非共价键法构筑C₆₀-Py-GO用于光热和光动力疗法

Non-Covalent Functionalization of C₆₀-Py-GO for Photothermal and Photodynamic Therapy

摘要

光热疗法和光动力疗法是有潜力的癌症治疗方法。氧化石墨烯（GO）具有光热活性，可用于光热疗法；富勒烯（C₆₀）则可用作光动力疗法的光敏剂。将GO和C₆₀有效结合在同一个纳米平台中可以呈现出光热和光动力联合治疗效果。本文通过π-π非共价键相互作用将聚乙二醇氧化石墨烯衍生物（PEG-GO）与富勒烯芘衍生物（C₆₀-Py）结合，构建了水溶性的C₆₀-Py-GO纳米体系。实验结果表明：在808 nm激光和可见光照射下，C₆₀-Py-GO纳米体系使人宫颈癌细胞（Hela细胞）的存活率降低至20.7%，呈现出光热和光动力协同效果。

Abstract

The photothermal therapy (PTT) and photodynamic therapy (PDT) has been developed recently as a promising way to treat cancer. Graphene oxide (GO) has been used as photothermal therapy due to its photothermal activity and fullerene (C₆₀) has been used as photosensitizer for PDT. Combing both GO and C₆₀ in one nanoplatform can present PTT and PDT effects. In this paper, a water soluble C₆₀-Py-GO nanosystem was prepared by a simple way via noncovalent π-π interaction between the C₆₀-pyrenen （C₆₀-Py） and PEG-GO. Experimental results show that the C₆₀-Py-GO nanosystem exhibits combining photothermal and photodynamic effects and leading to the viability of human cervical cancer cell (Hela cell) decreased to 20.7% upon 808 nm laser and visible light.

Graphical abstract

关键词

碳材料 / 氧化石墨烯 / 富勒烯 / 光热疗法 / 光动力疗法

Key words

carbon material / graphene oxide / fullerene / photothermal therapy / photodynamic therapy

0　 引 言

癌症已逐渐成为危害人类生命健康的重要问题之一。纳米技术及生物医学的进步，使得纳米功能材料在癌症治疗中受到越来越多的关注。光热疗法（photothermal therapy，PTT）和光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)具有微创、低毒，收效快、选择性高，重复应用不会产生耐药性、不破坏正常组织,并可与其他治疗方法联合应用等优点，已成为癌症治疗研究领域的热点之一^[1]。光热疗法主要利用光热剂将光能转化为热能，然后依靠热量消融肿瘤而不损害正常组织。光热剂主要包括无机纳米材料类和有机纳米材料类^[2~5]。与光热疗法不同，光动力疗法主要使用具有光活化作用的光敏剂，将吸收的能量转移到邻近分子氧上产生活性氧物质（ROS），尤其是具有细胞毒性的单线态氧（¹O₂）。在光激发下，¹O₂可对患病细胞和肿瘤组织造成不可逆破坏^[6，7]。与单一光疗技术相比，将两种光疗技术相结合可体现出协同作用，并提高治疗准确性和治疗效率^[8~10]。

近年来，具有近红外光吸收性质和良好机械性能的氧化石墨烯（GO）引起了人们极大的研究兴趣^[11，12]。GO具有单原子厚度和较大的π共轭体系，可以用作分子组装或π电子体系多功能纳米平台，应用于体外和体内光热治疗。然而，GO可能会抑制¹O₂的产生，进而阻碍GO在光动力治疗中的应用^[13]。因此，构建一种基于GO而不影响¹O₂生成的纳米体系对于肿瘤治疗有重要的研究意义。

富勒烯（C₆₀）是碳的同素异形体，因具有低毒性、高比表面积、易表面功能化和较高的¹O₂产率而被广泛应用于光动力疗法^[14]。Hu等^[15]利用聚多巴胺（PDA）包裹GO形成PDA-rGO，再借助Schiff碱反应/ Michael加成反应，以共价键方式引入叶酸-C₆₀衍生物构筑C₆₀-PDA-rGO纳米杂化物，该体系表现出光动力和光热协同治疗癌细胞的作用。然而，该纳米杂化物中的C₆₀和GO均存在水溶性较差等缺点。为了解决水溶性问题，Li等^[16]经过多步反应在GO表面接枝聚乙二醇（PEG），再接枝乙二胺，暴露出氨基，然后将C₆₀衍生物与裸露氨基结合构成水溶性的GO-C₆₀纳米杂化体系，该体系展现出一定的光热和光动力治疗效果。但上述水溶性GO-C₆₀纳米杂化体系的制备过程较繁复，且共价键修饰的GO会破坏石墨烯原始的共轭结构，并对其性质产生不利影响。非共价键结合法可有效避免上述问题^[17]。芘（pyrene，Py）的多环芳香化合物结构是一种常用的非共价键连接基团，可与GO发生π-π非共价键相互作用，实现GO表面功能化。此外，非共价键结合法还可以有效维持GO表面碳原子sp²杂化固有的电子结构^[18，19]。

本研究借助C₆₀-Py与PEG-GO之间的π-π相互作用，以非共价键构筑水溶性C₆₀-Py-GO纳米体系，并探讨了该体系对癌细胞的光热和光动力联合治疗效果。图1为C₆₀-Py-GO的合成和光热效应、光动力效应示意图。

1　 实验部分

1.1　试剂与仪器

试剂：C₆₀（分析纯，苏州大德碳材料有限公司）；碘（分析纯）、H₂SO₄（分析纯）、高锰酸钾、H₂O₂溶液（北京化工厂）；人宫颈癌HeLa细胞株（上海中科院细胞库）；聚乙二醇2000（PEG-2000）、1-芘丁酸、丙二酰二氯、吡啶、LiAlH₄（安耐吉化学）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7. 4，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）；其他化学试剂均为化学纯或分析纯试剂，无需纯化直接使用；合成过程使用的溶剂通过蒸馏纯化；实验用水为去离子水。

仪器：PL-X500D氙灯（配置300~700 nm滤光片，北京普林塞斯科技有限公司）；MW-GX-808/1-5000 mW激光器（长春镭仕光电科技有限公司）；Win-IR型傅里叶红外光谱仪（FT-IR，BIO-Rad公司）；NanoBrook 90Plus动态光散射仪（DLS，Brookhaven 公司）；Perkin-Elmer-TGA 热分析系统（TGA，Perkin-Elmer公司）；Avance 400 MHz型磁共振仪（¹H NMR、¹³C NMR，Bruker公司）；Autoflex Ⅲ TOF/TOF型质谱仪（HR-MS，Bruker公司）；UV-3600型分光光度计（UV-Vis，Shimadzu公司）；SPI 3800N型探针台（AFM，Seiko公司）；JEM-1011型透射电子显微镜（TEM，JEOL公司）。

1.2　实验方法

1.2.1　C₆₀-Py的制备

化合物C₆₀-Py的合成路线如图2所示。

化合物1的合成：氮气保护下，将LiAlH₄的无水四氢呋喃（THF，2.50 g，65 mmol）溶液滴加到冰浴冷却的1-芘丁酸（2.00 g，6.9 mmol）的无水THF（100 mL）溶液中，滴毕，回流反应过夜。用水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，取有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶色谱柱（石油醚/乙酸乙酯体积比：10/1）纯化得淡绿色固体（化合物1），产率95.2%；磁共振氢谱（¹H NMR，CDCl₃，400 MHz）化学位移值δ：8.27（d，J=10.8 Hz，1H），8.17（d，J=2.4 Hz，1H），8.15（d，J=2.4 Hz，1H），8.11~8.09（m，2H），8.02~7.96（m，3H），7.87（d，J=9.6 Hz，1H），3.73~3.68（m，2H），3.40~3.35（m，2H），1.99~1.90（m，2H），1.79~1.71（m，2H），1.34（s，1H）；磁共振碳谱（¹³ C NMR，CDCl₃，100 MHz）δ:136.58，131.35，130.83，129.71，128.52，127.44，127.13，126.50，125.72，125.00，124.95，124.77，124.70，124.61，123.30，62.42，33.11，32.45，27.84。

化合物2的合成：将化合物1（1.00 g，3.6 mmol）、丙二酰二氯（0.291 g，2.0 mmol）和吡啶（0.537 g，6.8 mmol）溶于20 mL CH₂Cl₂中，氮气保护下回流反应过夜。冷却至室温，用水淬灭反应，将反应液倒入0.5 mol/L盐酸中，用二氯甲烷萃取，取有机相依次用饱和Na₂CO₃溶液和去离子水洗涤，用Na₂SO₄干燥后经硅胶柱色谱（二氯甲烷/乙酸乙酯体积比：49/1）分离得到白色化合物2,产率36.4%; ¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ：8.16 (d，J=9.2 Hz，2H)，8.14~8.11(m，4H)，8.07(d，J=2.0 Hz，2H)，8.02(s，2H)，7.98~7.93(m，6H)，7.75(d，J=7.6 Hz，2H)，4.14(t，J=12.8 Hz，4H)，3.36 (s，2H)，3.26 (t，J=15.2 Hz，4H),1.84 (m，4H)，1.74 (m，4H); ¹³C NMR (CDCl₃，100 MHz)δ：166.62，135.92，131.45，130.56，129.59，128.43，127.45，127.26，127.12，126.30，125.79，124.87，124.75，124.43，123.02，65.10，41.79，32.56，28.31，27.90。

化合物C₆₀-Py的制备：将C₆₀（0.108 g，0.15 mmol）、化合物2（0.103 g，0.17 mmol）、I₂（0.093 0 g，0.37 mmol）和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU，0.154 g，1.01 mmol）溶于30 mL无水甲苯中，氮气保护下于室温搅拌反应12 h，反应液冷却至0 ℃，倒入去离子水中，用二氯甲烷萃取，取有机相经硅胶柱层析（甲苯/石油醚体积比：10/1）纯化得C₆₀-Py，产率56.3%；¹H NMR (CDCl₃,400 MHz) δ: 8.16(d,J=9.6 Hz,2H),8.09(d,J=7.6 Hz,4H),8.03(d,J=8.4 Hz,4H),7.96(s,4H),7.93~7.91(m,2H),7.74(d,J=8 Hz,2H),4.43(m,4H),3.28(m,4H),1.85(m,8H); ¹³C NMR (CDCl₃,100 MHz) δ: 163.89,144.99,144.68,144.49,144.27,143.56,143.05,142.66,141.83,141.53,140.58,138.74,137.82,136.02,131.46,130.84,129.96,128.56,127.40,127.12,126.82,126.20,127.91,124.81,66.70,32.51,29.77,28.41; HR-MS(EI) m/z: C₁₀₃H₃₄O₄理论值1 334.346 9，实验值1 334.230 4; 元素分析C₁₀₃H₃₄O₄: 理论值C 92.6、H 2.55，实验室 C 83.23、H 2.46。

1.2.2　PEG-GO的合成

根据文献方法合成PEG-GO^[20]。冰浴条件下，将3.00 g石墨薄片和400 mL浓H₂SO₄在1 L圆底烧瓶中搅拌10 min，缓慢加入3.00 g KMnO₄（约30 min），混合液立即变为深绿色。每间隔24 h向混合液中加入3.00 g KMnO₄，共加3次，待反应结束后，取120 mL（约180 g）反应液倒入300 mL冰水中，缓慢加入2 mL H₂O₂，溶液由深紫色变为黄色，以4 400 r/min离心10 min，用去离子水清洗，再用异丙醇纯化直至溶液pH值为中性。使用MwCO透析管(3 500)在异丙醇中透析3 d,以10 000 r/min离心30 min，收集固体成分，减压蒸发去除异丙醇得GO（1.12 g）。将100 mL GO（3.33 mg/mL的水溶液）超声处理10 min，加入2.00 g PEG 2000，于120 ℃加热搅拌24 h，制得PEG-GO。

1.2.3　C₆₀-Py-GO的制备

将50 mL PEG-GO（2.67 mg/mL的水溶液）与10 mL C₆₀-Py（2.00 mg/mL的甲苯溶液）混合，超声40 min至混合均匀，再于60 ℃剧烈搅拌除去甲苯得到C₆₀-Py-GO水溶液。在进行细胞实验前，将C₆₀-Py-GO放入透析袋中透析，每6 h换水一次，透析2 d。

1.2.4　光热处理

在96孔板内，将Hela细胞以每孔1.00×10⁴个的密度种在200 μL的DEME培养基中，在37 ℃，5% CO₂ 条件下培养24 h。吸出培养基并用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）将细胞清洗3次，再加入180 μL新鲜培养基和20 μL不同浓度的C₆₀-Py-GO溶液，确保不同孔内C₆₀-Py-GO的浓度呈梯度分布。分别用808 nm激光（1~3 W）、可见光（300~700 nm可见光）以及双光源照射细胞5 min，用噻唑蓝（MTT）法测定细胞存活率，考察C₆₀-Py-GO的光热/光动力治疗效果。

2　 结果与讨论

2.1　C₆₀-Py-GO的表征

图3为各样品的透射电镜（TEM）图和原子力显微镜（AFM）图。通过TEM图片可以看出，C₆₀-Py-GO（图3(a)）中在薄片板上分布有较均匀的纳米簇点，和文献［16］中C₆₀-GO的TEM图的特征形态一致；GO（图3(b)）和PEG-GO（图3(c)）呈现有褶皱的薄片状且没有团簇点，而C₆₀-Py图3(d)呈现较明显的团聚形貌。通过AFM图片可以看出，C₆₀-Py-GO（图3(e)）和PEG-GO（图3(g)）的边界较模糊，而GO（图3(f)）边界较为清晰，与文献[21]中PEG-GO的AFM图形貌相近，因此推测这种现象是PEG对GO表面包裹造成的。

图4(a)为各样品水溶液的动态光散射图。对比3个体系粒径分布曲线的峰值，GO峰值粒径为345 nm，PEG-GO峰值粒径为225 nm，C₆₀-Py-GO峰值粒径为170 nm。PEG-GO体系的粒径明显小于GO的原因主要是，GO经PEG修饰后，PEG对GO片层间的范德华力和氢键的弱化作用有利于GO片层的剥离与延展以及阻止GO的聚集，从而增强了其分散性^[22，23]。而与PEG-GO相比，C₆₀-Py-GO粒径更小，可能与此体系在合成过程中经过了更长时间的超声振荡，增强了其在水中的分散性有关。此外，通过图4(b) C₆₀-Py-GO水溶液放置7 d前后的照片可以看出，该体系在放置7 d后分散性良好，未出现明显的团聚现象，表现出较好的稳定性。

图5(a)为GO, PEG-GO,C₆₀-Py和C₆₀-Py-GO的红外光谱图（FT-IR）。GO的谱图中，O—H、C=O和C=C的特征吸收峰分别位于3 400、1 733、1 620 cm^-1处。与GO相比，PEG-GO在2 900 cm^-1处出现了一个新的吸收峰，归属为PEG中—CH₂—的振动峰，该峰的出现表明PEG-GO合成成功^[24]。C₆₀-Py-GO谱图中除具有PEG-GO的特征峰外，在527 cm^-1和1 424 cm^-1两处还出现了C₆₀的典型特征峰^[15]。综合上述分析可知，C₆₀-Py和PEG-GO形成了C₆₀-Py-GO结构体。图5(b)为GO和C₆₀-Py-GO的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱。C₆₀-Py-GO谱图在220 nm处的吸收峰为GO的特征吸收峰，在图5(b)的插图中可以观察到在270 nm和350 nm处的两个弱吸收峰，来源于水溶性较差的C₆₀-Py ^[25，26]。上述实验结果也证实了C₆₀-Py-GO制备成功。

图6为各样品的热重分析曲线（TGA）。其中GO在低于100 ℃的热失重归因于水分的蒸发，160 ℃处显著的热失重归因于GO表面含氧官能团的热分解^[27]。PEG-GO中200 ℃附近的热失重归因为GO，250~420 ℃阶段的热失重为PEG ^[28]。因C₆₀在700 ℃下几乎不分解^[29]，故C₆₀-Py在200~400 ℃间的热失重归因于Py基团^[30]。C₆₀-Py-GO的TGA曲线与PEG-GO相似，可以证实此体系中GO和PEG的存在，但在200~400 ℃间C₆₀-Py-GO的失重率比PEG-GO多出2.91%，是由体系中少量Py基团的失重所导致，因此说明此体系中含有Py基团。以上结果进一步证实C₆₀-Py-GO制备成功。

2.2　C₆₀-Py-GO的光热/光动力效应

2.2.1　光热效应

图7(a)(b)为C₆₀-Py-GO浓度和激光功率对C₆₀-Py-GO溶液光热效应的影响。通过图7(a)可以看出，使用功率为2 W的808 nm激光照射纯水10 min后，水的温度从27 ℃升高至31 ℃，未发生显著性变化；而使用功率为2 W的808 nm激光照射C₆₀-Py-GO溶液10 min后，C₆₀-Py-GO溶液升温效果明显，且随着C₆₀-Py-GO浓度的增加升温效果更加显著，尤其是3.00 mg/mL体系的温度从27 ℃升高至51 ℃。通过图7(b)可以看出，C₆₀-Py-GO溶液的升温效果随着激光功率的增加更加显著，当激光功率为3 W时，C₆₀-Py-GO溶液（3.00 mg/mL）的温度甚至可升高至59 ℃。上述实验现象表明，单位体积的C₆₀-Py-GO溶液可以吸收更多光能并将其转化为更多的热能，显著升高体系的温度。这一性能使其有望作为光热剂用于癌症的治疗。

通过（1）式和（2）式计算C₆₀-Py-GO纳米体系的光热转换效率^[31]。

\eta =\frac{hS(\mathrm{\Delta }{T}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x},\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{x}}-\mathrm{\Delta }{T}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x},{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}})}{I(\mathrm{1}-{\mathrm{10}}^{-A_{\mathrm{808}}})}（1）

hS=\frac{\sum _i{m}_i{C}_{p,i}}{{\tau }_{\mathrm{s}}}（2）

其中，η（%）代表光热转换效率，h（W/（m²·℃））为热传导系数，S(m²)为样品池表面积，\mathrm{\Delta }{T}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x},\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{x}}(℃)为溶液体系平衡温度与环境温度的差值（24 ℃），\mathrm{\Delta }{T}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x},{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}}(℃)为纯水的平衡温度与环境温度的差值（4 ℃）,I(W)为激光功率（2 W）,A_{808 nm}为C₆₀-Py-GO在808 nm处的吸光度（0.32）,m_i （g）为样品质量（1 g），C_p,i (J/g)为水的比热容（4.2 J/g），τ_s(s)为采样系统时间常数。

图8(a)为C₆₀-Py-GO在(808 nm，2 W)激光照射及停止照射的光热响应曲线，将图8(a)中的降温时间与驱动力温度负对数（-ln θ）作图得到图8(b)，通过图8(b)可得τ_s=212 s。将τ_s 代入（2）式计算hS=0.019 8 W/^oC，再将hS代入（1）式计算出C₆₀-Py-GO光热转换效率η为37.9%。

2.2.2　光动力效应

可见光照射C₆₀后产生的¹O₂可以有效降低4-亚硝基-N，N'-二甲基苯胺（RNO）在440 nm处产生的吸光度^[13]，因此选用RNO作为生成¹O₂的指示剂，以RNO在440 nm处的吸光度指示¹O₂的浓度。图9为GO、PEG-GO、C₆₀-Py-GO随着光照时间变化产生¹O₂的情况。可以看出，C₆₀-Py-GO经过可见光照射30 min，在440 nm处的吸光度为0.718，呈现出明显的下降趋势，而GO和PEG-GO在相同条件下吸光度未发生明显变化，表明C₆₀-Py-GO经过可见光照射后生成了¹O₂。此前曾有GO抑制¹O₂生成的报道^[32，33]，但本文结果表明，采用非共价键结合方式构建的C₆₀-Py-GO纳米体系能够有效生成¹O₂。

2.3　C₆₀-Py-GO的光热/光动力治疗效果

采用MTT法检测了C₆₀-Py-GO体系对Hela细胞的光热/光动力治疗效果。如图10(a)所示，在无光源照射时，C₆₀-Py-GO体系对Hela细胞无明显毒性，表明C₆₀-Py-GO体系具有良好的生物相容性。当在808 nm激光照射下，C₆₀-Py-GO体系（140 μg/mL）利用其光热效应可使Hela细胞存活率降至27.6%；当在可见光照射时，C₆₀-Py-GO体系（140 μg/mL）利用其光动力效应可使Hela细胞存活率降至56.5%；而在808 nm激光和可见光同时照射下，C₆₀-Py-GO体系由于光热和光动力的共同作用，可以杀死更多的Hela细胞，使其存活率降至20.7%。通过与PEG-GO体系（图10(b)）进行对照，在同样实验条件下，PEG-GO仅展示出光热效应，而无光动力效应。这意味着在808 nm激光和可见光同时照射下，C₆₀-Py-GO体系可以表现出光热和光动力联合治疗效果。

3　 结 语

本研究以更加简便、快速、温和的π-π非共价键相互作用，将C₆₀-Py与PEG-GO结合构筑水溶性的C₆₀-Py-GO纳米体系。该体系基于GO在808 nm激光照射时的光热效应，能够实现光热治疗效果，同时基于C₆₀在可见光照射下生成¹O₂，能够实现光动力治疗效果。在808 nm激光和可见光同时照射下展现出光热和光动力联合治疗效果，可以有效地降低Hela细胞的存活率。此外，该体系还具有较好的稳定性。该项研究表明，C₆₀-Py-GO纳米体系具有潜在的应用价值，可进一步开展将其用于杀死其他肿瘤细胞的效果研究。

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基金资助

吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20181294KJ)

吉林省教育厅科学技术项目(JJKH20211018KJ)