P-选择素亲和含糖聚合物的合成及其抗黏附性能

Preparation of Glycopolymer with P-Selectin Affinity and Its Anti-Adhesive Property

摘要

岩藻糖和N-乙酰神经氨酸甲酯经乙酰化反应后，用叠氮基取代其1号位的基团，再与丙烯酰胺丙炔经Click反应合成了两种带有不饱和乙烯双键、可聚合的乙酰化含糖单体。这两种单体通过可逆加成-断裂链转移聚合法共聚合后，再脱乙酰化，制备了一种模拟P-选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）结构的新型含糖聚合物GP-SF。采用磁共振技术对以上含糖单体及含糖聚合物GP-SF进行表征，通过黏附实验对GP-SF与P-选择素的结合能力进行测试，并考察了GP-SF在体外对B16细胞-血小板黏附的抑制能力和对COS 7细胞的细胞毒性。实验结果表明，该含糖聚合物能够通过竞争性结合P-选择素，抑制P-选择素与B16细胞的黏附，黏附抑制率达到62.7%，且具有良好的生物安全性。

Abstract

Fucose and N-acetylneuraminic acid molecules after their acetylation protection were replaced by azide group at 1th position of theirs respectively. The corresponding polymerizable monomers with unsaturated ethylene double bonds were obtained by “Click Chemistry” reaction between azide group and alkynyl of prepared propargyl acrylate. A new glycopolymer type (GP-SF) mimicking P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) structure was prepared via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization by the polymerizable monomers and further deacetylation. The structures of the polymerizable monomers and the novel glycopolymer GP-SF have all been characterized by employing NMR spectroscopy. The cytotoxicity of the GP-SF to COS 7 cells was tested, and the binding ability of GP-SF with P-selectin and the influence of GP-SF to platelets-B16 cells adhesion have also been measured by adhesion assays. The experimental results showed that this glycopolymer can effectively inhibit the adhesion of P-selectin to B16 cells by competitively binding P-selectin (inhibition rate 62.7%), meanwhile with confirmed good biological safety.

Graphical abstract

0　 引 言

近年来，以P-选择素为靶点开发用于治疗炎症、肿瘤、血栓等病症的抗黏附药物，已成为新的重点研究方向。P-选择素（CD62P）是细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）中的一种。细胞黏附分子能够通过配体与受体相结合的方式，介导细胞与细胞或细胞外基质相互接触和黏附，进而在机体多种重要的生理病理过程中发挥重要作用^[1，2]。P-选择素的分子量约140 ku，主要存在于体内血小板α颗粒膜蛋白表面与血管内皮细胞韦伯潘力氏小体中的膜糖蛋白中，能够与许多炎症细胞或肿瘤细胞表面表达的配体相结合，介导细胞黏附，进而影响炎症与肿瘤发展的进程^[3~5]。

在以P-选择素为靶点开发的药物中，模拟P-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1）功能的药物已经取得进展^[6]。PSGL-1是P-选择素的主要天然配体，对P-选择素具有高亲和力，能够抑制P-选择素与其他细胞膜糖蛋白的结合，从而发挥抗黏附作用。以PSGL-1为原型，能够竞争性地结合P-选择素的药物主要分为3类：多糖类（如柴胡多糖等^[7，8]）、蛋白类（如重组免疫球蛋白rPSGL-Ig等^[9，10]）、化学合成分子（如PSI-697^[11]）。然而，多糖类与蛋白类药物的表达纯化过程往往较为复杂且成本高昂；化学合成分子药物又存在代谢模型较差，与P-选择素亲和力较低，难以抑制细胞黏附等问题，限制了这些P-选择素靶点药物的临床应用。

含糖聚合物(glycopolymer)是一种人工合成的、侧链或末端包含多个单糖或寡糖糖单元结构的高分子。研究发现，通过模拟天然多糖的结构，含糖聚合物包含的多个糖单元能够显著提高与配体的结合能力，提高生物活性，这被称作糖簇效应^[12~14]。因此，模拟PSGL-1的糖结构设计、合成P-选择素亲和的含糖聚合物是一种有潜力的可行技术方案。Moog等^[15]模拟PSGL-1的糖结构，将唾液酸化的路易斯寡糖、唾液酸单糖、半乳糖、岩藻糖等单糖、寡糖接枝到预先聚合的主链上得到一类含糖聚合物，这类聚合物能够有效结合P-选择素，是一种良好的细胞黏附抑制剂。该研究为炎症性疾病的治疗提供了新的思路。类似的研究也表明，PSGL-1糖蛋白结构中的岩藻糖和唾液酸结构在与P-选择素的结合中起到关键作用^[16，17]。Bartneck等^[18]设计并合成了一种以岩藻糖与N-乙酰神经氨酸作为糖单元、聚甲基丙烯酸2-羟丙基酰胺（poly(2-hydroxypropyl)-methacrylamide polymers, PHPMA）为主链的P-选择素亲和含糖聚合物，发现该含糖聚合物对肝脏炎症治疗有效。含糖聚合物的生物活性强度与含糖聚合物中糖单元的含量成正比^[19~21]。然而，Moog^[15]与Bartneck^[18]团队制备的PSGL-1模拟含糖聚合物是由单糖、寡糖接枝到聚合物主链上合成的，这限制了这些含糖聚合物的糖单元含量。

本研究以唾液酸中最具代表性的N-乙酰神经氨酸与岩藻糖为糖单元，分别合成了两种含糖单体，再通过可逆加成-断裂链转移（reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT）聚合法进行聚合和脱乙酰化，制备了一种新型P-选择素亲和含糖聚合物GP-SF。通过黏附实验对GP-SF与P-选择素的结合能力进行测试，并在体外考察了GP-SF与P-选择素结合能力带来的对血小板-B16细胞（小鼠黑色素瘤细胞）黏附的抑制能力和对COS 7细胞（非洲绿猴肾成纤维细胞）的细胞毒性。

1　 实验部分

1.1　主要仪器、材料及试剂

仪器：使用Advance Ⅲ磁共振仪（NMR, Bruker公司）检测样品的核磁共振波谱；使用Mobius^TM型凝胶渗透色谱-动态光散射联用仪（GPC, Wyatt公司，Shodex OHPak SB-803HQ柱）检测样品的分子量；使用CytoFLEX型流式细胞仪（Beckman Coulter公司）检测细胞的荧光强度；使用Multiscan Go型酶标仪（Thermo公司）检测MTT（噻唑蓝）实验中的紫外吸收情况；使用DMIL LED型荧光光学显微镜（Leica公司）观察细胞黏附情况。

材料及试剂：B16细胞和COS 7细胞来自中科院上海细胞研究所；P-Fc蛋白（重组P-选择素Fc嵌合蛋白，小鼠源IgG）购自R&D systems公司；山羊源抗小鼠IgG-FITC（山羊源抗小鼠免疫球蛋白-异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体）、RPMI-1640培养基、凝血酶（鼠源）来自生工生物工程有限公司；3-氨基丙炔（C₃H₅N）、丙烯酰氯、N-乙酰神经氨酸甲酯（C₁₂H₂₁NO₉）、4-二甲氨基吡啶(C₇H₁₀N₂)、抗坏血酸钠（C₆H₇NaO₆）与偶氮二异丁腈（AIBN，C₈H₁₂N₄）购自上海萨恩化学公司；噻唑蓝、十二烷基三硫代碳酸酯二甲基丙酸（C₁₇H₃₂O₂S₃）与岩藻糖（C₆H₁₂O₅）购自Sigma-Aldrich公司；叠氮化钠、溴化氢与其他常见试剂购自国药基团化学试剂有限公司。

1.2　丙烯酰胺丙炔单体的合成

图1为丙烯酰胺丙炔单体的合成反应式。将3-氨基丙炔a（20.0 g）和NaHCO₃（61.0 g）加入到二氯甲烷（200 mL）和水（200 mL）混合液中，充分溶解，在冰浴条件下滴入丙烯酰氯b (30 g)，升温至20 ℃，搅拌反应2 h。反应混合液用1 mol/L HCl中和至中性，再用二氯甲烷（200 mL×3）萃取并分离，得到的有机相用饱和NaCl溶液（200 mL）洗涤，再用无水Na₂SO₄干燥，抽滤去除不溶杂质。减压条件下浓缩有机相，得到丙烯酰胺丙炔c的粗产物。用硅胶色谱柱（V_乙酸乙酯∶V_甲醇=10∶1）对粗产物进行柱层析，得到14.0 g黄色固体c，得率38.8%。

1.3　 N-乙酰神经氨酸含糖单体的合成

图2为N-乙酰神经氨酸含糖单体的合成路线。将1 mL 4 mol/L HCl的甲醇溶液冷却至0 ℃，缓慢加入到40 mL乙酰氯中，保持反应体系温度在20 ℃以下，再缓慢加入6 g N-乙酰神经氨酸甲酯 1，室温搅拌反应24 h。反应液于30 ℃旋转蒸发浓缩，然后加入二氯甲烷稀释，依次用冷水、饱和NaHCO₃溶液以及饱和NaCl溶液反复洗涤，再用无水Na₂SO₄干燥，最终合并有机相减压蒸馏得到中间体2。

将中间体2溶解于50 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入10 g叠氮化钠，加温至50 ℃搅拌反应5 h，加入500 mL 水充分混合，用乙酸乙酯萃取中间体3。将有机相用无水Na₂SO₄干燥后过滤，减压蒸馏得到油状物，经过硅胶色谱柱（V_石油醚∶V_乙酸乙酯=2∶1）提纯得到中间体3约2 g。

将1.5 g中间体3与1 g丙烯酰胺丙炔1溶解于15 mL的乙醇中，通入氮气，加入1 g抗坏血酸钠（VcNa），保持50 ℃搅拌反应5 h，反应完毕后，将500 mL 水与反应液混合，用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，将滤液减压浓缩至油状物，经过硅胶色谱柱（V_乙酸乙酯∶V_甲醇=10∶1）柱层析，得到白色固体N-乙酰神经氨酸含糖单体4约1 g，得率55.1%。

1.4　可聚合乙酰化岩藻糖含糖单体的合成

图3为岩藻糖含糖单体的合成路线。将6 g岩藻糖5和0.5 g的4-二甲氨基吡啶溶解在60 mL的无水吡啶中，反应体系温度保持在15 ℃，在氮气氛下加入40 mL乙酸酐，保持15 ℃搅拌反应12 h。其后，将反应液冷却至0 ℃，加入40 mL乙酸乙酯与80 mL水，保持搅拌2 h。其后将反应混合液用盐酸调节pH值至 6.0，用乙酸乙酯萃取水层3次，合并萃取液用饱和NaCl溶液洗涤。分离的有机相加入无水Na₂SO₄干燥，过滤后减压蒸馏得到油状物，经过硅胶色谱柱（V_石油醚∶V_乙酸乙酯=10∶1）柱层析，得到中间体黏性液体6，得率50.0%。

将5 g中间体6溶解在120 mL的乙酸中，在氮气氛中逐滴加入到50 mL冰浴的48%溴化氢/乙酸溶液中后，室温下搅拌反应3 h。其后，将反应液冷却到-20 ℃，倒入过量NaHCO₃、冰水以及乙酸乙酯，搅拌30 min，用硅藻土过滤，滤液用二氯甲烷萃取多次。合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤多次后使用无水Na₂SO₄干燥，过滤后经减压蒸馏得到中间体7。

将8 g叠氮化钠溶解于70 mL DMF中，在氮气氛及冰浴下加入中间体7，搅拌溶解后升温至50 ℃搅拌反应12 h。将反应液与500 mL 二氯甲烷及500 mL水混合，室温搅拌反应2 h。有机相过滤除去不溶物后减压蒸馏，得到白色固体8约 2 g。

将0.5 g的中间体8与0.2 g丙烯酰胺丙炔1溶解于异丙醇与水的混合溶剂（V_异丙醇∶V_水=25∶8）中，加入0.1 g无水CuSO₄和0.5 g抗坏血酸钠，室温下搅拌5 h。反应结束后，将反应液与500 mL 二氯甲烷及500 mL水混合，搅拌30 min，混合液有机相用二氯甲烷反复萃取，合并后用饱和NaCl溶液洗涤并用无水Na₂SO₄干燥，经硅胶色谱柱（V_乙酸乙酯∶V_甲醇=10∶1）柱层析，得到白色固体岩藻糖含糖单体9，重0.4 g，得率59.3%。

1.5　含糖聚合物GP-SF的制备

图4为含糖聚合物GP-SF的合成路线。称取2 mmol（0.59 g）岩藻糖含糖单体和2 mmol（0.89 g） N-乙酰神经氨酸含糖单体溶于4 mL无水DMF中，加入0.08 mmol（29.17 mg）链转移剂十二烷基三硫代碳酸酯二甲基丙酸与0.02 mmol（3.28 mg）引发剂偶氮二异丁腈。将反应混合液加入聚合管中，在液氮冷冻状态下使用氮气置换管中的空气，解冻，重复此过程3次。然后，将密封的聚合管置于油浴锅中，80 ℃温度下搅拌反应36 h。反应管冷却后，向管中加入30 mL无水甲醇，滴加10 %甲醇钠/甲醇溶液至pH 10.0，室温搅拌1 h。反应液使用相对分子质量3 500透析袋透析72 h，冷冻干燥后得到目标含糖聚合物GP-SF（0.85 g），产率51.5%。

1.6　含糖聚合物的细胞毒性实验

采用MTT法测定含糖聚合物GP-SF对COS 7细胞的毒性。于96孔板上，每孔加入8×10³个COS 7细胞（100 μL），使用RPMI-1640培养基在37 ℃，含5% CO₂的培养箱中培养24 h，向各孔分别加入不同浓度的含糖聚合物, 继续培养24 h，使用MTT法检测存活的COS 7细胞，使用酶标仪记录570 nm处的光密度OD（n=5），由（1）式计算细胞存活率CV：

\mathrm{C}\mathrm{V}=\frac{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{1}}}{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{0}}}×100%（1）

（1）式中，OD₁代表经过含糖聚合物处理孔实验组570 nm处的吸光度，OD₀代表加入等体积培养基代替但不加含糖聚合物处理孔空白组的吸光度。

1.7　含糖聚合物与P-选择素的结合

取100 μL 10 μg/mL P-Fc蛋白的PBS溶液与100 μL 128 mg/mL含糖聚合物GP-SF PBS溶液混合，25 ℃孵化15 min，加入100 μL 1×10⁶/mL B16细胞悬浮液，混匀，25 ℃孵化15 min，离心去除上清，沉淀的B16细胞使用PBS溶液重悬浮，离心(400g（1g=9.8 m/s²）, 5 min)，清洗3次以去除未结合到B16细胞上的P-Fc蛋白。向各实验组分别加入100 μL 山羊源抗小鼠IgG-FITC（10 mg/mL），避光25 ℃孵化30 min。未结合的FITC同样使用离心法（400g, 5 min）除去。各实验组表面结合了P-Fc蛋白与山羊源抗小鼠IgG-FITC的B16细胞使用1 mL PBS溶液重新悬浮，使用流式细胞仪检测荧光强度以分析P-选择素的结合情况，各组P-选择素结合率由以（2）式计算：

\mathrm{结合}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{F}{\mathrm{I}}_{\mathrm{a}}-\mathrm{F}{\mathrm{I}}_{\mathrm{c}}}{\mathrm{F}{\mathrm{I}}_{\mathrm{b}}}×100%（2）

（2）式中，FI_a代表实验组（加入含糖聚合物、P-Fc蛋白及山羊源抗小鼠IgG-FITC）的荧光强度，FI_b代表空白组（加入P-Fc蛋白及山羊源抗小鼠IgG-FITC）的荧光强度，而FI_c代表对照组（仅加入山羊源抗小鼠IgG-FITC）的荧光强度。

1.8　含糖聚合物的抗黏附实验

小鼠血液于室温下200g离心10 min，取上层清液，即为富血小板血浆（PRP）。再将PRP在1 200 g离心5 min，弃去上层血浆，底部白色沉淀即为小鼠血小板。将小鼠血小板使用PBS溶液重悬浮，调整浓度至1×10⁸/mL，向96孔板每孔加入100 μL，并于37 ℃孵化1 h使血小板黏附在孔底。向每孔加入100 μL凝血酶（1 U/mL），保持温度继续孵化15 min，再向每孔加入128 mg/L GP-SF，孵化1 h。最后，每孔再加入100 μL B16细胞悬浮液（5×10⁶ /mL），37 ℃孵化1 h，洗去悬浮的未黏附B16细胞，使用荧光光学显微镜观察GP-SF的抗黏附效果，计数，计算黏附抑制率。

2　 结果与讨论

2.1　含糖聚合物的合成与表征

所制备包含岩藻糖糖单元与N-乙酰神经氨酸糖单元的P-选择素亲和含糖聚合物GP-SF的结构见图5。本研究通过化学法合成了两种可聚合乙酰化含糖单体，并将上述两种单体进行RAFT法聚合制备含糖聚合物GP-SF。

丙烯酰胺丙炔单体的¹H NMR谱如图6所示。其中，化学位移值δ 7.24~7.64处为单体中1处双键的氢特征峰，δ 7.80为单体中2处仲碳上的氢特征峰，δ 8.39处为单体中3处酰胺键的氢特征峰，δ1.51处为单体中4处伯碳上的氢特征峰，δ 1.27处为单体中5处三键的氢特征峰，所有标记质子峰均与丙烯酰胺丙炔单体结构吻合，与同类研究一致^[22，23]。丙烯酰胺丙炔单体的¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6）δ：27.96, 80.91, 73.01, 125.95, 131.11, 164.45。

岩藻糖与N-乙酰神经氨酸甲酯全乙酰化后，经卤代反应，将1号位的乙酰羟基先置换为卤素原子，卤素原子再置换为叠氮基。叠氮基可作为活性反应位点通过Click反应与丙烯酰胺丙炔的炔基结合，制备岩藻糖/N-乙酰神经氨酸含糖单体。两种单体的¹H NMR谱分别如图7和图8所示。以图7岩藻糖含糖单体的¹H NMR谱为例，反应完成后，在δ 7.88处出现叠氮环上的特征氢峰，说明叠氮与炔基发生了Click反应；在原有δ 2.25~2.87处乙酰基峰与δ 5.22~5.79处岩藻糖的糖环特征峰的基础上，在δ 6.13、5.87处出现了丙烯酰胺丙炔烯烃双键氢相对应的双峰^[24~26]，说明可聚合的含糖单体合成成功。同样，图8所示N-乙酰神经氨酸含糖单体的¹H NMR谱也表现出相似特征。岩藻糖含糖单体¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ: 170.43,169.89, 169.08,165.49,144.99,130.52,126.85,120.96, 86.41,72.76,71.16,69.79,68.13,34.85,20.70, 20.54,20.29,16.07。N-乙酰神经氨酸含糖单体¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ :170.84, 170.75, 170.34,170.32,170.08,166.31,165.47,130.50, 126.93,88.57,74.01,68.48,68.43,67.10,62.40, 54.17,49.26,36.14,34.97,26.98,23.19,21.19, 20.82,20.79,20.77。

通过RAFT聚合法，将岩藻糖（Fuc）含糖单体与N-乙酰神经氨酸（SA）含糖单体按照摩尔比1∶1进行共聚，得到乙酰基保护的含糖聚合物，通过甲醇钠脱去乙酰保护，透析3 d后冷冻干燥，得到含糖聚合物GP-SF。该聚合物的¹H NMR谱如图9所示。聚合后，两种单体带有的不饱和烯烃双键信号（如岩藻糖含糖单体中为δ 6.13与δ 6.29氢特征峰）均减弱甚至消失，在δ 1.00~2.30范围内出现聚合后主链上的氢信号，说明发生了目标聚合反应。另一方面，使用重水（D₂O）溶解的含糖聚合物表现为易溶，¹H NMR谱中δ 2.25~2.87范围内乙酰基团信号近乎消失，都证明聚合后的岩藻糖/N-乙酰神经氨酸含糖单体上的乙酰基保护已脱去。通过水相GPC谱测定含糖聚合物GP-SF的重均分子量为12 700，分子量多分散系数PDI为1.23。

2.2　GP-SF的细胞毒性与基于P-选择素亲和的抗黏附能力

含糖聚合物包含大量糖单元结构，其水溶性、生物相容性通常较好。本研究对不同浓度（0、64、128、256 μg/mL）下含糖聚合物GP-SF的细胞毒性进行了测试。结果表明，随着含糖聚合物浓度的增大，COS 7细胞存活率的并没有显著变化，在最大实验浓度（256 μg/mL）下依然保持较高（97.1%），说明GP-SF是一种无毒的大分子，具有良好的生物安全性。

P-选择素能够与多种肿瘤细胞表面大量表达的配体特异性结合，进而介导黏附，而这种结合可被能竞争性结合P-选择素的药物阻断^[4，6，15]。为了验证GP-SF是否能够竞争性结合P-选择素，从而拥有抗黏附功能，本研究设计了P-选择素竞争结合实验。如图10所示，在不加入山羊源抗小鼠IgG-FITC的空白组中，荧光强度很弱（no-FITC组，11 530）；仅加入山羊源抗小鼠IgG-FITC时，有一小部分FITC非特异性地结合于B16细胞上（no-P-Fc组，37 451)，说明检测到的荧光主要来自抗体偶联FITC；而在对照组中，重组P-Fc蛋白（mouse IgG）与山羊源抗小鼠IgG-FITC先后加入，最终结果表现为细胞群带有大量荧光（no-GP-SF组，252 465）。以上结果说明，单独加入的山羊源抗小鼠IgG-FITC与B16细胞直接结合较少，而会特异性地与P-Fc蛋白结合；当加入的P-Fc蛋白大量结合于B16细胞表面时，细胞群的荧光强度升高。因此，通过对比细胞群荧光染色的强度，即可分析P-选择素结合到B16细胞表面的程度，从而判断含糖聚合物GP-SF对于这一过程的影响。在实验组中，加入128 mg/L GP-SF孵化，结果表明含糖聚合物GP-SF极大地抑制了P-选择素与B16细胞表面的结合（GP-SF组，151 673），结合抑制率达到46.9%。以上结果说明含糖聚合物通过人工设计模拟P-选择素配体PSGL-1，拥有竞争性结合P-选择素的能力，从而能够减少P-选择素与肿瘤细胞表面配体的结合，进而抑制肿瘤细胞的黏附，符合预期设计。

在肿瘤发展进程中，常见的由P-选择素介导的细胞黏附发生在肿瘤细胞与血小板之间。活化血小板表面富表达的P-选择素与肿瘤细胞表面富表达的糖蛋白配体能够相互作用，而这种相互作用可通过P-选择素竞争性结合药物所阻断^{[27, 28]}。在本研究中，将活化的血小板结合于96-孔板底部，与GP-SF共孵育，再添加B16细胞进行静态黏附实验以检测GP-SF对于B16-血小板黏附的影响。如图11所示，对照组（Control）中未添加GP-SF，B16细胞与活化的血小板黏附较强，留存较多（左）；而加入GP-SF预孵化后（右），B16细胞-血小板之间的黏附明显受到了抑制，B16细胞留存较少。根据是否加入GP-SF各实验组的镜下B16细胞计数，黏附抑制率为62.7%。

3　 结 语

本研究首先制备两种乙酰化保护的可聚合的含糖单体，共聚合后脱去乙酰保护，制备了一种新型含糖聚合物。这种制备策略将有助于灵活地选用具有活性的糖单元，增加聚合物的糖单元含量并加强其生物活性。实验结果表明，包含岩藻糖和N-乙酰神经氨酸糖单元以模拟P-选择素配体PSGL-1结构的含糖聚合物GP-SF，能够有效地结合P-选择素，进而发挥抗黏附作用，抑制B16细胞与血小板的黏附。GP-SF在抗黏附方面表现出的应用潜力，为进一步开展含糖聚合物的治疗研究提供了新的思路。

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