TCEP与CTAB对好氧污泥生化指标的影响分析

Effect of TCEP and CTAB on Biochemical Indexes of Aerobic Sludge

摘要

以三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP）与十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为研究对象，分析了两种污染物对污水处理厂好氧污泥脱氢酶活性和耗氧速率的影响。结果表明：TCEP和CTAB对脱氢酶活性的半最大效应浓度（EC₅₀）分别为9.20×10^-11 mol/L和5.30×10^-7 mol/L；对耗氧速率的最大抑制率分别为83.65%和12.21%。鉴于组分毒性终点值差别较大，采用等毒性配比法分析了TCEP-CTAB混合体系对脱氢酶活性的影响，获得酶活性抑制区间的联合效应EC₅₀分别为8.30×10^-11 mol/L与3.26×10^-6 mol/L。进一步对TCEP-CTAB混合体系毒性作用类型进行评价，结果均显示为拮抗作用。相对于污泥耗氧速率，污染物对脱氢酶活性产生的胁迫响应幅度大、灵敏度高，可推荐该指标作为监控污染物对处理工艺的敏感指标。

Abstract

The toxic effects with dehydrogenase activity and oxygen consumption rate in the aerobic sludge of sewage treatment plant were analyzed under the exposure stress of the tris (2-chloroethyl) phosphate (TCEP) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). The results show that the concentration for 50% of maximal effects (EC₅₀) of TCEP and CTAB on dehydrogenase activity are 9.20×10^-11 mol/L and 5.30×10^-7 mol/L, and the maximum inhibitory rates of oxygen consumption rate are 83.65% and 12.21%, respectively. Considering the larger gape between toxicity endpoint values of components, the effect of TCEP-CTAB binary mixed system on dehydrogenase activity was analyzed by the isotoxicity ratio method, and the EC₅₀ of TCEP-CTAB binary mixture on dehydrogenase activity were 8.30×10^-11 mol/L and 3.26×10^-6 mol/L. The types of toxic effect of the binary mixture system was evaluated, and the results showed that they all exhibited consistently antagonism effect. Furthermore, it was found that the stress response of pollutants to dehydrogenase activity was larger and more sensitive. The index could be recommended as a sensitive index to monitor the adverse effects of pollutants on treatment process.

Graphical abstract

关键词

三（2-氯乙基）磷酸酯（TCEP） / 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） / 好氧污泥 / 生化指标 / 联合效应

Key words

tris (2-chloroethyl) phosphate / cetyltrimethylammonium bromide / aerobic sludge / biochemical index / combined effect

0　 引 言

好氧污泥可降解污染物质、减轻水体污染负荷、确保生态系统的稳定性，常用于城市污水处理^[1]。污水处理效果与污泥中的微生物代谢活性有直接关系，而微生物代谢活性与污泥中的各种功能酶（如脲酶、转化酶、脱氢酶、酯酶、漆酶等）密切相关^[2，3]。脱氢酶是生物氧化代谢过程中综合反映微生物活性的一种氧化还原酶，可作为反映微生物代谢活性和表征污染物降解程度的关键指标^[4，5]。目前的研究大多从化学维度出发，聚焦于污染物在环境中的分布水平和污水处理工艺对污染物的去除效果以及污染物的降解机制，较少关注从生物维度研究污染物对污水处理工艺过程稳定性的影响和风险预警。

新污染物是指新近发现或被关注，但尚未纳入管理或现有管理措施不足以有效防控其不利风险的污染物^[6]。面对新污染物对污水处理工艺稳定性带来的挑战，研究其对生物指标的影响对污染物风险防控具有重要意义。常见的新污染物包括有机磷酸酯类衍生物、全氟化合物和环境内分泌干扰物等。这类新污染物对生物具有神经毒性、生殖毒性和内分泌干扰毒性。有机磷酸酯（organophosphate esters，OPEs）具有良好的阻燃性能，可作为阻燃剂和增塑剂^[7，8]，应用于电子产品、纺织品和家具等行业。根据结构的不同，OPEs可分为烷基类、芳基类和氯代类。三(2-氯乙基)磷酸酯（TCEP）是一种氯代类OPEs，在环境中稳定性好、残留水平高，难以降解，易在生物体内富集，从而对生物基因和细胞造成损伤^[9~11]。表面活性剂具有良好的润湿、乳化、增溶等作用，作为合成洗涤剂、消泡剂、防水剂等的助剂，广泛应用于石油、医药和日化品等行业。根据溶于水后的解离情况及离子类型，常见表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、非离子型和两性表面活性剂。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）属于阳离子表面活性剂，对水生动植物具有毒性效应，易造成慢性或半致死以及破坏蛋白等危害^[12，13]。

本文选择市场消费水平高、环境残留浓度高、环境检出率高的TCEP和CTAB，研究了两种新污染物对污水处理工艺中好氧污泥生化指标的影响，可望为新污染物风险管控提供基础数据。

1　 实验部分

1.1　仪器与试剂

仪器：UV-1000型分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；THZ-B型台式恒温振荡器（常州诺基仪器有限公司）；TDZ5-WSD型多管架自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HI9146型溶解氧测定仪(北京哈纳科仪科技有限公司)；5B-6D（V8）型氨氮测定仪（连华科技有限公司）。

试剂：TCEP甲苯溶液（100 mg/L，百灵威科技有限公司）、CTAB（北京奥博兴生物技术有限公司）、甲醛、丙酮（分析纯，上海国药有限公司）、氨氮测定试剂（连华科技有限公司），好氧污泥取自大连市某污水处理厂的好氧曝气池。

污泥悬浮液配制：取100 mL污泥液（约2.7~3.1 g/L）放入锥形瓶中，加入数粒玻璃珠剧烈摇动将污泥打碎，取50 mL于4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用去离子水洗涤、离心，重复3次，最后用去离子水补至原体积，并混匀使污泥达到均质。

1.2　耗氧速率和氨氮的测定

1.2.1　耗氧速率

采用密闭间歇曝气法^[14]测定耗氧速率。将污泥与不同浓度梯度的污染物以体积比100∶1的比例混合并曝气3 h。测定时取泥水混合物，充气，直至溶解氧浓度达到约8 mg/L，将溶解氧测定仪的探头插入三角烧瓶中，用穿孔的橡胶塞密封，使用磁力搅拌器将污泥混合均匀。待稳定后，每30 s记录一次仪器示数，直至溶解氧浓度降至2 mg/L以下。绘制溶解氧时间曲线，曲线斜率为污泥耗氧速率。每个样品重复测定3次，相对标准偏差控制在7.8%以内。

1.2.2　氨氮

采用纳氏试剂分光光度法^[15]测定氨氮。取7个氨氮比色管分别加入待测样上清液10 mL（空白对照加入10 mL蒸馏水），依次加入LH-N₃试剂1 mL，LH-N₂试剂1 mL，摇匀，静置10 min，在氨氮仪上进行检测。平行测定3组，相对标准误差不超过8.3%。

1.3　脱氢酶活性的测定

1.3.1　单一毒性测定

采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法^[16]测定污泥脱氢酶活性。将污泥分别与不同浓度梯度污染物溶液以体积比100∶1混合制备污泥悬浮液。TCEP和CTAB的浓度范围分别为0~70 ng/L和0~1 mg/L，浓度梯度分别为10 ng/L和0.2 mg/L。测定时取两个25 mL具塞离心管，向各管中依次加入Na₂S溶液0.5 mL、Tris-HCl缓冲液2.0 mL、污泥悬浮液2 mL、0.4%TTC液0.5 mL（对照组加入0.5 mL去离子水），密闭并摇匀，立即于37 ℃水浴反应10 min，加入0.5 mL甲醛终止反应，最后分别加入5 mL丙酮混匀，于37 ℃水浴保温10 min，取出，冷却至室温，于4 000 r/min离心5 min，测定上清液在波长485 nm处的吸光度，计算相应的TTC浓度。每组设3个平行样，每个样品重复测定5~7次，相对标准偏差控制在7.15%以内。

1.3.2　联合毒性测定

鉴于TCEP和CTAB毒性水平差异较大，采用等毒性配比法^[17]进行联合毒性测定。按1.3.1方法测定污染物对脱氢酶活性的毒性作用，绘制剂量-效应曲线；再根据上述单一毒性实验结果确定EC₁₀、EC₂₀、EC₃₀、EC₄₀、EC₅₀（EC₁₀指的是污染物对污泥脱氢酶活性的毒性抑制率达到10%，以此类推）；最后根据等毒性配比法（EC_（CTAB,i）∶EC_（TCEP,i）=1∶1，其中i=10，20，…，50），将CTAB和TCEP按照体积比1∶1进行混合，配制5个不同实验浓度。每组设3个平行样，同时设空白对照组。

1.4　联合效应评价方法

采用加和指数法（AI法）^[18]、毒性单位法（TU法）^[19]与混合毒性指数法（MTI法）^[20]3种评价方法进行联合毒性评价。

2　 结果与分析

2.1　污泥基本理化性质

实验中污泥基本理化指标包括混合液悬浮固体（MLSS）2 785 mg/L、挥发性悬浮物（VSS）0.7 mg/L、污泥容积指数（SVI）100 mL/g、污泥浊度3 500 mg/L等。另外，对污泥耗氧速率、脱氢酶活性和氨氮3种指标进行稳定性分析，发现各指标在0~3 h暴露时间内均没有显著变化，分别稳定在9.90 ±0.5 mg/(L·h)、232.25±2 mg/(g·h)、4.11±0.5 mg/L范围内。因此，本研究在污泥稳定期间（3 h）进行毒性暴露实验。

2.2　TCEP和CTAB对污泥耗氧速率的影响

图1为不同浓度TCEP和CTAB对污泥耗氧速率的抑制率的变化。

由图1可知，TCEP和CTAB在3 h暴露时间内，对耗氧速率的抑制率随着浓度增加呈递增趋势。在TCEP浓度达到2.4×10^-10 mol/L时，对耗氧速率抑制率达到83.65%；CTAB浓度达到2.7×10^-6 mol/L时，对耗氧速率抑制率达到12.21%。这与杨冲等^[21]在研究抗生素对硝化和反硝化过程中污泥微生物群落特征时得到的结论相似。推测TCEP和CTAB对污泥耗氧速率抑制的主要原因是污染物改变了污泥中微生物细胞膜的结构，且随着污染物暴露剂量增加，使细胞膜蛋白和脂分离，进而破坏膜结构与功能。

2.3　TCEP和CTAB对污泥脱氢酶活性的影响

2.3.1　单一毒性分析

图2为不同浓度TCEP和CTAB对污泥脱氢酶活性的抑制率变化。由图2（a）可以看出，在3 h暴露时间内，随着TCEP浓度的增加（0~1.7×10^-10 mol/L），对污泥脱氢酶活性的抑制率逐渐增大；在浓度达到1.70×10^-10 mol/L时，对脱氢酶活性的抑制率达到峰值，为87.37%；TCEP浓度大于1.7×10^-10 mol/L时，抑制率逐渐下降。由图2（b）可以看出，CTAB在3 h暴露时间内，随着CTAB的浓度的增加，对脱氢酶活性的抑制率呈递增趋势，在浓度达到2.74×10^-6 mol/L，对脱氢酶活性抑制率达到45.76%。TCEP和CTAB两种污染物对污泥脱氢酶活性的毒性作用终点EC₅₀分别为9.20×10^-11 mol/L和5.30×10^-7 mol/L，TCEP毒性远远大于CTAB。

比较图2（a）（b）可以发现，TCEP和CTAB对污泥脱氢酶活性抑制与其浓度水平密切相关。脱氢酶活性抑制率总体呈递增趋势，较低浓度水平（<2.10×10^-10 mol/L）下抑制率增加较为缓慢，随浓度水平增加抑制率上升趋势增大。这是由于污泥中的微生物具有一定的耐药性，可以抵抗低浓度水平污染物的毒害。脱氢酶是一种生化过程所必需的氧化还原酶，其活性反映生物降解的效率^[4]。而对于较高浓度水平（5.50×10^-7~2.75×10^-6 mol/L）的污染物，脱氢酶活性抑制作用显著，则是由于污染物浓度升高改变了污泥微生物细胞膜的结构。汪灵伟等^[22]在研究双酚A对3种酶活性的影响时得到了相似的结果。Khan等^[23]研究CTAB对溶菌酶蛋白质结构的影响时，指出CTAB和溶菌酶之间发生弱静电作用和强疏水作用破坏了蛋白质三级结构，造成蛋白质部分功能丧失、生物活性降低。

2.3.2　联合毒性分析

鉴于TCEP和CTAB两种污染物的毒性差异较大，联合毒性曲线分别进行绘制，TCEP-CTAB混合体系对脱氢酶活性的联合毒性见图3。图3（a）（b）中各点对应横坐标浓度分别代表TCEP和CTAB单一毒性终点值：EC₁₀、EC₂₀、EC₃₀、EC₄₀、EC₅₀，各点对应纵坐标均代表TCEP-CTAB混合体系对脱氢酶活性的联合抑制率。混合体系对污泥脱氢酶活性的抑制率随污染物浓度的增大而增大，且线性关系较好（R²>0.9）；混合体系对污泥脱氢酶活性毒性效应达到EC₅₀时，TCEP和CTAB的浓度分别为8.30×10^-11、3.26×10^-6 mol/L。暴露在较低剂量浓度（<2.5×10^-10 mol/L）或较高剂量浓度（>5.0×10^-7 mol/L）环境中，TCEP-CTAB混合体系对脱氢酶活性的抑制率比单一毒性作用低，详细分析结果见表1。分析其原因主要是由于两种污染物之间存在相互作用，从而减弱了污染物对污泥微生物毒性作用。这与汪皓琦等^[24]的研究结论相似，新污染物之间存在拮抗作用，减弱了污染物的联合毒性效应。

2.4　联合毒性作用类型评价

TCEP-CTAB混合体系的EC₅₀值和联合毒性评价结果见表1。由表1可以看出，CTAB的联合毒性EC₅₀值大于TCEP的联合毒性EC₅₀值。在混合体系中，TCEP的EC₅₀值与其单一毒性EC₅₀值并无显著性差异，而CTAB的EC₅₀值差异较大，说明TCEP在二元混合物中对脱氢酶活性的毒性贡献较大。应用毒性单位法、加和指数法和混合毒性指数法3种方法对混合体系的联合毒性进行评价。结果显示，AI<0，MTI<0，M>M₀，表明TCEP-CTAB混合体系的联合毒性作用类型均为拮抗作用。

混合体系存在拮抗作用的主要原因在于：一方面，当CTAB浓度达到临界胶束浓度时，可以增大TCEP的溶解度，CTAB本身自发形成胶束，TCEP被胶束疏水端包裹于胶束内部，使TCEP无法与污泥微生物直接接触，从而整体生物毒性降低^[25]；另一方面，CTAB毒性较低能够被污泥微生物优先作为可利用的基质而降解，而污泥微生物的作用靶点有限，从而影响污泥中其他污染物的降解^[26]。Zhou等^[27]研究发现，CTAB在一定浓度范围内对多环芳烃表现出增溶性，且与其浓度呈正比，影响其降解速率。Lakra等^[28]也发现CTAB对多环芳烃的增溶性与其浓度成正比。环境混合体系中组分联合效应表现为拮抗作用，可致使污染物组分对生态环境发生的不利影响产生延迟性，进而增加污染物环境风险的隐秘性。

3　 结 语

本文研究了TCEP和CTAB对好氧污泥耗氧速率和脱氢酶活性的毒性影响。在3 h暴露时间内，不同暴露浓度的TCEP和CTAB对好氧污泥脱氢酶活性和耗氧速率的单一毒性、联合毒性作用均有显著影响。TCEP和CTAB对脱氢酶活性的EC₅₀值分别为9.20×10^-11 mol/L和5.30×10^-7 mol/L；对耗氧速率的最大抑制率分别为83.65%和12.21%。应用等毒性配比法进行组分毒性差别较大的联合效应分析，TCEP-CTAB混合体系中TCEP和CTAB的浓度对脱氢酶活性的EC₅₀值分别为8.30×10^-11 mol/L和3.26×10^-6 mol/L。TCEP-CTAB混合体系对污泥脱氢酶活性的联合效应呈现为拮抗作用。相比于污泥耗氧速率，污染物对脱氢酶活性产生的胁迫响应幅度更大、灵敏度更高，可推荐将脱氢酶活性作为监控污染物对处理工艺的敏感指标。

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基金资助

国家自然科学基金(22176028)

辽宁省教育厅科学研究项目(LJKZ0019)