银铂复合纳米材料的制备及其抗菌性能

Preparation of Ag-Pt Composite Nanomaterials and Their Antibacterial Properties

摘要

在TiO₂/C微球上负载铂纳米线得到复合物Pt/TiO₂/C，然后在其表面负载银纳米粒子，制备了银铂复合纳米材料Ag-Pt/TiO₂/C，并通过X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散谱仪（EDS）、电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）等技术进行表征。该复合材料中Ag的实际负载量为14.30%，在偏中性条件下具有很好的过氧化物模拟酶活性。抗菌结果表明：复合材料用量为2 μg/mL时，可以杀死100%的大肠杆菌（Escherichia coli）；在1 mmol/L H₂O₂体系中，复合材料用量为0.25 μg/mL时，可以杀死91.29%的大肠杆菌；对大肠杆菌的最低抑菌浓度为25 μg/mL。该复合材料的抗菌机理可能与其对细菌细胞壁的损伤有关。

Abstract

The Ag-Pt/TiO₂/C composite nanomaterials were prepared by supporting silver nanoparticles on the surface of Pt/TiO₂/C. X-ray diffraction (XRD), scanning electron microscopy (SEM), energy dispersive spectrometer (EDS), inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) and other techniques were used for their characterization. The actual load of Ag was 14.30%, and it had good peroxidase mimetic activity under neutral condition. The results showed that 100% of Escherichia coli were killed when the concentration of the composite was 2 μg/mL. At the concentration of 0.25 μg/mL in 1 mmol/L H₂O₂ system, 91.29% Escherichia coli were killed by the composite. The minimum inhibitory concentration to Escherichia coli was 25 μg/mL. The bactericidal mechanism of the composite may be related to the cell wall damage.

Graphical abstract

关键词

铂 / 银 / 抗菌性能

Key words

platinum / silver / antibacterial properties

0　 引 言

耐药菌相关疾病蔓延迅速，如不采取措施加以遏制，预计2050年后每年死于耐药菌感染的人数将达到1 000万^[1]。同时，菌株的耐药性也会导致使用抗生素的常规治疗疗效越来越差。所以，开发新型高抗菌活性和低耐药性的抗菌药物具有重要意义^[2]。

纳米材料具有独特的催化和氧化能力，是抗菌应用平台的理想候选材料^[3~5]。大量科学研究发现，银纳米粒子对一些常见的细菌具有高效的杀灭作用，例如大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等^[6]。细胞中的生物大分子因含有硫、氧、氮原子而具有丰富的给电子基团，能与银离子发生相互作用而导致其失去活性，进而导致细胞破损、死亡^[7]。为了更加充分地发挥银的抗菌活性，一系列新颖的银纳米复合材料被制备并用于抗菌研究^[8，9]。2010年，Chen等^[10]用金红石型TiO₂作为载体制备了纳米银与TiO₂的复合材料Ag@TiO₂，发现当Ag@TiO₂用量为10 μg/mL时可完全抑制大肠杆菌的生长，明显优于单独的TiO₂和Ag纳米颗粒。在抗菌材料中，金属铂的抗菌活性也引起了极大关注。2017年，Cai等^[11]采用脱合金工艺，以氯铂酸和硝酸银为前驱体、甲醛为还原剂、多环芳烃为表面活性剂，制备了一系列Pt _x Ag_100-x (0<x<100)纳米粒子，其中脱合金后的D-Pt₅₀Ag₅₀用量为20 μg/mL时可抑制约半数大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。

本文以TiO₂/C微球负载铂纳米线的复合物Pt/TiO₂/C（PTC）为载体，表面负载纳米银，制备银和铂的复合纳米材料Ag-Pt/TiO₂/C（APTC），再通过3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化测试研究该复合材料的氧化物模拟酶活性和过氧化物模拟酶活性，并考察了复合材料的抗菌性能、对大肠杆菌的最低抑菌浓度以及抗菌机理。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：PTC为实验室自制；大肠杆菌（Escherichia coli K12）由实验室培养；Luria-Bertani （LB）液体培养基配方为1%氯化钠（m/V），1%胰蛋白胨（m/V），0.5%酵母提取物（m/V），1.5%琼脂粉（m/V）；所有试剂均为分析纯或更高纯度，使用前无需进一步纯化，均购自上海国药集团；所有溶液均为超纯水配制。

仪器：UV-1800型紫外-可见分光光度计（UV-Vis，Shimadzu公司），Multiskan GO型全波酶标仪（Thermo Scientific公司），OTF-1200X-S型管式炉和KSC-1100X型马弗炉（合肥科晶材料技术有限公司）；采用D8 Advance型X射线衍射仪（XRD，Bruker公司）分析样品中银和铂的晶体结构；采用SU8010型扫描电子显微镜（SEM，Hitachi公司）表征样品的形貌；采用JEOL-2100F型透射电子显微镜（TEM，JEOL公司）上的能量色散谱仪（EDS）研究样品中各元素的分布；利用Agilent7900型电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS，Agilent公司）检测样品中Ag的负载量。

1.2　材料制备

1.2.1　银纳米粒子的制备

用抗坏血酸还原AgNO₃法合成银纳米粒子。在2.4 mL水中加入300 μL 5.6 mg/mL AgNO₃溶液和300 μL 29 mg/mL抗坏血酸，超声分散。混合溶液在旋转混匀器上反应1 h，离心，去掉上清液，得到银纳米粒子，在水中超声清洗3次，再用无水乙醇洗涤1次，置于真空干燥箱中于50 ℃干燥12 h，得到银纳米粒子。

1.2.2　APTC复合材料的制备

将3 mg PTC加入到2.4 mL超纯水中，超声分散，加入300 μL 5.6 mg/mL AgNO₃溶液，混匀，再加入300 μL 29 mg/mL抗坏血酸。将该混合溶液置于旋转混匀器上反应1 h，离心，去上清，沉淀用超纯水洗涤3次，无水乙醇洗涤1次，然后置于真空干燥箱中于50 ℃干燥12 h，得到APTC复合材料。

1.3　氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性测试

在加或不加H₂O₂条件下测吸光度，用TMB氧化法对APTC的过氧化物模拟酶和氧化模拟酶活性进行研究，并测试了pH值对氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性的影响。反应均在10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）中进行，监测体系在652 nm处的吸光度变化。具体步骤为：分别取400 μL pH值为4.0、5.0、6.0、7.0的PBS于4个离心管中，依次加入40 μL APTC（1 mg/mL）、40 μL TMB溶液（10 mmol/L）和20 μL的H₂O₂(50 mmol/L)，放置10 min观察其颜色变化，并测试样品的UV-Vis吸收光谱。

1.4　抑菌性能测试

1.4.1　APTC的抑菌效果

细菌悬浮液A：将处于对数生长期的大肠杆菌母液用pH 7.0的PBS稀释至1.0×10⁸ CFU/mL。细菌悬浮液B：将细菌悬浮液A分别与不同浓度APTC等体积混合，并在旋转混匀器上反应4 h，混合后APTC浓度分别为0.25、0.5、1、2 μg/mL。细菌悬浮液C：将细菌悬浮液B稀释10⁴倍。细菌悬浮液D：在细菌悬浮液B中添加H₂O₂（1 mmol/L），然后稀释10⁴倍。分别将100 μL细菌悬浮液C和D涂布于固体培养基上，于37 ℃培养12 h，考察APTC的抑菌效果。另设置3个对照组（E. coli、E. coli+APTC、E. coli+1 mmol/L H₂O₂）同时进行实验。

1.4.2　APTC对细菌细胞壁的损伤

取1 mL细菌悬浮液B于离心管内，以4 000 r/min离心10 min，去上清，沉淀用pH 7.4的PBS洗涤3次，向沉淀中加入1 mL 质量分数2.5%的戊二醛PBS溶液， 混匀后于冰箱中4 ℃静置10~12 h，取出，以4 000 r/min离心10 min，去上清，沉淀先用PBS洗涤3次，再按照乙醇体积百分数30%、50%、70%、80%、90%、100%的顺序进行梯度脱水洗涤，离心，每次10 min。将脱水洗涤后的菌体用100%叔丁醇超声重悬两次，每次半小时，于室温下真空干燥，得到粉末样品。用扫描电子显微镜观察样品形貌。对照组为细菌悬浮液A。

1.4.3　APTC的最低抑菌浓度

取5个离心管，以LB培养基作溶剂，依次配制浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的APTC溶液。将培养至对数期的细菌离心后，用LB培养基稀释至浓度为1.0×10⁶ CFU/mL，得到细菌悬浮液E。取上述5个浓度的APTC溶液分别与细菌悬浮液E等体积混合，得到5个混合溶液，其中APTC浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL。以96孔板作为反应器，每孔中注入100 μL上述混合溶液，设置3组平行实验。另设阳性对照（100 μL含有相同细菌浓度的培养基）和阴性对照（100 μL培养基）各3组。将96孔板于恒温箱中37 ℃放置12 h，用酶标仪测得各实验组于600 nm处的光密度（OD_{600 nm}），考察APTC的最低抑菌浓度。

2　 结果与讨论

2.1　材料表征

从图1(a)(b) APTC的SEM图可以看到，复合材料呈球状形貌，直径约600 nm，表面覆盖着纳米尺寸的颗粒。进一步研究了复合材料的元素分布，由图1(c)~(g)可以清晰地看到，复合材料中均匀分布着C、O、Pt、Ag和Ti元素，证明复合材料表面成功负载了银纳米粒子。另外，通过ICP-MS测得APTC中Ag实际负载量为14.30%（质量分数）。

利用XRD对APTC和PTC的晶体结构进行了分析，结果如图2所示。PTC的XRD图中在39.5°、46.2°、67.3°处出现3个峰，分别归属为Pt的3个晶面（111）、（200）、（220）。APTC的XRD图中在38.0°、45.0°、65.0°、75.0°处出现4个峰，分别对应Ag的4个晶格面（111）、（200）、（220）、（311），且Ag和Pt的衍射峰分开，证明该复合材料中银和铂没有形成合金化结构，各自保持为典型的面心立方结构^[12]。

2.2　APTC的氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性

在加或不加H₂O₂条件下测吸光度，对APTC的过氧化物模拟酶和氧化模拟酶活性用TMB氧化法进行了研究。如果溶液颜色变深，同时观察到在625 nm处有明显的吸收峰，则说明TMB被氧化。溶液的吸光度越高，表明材料的氧化能力越强。图3（a）显示， TC+TMB体系在pH 6.0或7.0时几乎没有颜色变化，pH 5.0时为轻微的蓝色，吸光度为0.20，pH 4.0时体系显示为较深的蓝色，吸光度达到1.07。这说明PTC在偏中性环境下的催化剂几乎没有氧化酶活性，而在偏酸性环境下具有明显的氧化模拟酶活性，且酸性越强氧化酶活性越好。图3（b）显示，PTC+TMB+H₂O₂体系在pH 7.0时无颜色变化，此时体系没有过氧化物模拟酶活性；在pH 5.0和6.0时都有明显的颜色变化，吸光度也随之增大；pH 4.0时体系蓝色更深，吸光度为2.16，明显高于PTC+TMB体系的吸光度。这说明PTC在偏酸性条件下具有过氧化物模拟酶活性，可能氧化H₂O₂产生羟基自由基^[13]。综上所述，只有在偏酸性环境下，PTC的氧化模拟酶活性和过氧化物模拟酶活性才能显现出来。

图3（c）显示，APTC +TMB反应体系在不同pH值条件下均没有明显变蓝色，但其吸光度在偏酸性条件下有微弱上升，表明APTC具有较弱的氧化模拟酶活性，能够产生少量的活性氧。这是由于复合材料中纳米铂产生的活性氧首先氧化了负载在其表面的银纳米粒子，使溶液中的活性氧浓度降低，从而减弱了对TMB的氧化。图3（d）显示，APTC+TMB+H₂O₂体系在pH 5.0、6.0和7.0时均呈现蓝色，且吸光度随着pH值的增大而增大，变化趋势与图3（b）相反。推测是由于酸性条件下复合材料中纳米铂产生的活性氧首先将其表面的纳米银氧化为银离子，从而削弱了APTC对H₂O₂产生羟基自由基的催化作用；随着pH值的增大，复合材料中纳米铂产生的活性氧变少，纳米银的量相对增加，增强了APTC对H₂O₂产生羟基自由基的催化作用，能够产生更多的羟基自由基，从而促进了蓝色氧化态TMB的生成^[14]。

基于上述结果，APTC可用于抗菌应用相关的研究。

2.3　APTC的抗菌性能

在培育细菌的过程中，通过监测细菌悬液的OD_{600 nm}值，可以判断细菌生长是否进入对数期。选择处于对数期生长的细菌进入后续研究。

图4（a）显示，当细菌的存活率分别为83.64%、68.87%、53.03%和0时，相应的复合材料用量分别为0.25、0.5、1、2 μg/mL。随着APTC用量的增加，E.coli菌落数有明显减少的趋势，当APTC用量为2 μg/mL时，杀菌率达到100%。进一步探究了H₂O₂对反应体系的影响。图4（b）显示，在H₂O₂存在条件下，细菌存活率分别为69.09%、34.84%、8.71%、0时，APTC用量分别为0.062 5、0.125、0.25、0.5 μg/mL。实验数据说明，H₂O₂使得复合材料的抗菌能力显著增强，当APTC用量为0.25 μg/mL时就可以杀灭91.29%的细菌，用量仅为未添加H₂O₂所需APTC的12.5%。这与APTC的氧化模拟酶和过氧化物模拟酶的实验结果一致。在不加H₂O₂时，APTC中由于协同作用生成的银离子具有抗菌作用^[15]；在加H₂O₂时，APTC中的纳米银和纳米铂都对H₂O₂产生羟基自由基具有催化作用，通过损坏细菌细胞膜的功能^[16]达到杀菌的目的。

由图5（a）大肠杆菌和APTC处理过的大肠杆菌的SEM图像可见，表面比较光滑的是正常的E. coli，而被APTC处理后，细菌表面变得粗糙，表明细菌的细胞壁受到了损伤。这种损伤可以从两方面解释：一是APTC复合材料产生的银离子与细胞内含S、O或N生物大分子上的给电子基团相互作用致其失活^[7]，从而导致细胞破损而死亡；二是银离子通过静电吸附与细菌上带有负电荷的蛋白质结合，从而导致细胞壁的功能受损^[17]。

进一步测试了APTC复合材料的最低抑菌浓度。将一定量的细菌分别与不同用量的APTC复合材料（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL）37 ℃培养过夜，设置3组平行实验。表1为对应的OD_{600 nm}的数据。除去阴性对照的值，APTC用量为50 μg/mL时OD_{600 nm}值最小；随着APTC用量的减少，OD_{600 nm}值逐渐增大；扣除阴性对照背景值之后，APTC用量为50 μg/mL与25 μg/mL时，OD_{600 nm}值均小于0.1，APTC用量为25 μg/mL时溶液是澄清的，当APTC用量降至12.5 μg/mL时溶液呈现浑浊。因此，APTC的最低抑菌浓度为25 μg/mL。测试了添加H₂O₂对复合材料抗菌效果的影响，发现体系中是否添加H₂O₂抗菌效果相差不多。推测是由于体系在37 ℃下培育，较高的温度使H₂O₂分解，其作用未得到体现。另外还制备了银纳米颗粒用于抗菌实验，当其浓度为50 μg/mL时未显示出明显的抗菌效果，说明由于APTC复合材料中各成分的协同作用，增强了整体的抗菌能力。

3　 结 语

本文在TiO₂/C微球负载铂纳米线表面负载银纳米粒子，制备了多元银铂复合纳米材料APTC，并通过XRD、SEM、EDS等技术进行表征。TMB氧化实验结果表明，相对于PTC，APTC复合材料在中性条件下有着更好的过氧化物模拟酶活性。抗菌实验结果表明：APTC复合材料对大肠杆菌具有很好的抗菌能力，用量为2 μg/mL时，仅通过与大肠杆菌混合放置，杀菌率就达到100%，进一步在体系中加入1 mmol/L H₂O₂后，则只需要0.25 μg/mL，抑菌率就达到91.29%，此用量仅为未加H₂O₂时用量的12.5%；APTC复合材料的最低抑菌浓度为25 μg/mL。综上所述，APTC复合材料用于抑菌有潜在的应用前景。

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