畜禽粪肥施用对果园土壤细菌群落多样性影响

Effects of Livestock Manure Application on Soil Bacterial Community Diversity in Orchard

摘要

以崇明岛果园土壤为研究对象，采用高通量测序技术探究了施用鸡粪（CM）、猪粪（PM）和有机肥（OF）对土壤细菌群落的组成、结构及多样性的影响，分析了土壤环境因子与细菌群落的相关性。结果表明，与对照组（CK）相比，施用猪粪显著提高了土壤的总氮（TN）、有机质（SOM）、铬（Cr）和铅（Pb）含量（P<0.05），且土壤细菌群落丰富度最高，菌群丰度（Ace）指数达5 137.71；施用鸡粪显著提高了土壤的氨氮（NH₃-N）和硝酸盐氮（NO₃-N）含量（P<0.05），一氧化二氮还原酶（EC1.7.2.4）的丰度显著提高（P<0.05）；有机肥的施用有利于提升SOM的含量，且一氧化氮还原酶（细胞色素c）（EC1.7.2.5）的丰度显著高于CK组（P<0.05）。砷（As）、Cr、Pb、pH值是影响土壤细菌结构的主要环境因子，施肥会导致重金属含量和病原菌丰度升高，对果园环境造成一定的不利影响。

Abstract

The high-throughput sequencing technology was adopted to investigate the effects on composition, structure and diversity of soil bacterial communities, and their correlations between soil environmental factors and bacterial communities after applying chicken manure (CM), pig manure (PM) and organic fertilizer (OF) in orchard soil at Chongming Island. The results showed that, the pig manure significantly increased the soil TN, SOM, Cr and Pb contents (P<0.05) compared with the control group (CK), and soil bacteria community richness is the highest, with the Ace index of 5 137.71. The chicken manure significantly increased the contents of NH₃-N and NO₃-N in the soil (P<0.05), and the abundance of nitrous oxide reductase (EC1.7.2.4) was significantly higher compared with the CK group (P<0.05). The application of organic fertilizer was beneficial to increase the content of SOM, and the abundance of nitric oxide reductase (cytochrome c) (EC1.7.2.5) was significantly higher than that of the CK group (P<0.05). As, Cr, Pb, and pH value were the main environmental factors that affect the structure of soil bacteria. Fertilization will increase the content of heavy metals and the abundance of pathogenic bacteria, which will cause a certain adverse impact on the orchard environment.

Graphical abstract

关键词

畜禽粪肥 / 果园土壤 / 细菌群落 / 细菌多样性

Key words

livestock manure / orchard soil / bacterial community / bacterial diversity

0　 引 言

随着我国畜禽养殖业的不断发展，畜禽粪便产生量也随之增多，如何将畜禽粪便作为肥料还田实现资源化利用，已经成为我国畜禽养殖业可持续发展的研究重点^[1]。畜禽粪便还田，可以提高土壤肥力^[2]和农作物产量，同时也利于改善土壤和微生物群落结构^[3]。但是畜禽粪便中残留的抗生素和重金属等污染物进入农田，可能会威胁土壤生态系统健康^[4]。

土壤中存在着大量的微生物，微生物多样性能表征土壤健康与质量的动态变化^[5]，对土壤肥力^[6]、酶活性及代谢^[7]起重要作用，是反映土壤生态功能和环境质量的重要生物学指标^[8，9]。土壤理化性质的改变会引起土壤微生物的快速响应^[10]。施用畜禽粪便可以提高土壤的微生物多样性^[11]，但同时也会改变土壤的理化性质，并直接或间接地影响土壤微生物群落的组成和结构。例如，粪肥的施用与土壤细菌数量、总氮（TN）和有机质（SOM）等联系密切^[12]，猪粪和鸡粪的施用可以提高土壤微生物群落多样性^[13]，且显著改变微生物的群落结构^[14]。有研究表明，合理地施用猪粪和有机肥可以改善苹果园和桃园土壤理化性状^[15~17]，间接促进土壤微生物群落结构演变，提高果品产量^[18，19]。以往相关研究主要集中于粪肥施用对水田和蔬菜地的直接影响^[6，20]，而施用畜禽粪肥或粪肥熟化有机肥对果园土壤微生物群落结构的直接影响，以及施用后导致土壤理化性质变化从而产生的微生物群落结构与多样性变化的间接影响，目前鲜有研究报道。而且，以往研究主要是基于传统微生物测定方法，存在操作繁琐、分辨率低等缺点，利用高通量测序技术(high-throughput sequencing)能够克服上述缺陷，从不同层面对土壤微生物进行全面的解释^[21]，对后续宏基因组学研究具有一定参考价值。

崇明岛近年来大力推进土壤生态保育工作，农作物施肥逐步采用畜禽粪肥及其熟化有机肥替代传统化肥，岛内畜禽养殖类型以猪和鸡为主。本文选取崇明岛果园作为研究对象，利用高通量测序技术研究施用畜禽粪肥及其熟化有机肥后果园土壤的细菌群落组成、结构及多样性。研究结果以期为畜禽粪便的资源化利用以及果园土壤的生态保育提供科学支撑。

1　 实验部分

1.1　研究区域概况

研究区域位于崇明中兴镇农田生态过程试验基地（31°25′N-31°50′N, 121°10′E-122°00′E），地处崇明岛东部，东邻陈家镇，西接向化镇，南北濒长江；气候温和湿润，日照充分，年平均降雨量约1 049 mm，年平均气温约15 ℃；区域内土壤性质为潮土，呈弱碱性，适宜多种作物种植。

1.2　实验设计

果树：实验果树选择当地常见的桃树，树龄为4年。

粪肥：选用上海市崇明岛典型的规模化畜禽养殖场鲜鸡粪和猪粪，有机肥则由养猪场猪粪好氧堆肥而成。3种粪肥理化性质如表1所示，其中NH₃-N、NO₃-N、TN、SOM、Cd、Hg、As、Pb、Cr分别指氨氮、硝酸盐氮、总氮、有机质、镉、汞、砷、铅、铬。

施肥量：依据《畜禽粪便还田技术规范》^[22]配施粪肥，施用量为1.58 kg/m²。

施肥方式：因桃园土壤微生物活性在春季逐渐增强，故选择在3月中下旬施肥，肥料均匀撒施后翻肥入土，深度约25 cm。

实验设计：设置未施肥对照组（CK）、鸡粪处理组（CM）、猪粪处理组（PM）和有机肥处理组（OF）4个实验组。每个处理组设置3个平行样地，每个样地为3 m×4 m的长方形，样地之间用厚0.5 mm防渗膜埋深50 cm隔开，防止相互干扰。样地之间设置25 cm过道，以方便现场观测和样品采集。

1.3　实验方法

1.3.1　土壤样品采集

为防止暴雨对土壤理化性质及微生物的影响，选择在同年暴雨季之前的6月中下旬采集土壤样品。采集桃树主根周围50 cm范围内土壤，根据S形取样法，每个样地采集5个样点约100 g表层土壤，混合均匀后作为该样地样品。筛去杂物后将每个样品分为3份，其中1份置于无菌离心管中，另2份置于无菌棕色瓶中，低温保存并及时送至实验室进行理化性质和16S细菌多样性检测。

1.3.2　土壤理化指标检测

将土壤样品自然风干，研磨后过筛，置于4 ℃以下保存，用于土壤理化性质测定。土壤养分检测：NH₃-N和NO₃-N的含量采用AA3型连续流动分析仪（CFA，Bran+Luebbe公司）测定；TN采用半微量凯氏法^[23]测定；SOM采用重铬酸钾氧化法^[24]测定；土壤pH值和重金属检测参照《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准（试行）》^[25]中的分析方法。

1.3.3　土壤细菌测定和功能预测分析

将另2份土壤样品均分为6组平行样，-20 ℃保存，用于土壤细菌测定。

土壤总DNA提取：采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals公司）提取土壤样品总细菌DNA、DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳（AGE，北京市六一仪器厂）检测DNA片段、NanoDrop2000型紫外-可见分光光度计（UV-Vis，Thermo Fisher Scientific公司）测定最终DNA浓度和纯度。

PCR扩增和测序：采用细菌的特异性引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对16SrRNA基因V3-V4区进行PCR扩增，产物回收纯化后构建文库，利用Illumina MiSeq平台（上海美吉生物医药科技有限公司）进行测序^[26]。

测序后数据处理：对测序数据进行质控，用Flash软件进行拼接，去除不符合条件序列：1） 设置50 bp的窗口，过滤reads尾部质量值20以下的碱基；2） 拼接序列的overlap长度需大于10 bp；3） barcode允许错配数为0，根据序列首尾两端的barcode调整序列方向。用UPARSE软件将相似度97%水平下拼接好的优质序列进行OTU（operational taxonomic units）聚类分析，所得到的结果与Silva 16SrRNA（v138）数据库进行比对。为保证测序序列的均一性，将所有序列进行抽平，利用R语言工具作图分析细菌群落结构、多样性及菌群差异性。

16S功能预测^[27]：用PICRUSt软件对OTU丰度表进行标准化，然后通过每个OTU对应的Greengene ID号，获得OTU对应的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins）数据库的描述信息及预测信息，随后进行基因功能和代谢途径预测，从而得到细菌各功能分类丰度。

1.4　数据统计分析

原始数据的均值及标准差采用Excel2019计算，土壤理化性质、细菌多样性指数、细菌组间差异和功能基因预测的显著性分析采用SPSS24单因素方差分析（One-way ANOVA），环境因子与细菌相关性采用皮尔逊（Pearson）相关性分析。

2　 结果与讨论

2.1　土壤理化性质分析

猪粪、鸡粪和有机肥施用后土壤理化性质如表2所示。根据表2结果，1） 施肥均显著提升了土壤pH值（P<0.05），使土壤处于弱碱性状态，这可能是由于施肥后碱性阳离子堆积，造成土壤pH值升高；2） 施肥显著提高了土壤NO₃-N含量（P<0.05），3个施肥处理组之间NO₃-N含量无明显差异（P>0.05），这是由于粪肥和有机肥中含氮量较高，增加了土壤NO₃-N含量^[28]；3） CM组NH₃-N含量显著高于CK、PM和OF组，分别高出125.0%、80.0%和42.1%；4） PM组土壤TN含量显著高于OF和CK组（P<0.05），分别高出19.7%和44.2%；5） OF组土壤SOM含量最高，显著高于CK组（P<0.05），PM组与OF组无明显差异（P>0.05）；6） PM组土壤重金属中Cr和Pb含量最高，显著高于CK组（P<0.05），As、Cd、Hg含量各组间无明显差异（P>0.05）。由上述结果可以看出粪肥和有机肥的施用显著改善了土壤营养状况，提高了土壤肥力，但同时也提高了土壤重金属含量。

2.2　土壤细菌多样性和群落结构分析

分别采用香农（Shannon）指数和菌群丰度（Ace）指数反映果园土壤细菌群落多样性及丰富度。如表3所示，各处理组Shannon指数无显著性差异（P>0.05），这可能是由于短期施肥对细菌群落多样性影响较小；施肥组Ace指数均显著高于CK组（P<0.05），PM、OF和CM组较CK组分别提高了29.5%、26.9%、19.5%，其中PM组土壤细菌群落最为丰富；不同样品组测序深度（Coverage）指数在0.888~0.900之间，表明样本测序深度合理。上述结果表明，施肥对土壤细菌群落多样性影响较小，而对细菌丰富度影响较大。施肥后外源营养物质对土壤细菌的刺激是细菌丰富度提高的可能原因。

主坐标分析（PCoA）用ANOSIM法描述了4个处理组土壤细菌群落的Bray-Curtis距离，表征不同施肥处理后土壤细菌群落的差异性和相似性。如图1所示，在PC1轴上，CM、PM组在正负轴均有分布，OF组均分布在负轴，CK组大多分布在正轴；在PC2轴上，4个处理组在正负轴分布较均匀。整体而言，CK组样本与OF、PM、CM组的样本明显区分开来，施肥处理组样本难以区分开。上述结果表明，施肥改变了土壤细菌群落的组成，CK组与施肥组群落结构存在差异，而各施肥处理组细菌组成群落较为相似。这可能是因为施肥后外源物质的添加，会促进或抑制土壤中特定细菌的生长，进而改变土壤细菌群落组成。

2.3　土壤优势菌及菌群差异性分析

本次测序共识别47个菌门，如图2(a)所示，4个处理组丰度较高的菌门均为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）等。Proteobacteria丰度最高，3个施肥处理组Proteobacteria相对丰度均为30%，CK组则为28%。其次优势菌门为Actinobacteria，OF、PM、CM和CK组Actinobacteria相对丰度分别为20%、23%、21%、18%。张健等^[29]研究发现施氮肥后土壤Proteobacteria和Actinobacteria相对丰度最高，与本文研究结果类似，粪肥施用对果园土壤细菌群落具有显著影响。Acidobacteria丰度与土壤pH值密切相关，不同粪肥施用降低了土壤Acidobacteria的相对丰度。Wang等^[30]研究表明，土壤pH值变化对细菌的丰度和群落结构变化有协同作用。

本次测序共识别937个菌属，如图2(b)所示，4个处理组较为丰富的菌属包括norank_c_Acidobacteria、诺卡氏菌属（Nocardioides）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）等。norank_c_Acidobacteria在施肥后相对丰度均有所降低，粪肥和有机肥施用导致土壤pH值升高是主要原因。OF、PM、CM和CK组Nocardioides相对丰度分别为4.3%、5.8%、5.8%、3.6%，PM和CM组Nocardioides相对丰度最高，其次为OF组，说明施肥会导致Nocardioides相对丰度有不同程度升高。Nocardioides为一种病原菌属，可产生抗生素。施用有机肥后厌氧绳菌科某属（norank_f_Anaerolineaceae）相对丰度有所提升，研究表明，norank_f_Anaerolineaceae可以参与厌氧消化过程，提升难降解有机物的降解能力^[31]。OF、PM、CM和CK组芽孢杆菌属（Bacillus）分别占各组细菌总丰度的1.6%、2.0%、1.8%、4.3%。OF、PM、CM和CK组Nitrospira相对丰度分别为19%、27%、22%、31%，Nitrospira为常见土壤硝化细菌^[32]，CK组土壤Nitrospira相对丰度高于施肥处理组，可能是由于土壤氮增加后Nitrospira参与土壤氮循环，将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，Nitrospira在土壤氮循环中起着重要作用^[33]。

选取单因素方差分析法，基于门水平和属水平细菌的相对丰度分析各处理组之间细菌组成的差异。如图3(a)所示，从门水平可以看出，CM和OF组的拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度显著高于CK组（P<0.05），鸡粪中主要含有Bacteroidetes，施用鸡粪后，土壤中的Bacteroidetes含量显著增高，这与Yang等^[34]的研究结果一致。CK组Latescibacteria相对丰度显著高于3个施肥处理组（P<0.01），OF组Saccharibacteria的相对丰度显著高于其他3组（P<0.05）。如图3(b)所示，属水平上CK组Gaiella、norank_o Gaiellales、norank_c Gemmatimonadetes、norank_p Latescibacteria、Roseiflexus、RB41的相对丰度显著高于3个施肥处理组（P<0.05）；CM组腐螺旋菌科某属（norankf Saprospiraceae）相对丰度最高，显著高于CK和PM组（P<0.01）；PM组农杆菌属（Agromyces）相对丰度显著高于CK组（P<0.05）。

2.4　土壤环境因子对细菌群落影响分析

依据pH值、NH₃-N、NO₃-N、TN、SOM、As、Cd、Cr、Hg和Pb等指标和土壤细菌群落调查结果，分析施肥后影响土壤细菌群落变化的主要环境因子及两者的相关关系（图4）。环境因子箭头长短表示对细菌群落影响程度的高低，箭头之间的夹角表示相关性（锐角表示正相关；钝角表示负相关；直角表示无相关性）。结果表明，As、Cr、Pb和pH值是影响土壤细菌结构的主要环境因子，pH值、NH₃-N、NO₃-N、TN、SOM、As、Cd、Cr、Hg和Pb对Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes均有正相关作用，对Chloroflexi和Acidobacteria均有负相关作用，土壤环境因子的变化会引起细菌群落结构改变，与李丽娜等^[35]的研究结果一致。

相关性热图（Heatmap图）显示了环境因子对果园土壤细菌的影响程度（图5）。结果表明，不同粪肥施用可通过改变土壤的理化性质间接影响土壤细菌多样性。Gaiella与pH、NO₃-N呈显著负相关（P<0.05），施肥后Gaiella丰度降低且在不同处理组之间差异显著（P<0.05）。这可能是由于氮能抑制某一类细菌的生长，与杨胜香等^[36]研究一致。Uddin等^[37]研究表明，Gaiella对抗生素较为敏感，与土壤抗生素含量呈负相关，且粪肥施用可显著降低其丰度^[38]。H16、Nitrospira与pH值呈显著负相关（P<0.05），说明这2种菌比较适合在酸性环境下生长。Nocardioides与NO₃-N、Cr呈显著正相关（P<0.05），与TN、As呈显著正相关（P<0.001），说明粪肥施用可以改变土壤中氮含量，进而改变细菌丰富度与多样性，与Wang等^[30]研究结果一致。Sphingomonas与Cd呈显著正相关（P<0.05），董书博等^[39]研究也表明，重金属会影响细菌多样性，二者具有一定的相关性，与本文研究结果一致。

pH值、NO₃-N、TN、SOM、As、Cd、Cr和Pb均与果园土壤细菌群落存在较强的相关性，表明粪肥施用可以通过改变果园土壤的环境因子，抑制或促进某些细菌的生长，进而影响土壤细菌群落的多样性和丰富度，而细菌群落的改变又会反过来影响土壤环境因子^[40]。研究结果表明环境因子和土壤细菌之间具有一定的关联性，与理鹏等^[41]研究结果一致。

2.5　16S功能预测分析

16S功能预测结果如图6（a）和（b）所示，CM组一氧化二氮还原酶（EC1.7.2.4）和OF组一氧化氮还原酶（细胞色素c）（EC1.7.2.5）的基因丰度最高（P<0.05）。3个施肥处理组间EC1.7.2.4无显著性差异（P>0.05），CM、OF和PM组分别高出CK组18.74%、17.79%、15.84%。OF组EC1.7.2.5显著高于CM、PM和CK组（P<0.05），分别高出11.29%、24.6%、35.71%。

16S功能预测分析可知，EC1.7.2.4是堆肥发酵反硝化过程中重要的还原酶，可以将呼吸过程中的一氧化二氮（N₂O）还原为N₂^[42]，EC1.7.2.5可将一氧化氮（NO）还原为无毒的N₂O^[43]。EC1.7.2.4和EC1.7.2.5是细菌反硝化过程的重要组成部分。粪肥的施用增加了EC1.7.2.4和EC1.7.2.5编码基因的相对丰度，有利于促进土壤氮循环，从而减少硝酸根累积对土壤带来的毒害作用^[44]。

3　 结 语

本文研究了崇明岛果园施用畜禽粪便及其熟化有机肥后对土壤理化性质和土壤细菌群落的影响，并探讨了土壤理化性质与细菌群落变化的相关性，结果显示：1） 施肥提高了土壤pH值，提升了土壤肥力，但也导致土壤重金属含量有所增加，其中PM组土壤重金属中Cr和Pb含量最高，显著高于CK组（P<0.05）；2） 短期施肥对土壤细菌群落多样性影响较小，施用猪粪后土壤细菌群落丰富度最高，菌群丰度（Ace）指数达5 137.71，土壤优势菌门为Proteobacteria，优势菌属为norank_c_Acidobacteria；3） 施肥改变了土壤理化性质，继而影响了细菌群落，CK组与施肥组群落结构存在差异；4） 粪肥施用增加了EC1.7.2.4和EC1.7.2.5编码基因的相对丰度，有利于促进土壤氮循环，然而施肥也增加了病原菌Nocardioides的相对丰度，对土壤环境有一定的胁迫作用。研究结果可为畜禽粪肥资源化利用和果园土壤生态保育以及后续宏基因组研究提供理论依据。

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基金资助

上海市科技兴农项目(2022-02-08-00-12-F01095)

上海市科委科技攻关项目(20dz1204800)

上海市自然科学基金(31100404)