集拉曼信号，测试结果（图7（c））表明，每个测试点的拉曼信号峰及峰强度均未出现明显的差异。对每个SERS谱图中1 592 cm^-1处峰强进行统计，结果（图7（d））显示，其相对标准偏差（RSD）为8.1%，检测信号峰强度波动较小。上述结果进一步说明CuO@Ag碗状阵列作为SERS基底保持了良好的结构完整性和成分均一性，对目标分子的SERS检测信号具有较好的均一性和重现性。

2.5　CuO@Ag碗状阵列基底的可循环使用性能

首先考察了CuO@Ag碗状阵列基底的光催化活性。如图8（a）所示，当初始浓度为1×10^-8 mol/L的AFB₁吸附到CuO@Ag碗状阵列基底表面，能够呈现出明显的SERS特征峰；随着持续的可见光光照，AFB₁分子逐渐被分解，其特征峰强度持续降低；当可见光光照30 min后，拉曼光谱几乎无法检测到AFB₁分子的存在，其特征峰强度几乎为零。上述结果表明，CuO@Ag碗状阵列基底具有较高的光催化降解活性，能够有效实现基材表面的自清洁，与文献［19， 22］结论一致。CuO@Ag碗状阵列基底具有光催化降解活性主要是由于在可见光光照条件下，CuO表面被激发产生光生电子-空穴对，可以进一步与环境中的O₂和H₂O分子发生反应生成高活性物质，如超氧阴离子自由基（O₂^•-）和羟基自由基（·OH）^［19］，从而光催化降解吸附在其表面的AFB₁分子，实现自清洁。利用这种自清洁效应，CuO@Ag碗状阵列基底可以实现可循环SERS检测目标分子。其次考察了CuO@Ag碗状阵列基底的可循环使用性能。如图8（b）（c）所示，将CuO@Ag碗状阵列基底对AFB₁（1×10^-8 mol/L）进行5次循环SERS检测，发现随着检测次数的增加，AFB₁分子的拉曼特征峰强度略有下降，第5次SERS检测时特征峰强度相比于第1次下降了约20%。上述实验结果表明，CuO@Ag碗状阵列基底不仅具有自清洁性能，还具有可循环SERS检测性能，可以实现目标分子可循环SERS检测。

3　 结 语

本文以CuO@Ag碗状阵列为SERS活性基底，建立了可循环SERS检测黄曲霉毒素的新方法。通过研究发现，CuO@Ag碗状阵列基底能够对AFB₁实现快速、灵敏、准确地检测分析。SERS信号强度与AFB₁的对数浓度在1×10^-4~1×10^-14 mol/L范围内呈良好的线性关系（线性方程I=2.84 lg［c/（mol/L）］+40.285），判定系数R²=0.900 0，检出限为6.5×10^-15 mol/L。而且，该CuO@Ag碗状阵列SERS基底具有自清洁能力，能够对吸附在其表面的AFB₁分子进行光催化降解，实现可循环SERS检测。这种可循环SERS检测方法快速、灵敏，还可以节约检测成本，可望用于食品中痕量黄曲霉毒素的分析。

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