高灵敏过氧亚硝酸根双光子荧光探针的构建与应用

Construction and Application of Highly Sensitive Two-Photon Fluorescent Probe for Peroxynitrite

摘要

炎症是生物体内与许多疾病相关的重要保护反应，过氧亚硝酸根（ONOO^－）参与炎症过程，与炎症有着密切联系。采用6-羟基-2，3，4，4a-四氢-1H-氧杂蒽-1-酮（GCTPOC）作为双光子荧光团（双光子荧光活性截面δΦ=262 GM（1 GM=1×10^-50 cm⁴·s·photons^-1·molecule^-1）， 激发波长 λ_ex=860 nm）设计并合成一种用于检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针GCT-ONOO。该探针具有良好的荧光响应，检出限低（13.5 nmol/L）、Stokes位移大（135 nm），可特异性识别ONOO^－。细胞急性炎症模型实验结果表明，该探针可实现细胞炎症过程中ONOO^－的荧光成像分析。

Abstract

Inflammation is an important protection reaction in living organisms associated with many diseases. Peroxynitrite (ONOO^－) is involved in the inflammatory processes and has an important relationship with inflammation. Herein, a two-photon fluorescence probe GCT-ONOO for detecting peroxynitrite was designed and synthesized using 6-hydroxy-2,3,4, 4a-tetrahydro-1H-oxanthracene-1-one (GCTPOC) as the two-photon fluorophore (two-photon fluorescence activity cross section δΦ=262 GM (1 GM=1×10^-50 cm⁴·s·photons^-1·molecule^-1), excitation wavelength λ_ex=860 nm). The probe can specifically recognize ONOO^- with good fluorescence response, low detection limit (13.5 nmol/L) and large Stokes displacement (135 nm). The results of cell experiment in acute inflammation model showed that the probe can achieve highly sensitive imaging analysis for peroxynitrite during cellular inflammation.

Graphical abstract

关键词

荧光探针 / 过氧亚硝酸根 / 双光子激光共聚焦成像 / 细胞炎症

Key words

fluorescent probe / peroxynitrite / two-photon laser confocal imaging / cell inflammation

0　 引 言

过氧亚硝酸根（peroxynitrite，ONOO^－）是一种细胞内源性活性氧物种（reactive oxygen species，ROS），由生物系统中超氧阴离子自由基（O₂^•-）和一氧化氮（NO）快速反应形成，具有抗菌活性和信号传导作用^[1]。体内ONOO^－浓度过高时，会氧化破坏DNA、蛋白质和脂质的结构，引起炎症反应导致细胞死亡。ONOO^－还可以硝化酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸，从而影响细胞的正常生长^[2~4]。因此，揭示细胞内ONOO^－的分布与浓度波动对于了解ONOO^－在不同生理或病理过程中的作用至关重要。

双光子激光共聚焦成像是一种重要的荧光成像工具^[5~7]，其较长的激发波长可以减少生物背景荧光，提高信噪比^[8]；对生物样品的损伤较小，适于生物样品的长时间成像观测；其焦点激发的方式可避免焦点以外的光漂白，从而提高空间分辨率^[9]；其近红外激发可实现深度组织成像^[10~12]。这些优势都为实时、原位检测生物体中ONOO^－的分布与水平变化提供了支持。然而，目前用于检测ONOO^－的大多数双光子荧光探针缺乏大的双光子荧光活性截面（δΦ），很难利用双光子激光共聚焦成像技术实现ONOO^－的荧光成像分析。

6-羟基-2,3,4,4a-四氢-1H-氧杂蒽-1-酮（GCTPOC）是Yuan课题组^[13]2013年合成的一种双光子荧光团。与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）及其刚性类似物相比，GCTPOC表现出如下优势：1) 从化学结构上看，GCTPOC使用氧桥将荧光团单元锁定成刚性平面结构，类似于GFP发色团的Z-异构体，以防止芳基-烯烃的自由旋转和双键的E/Z异构化；2) GFP生色团咪唑啉酮环中的两个氮原子被替换为碳原子，发色团中的酰胺官能团在GCTPOC中转变成羰基，具有更强的吸电子能力。可见，GCTPOC具有更有效的推-拉结构，因而具有更大的双光子荧光活性截面。

为此，本工作以GCTPOC为双光子荧光团、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮为ONOO^－的识别基团，设计并合成了一种用于检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针GCT-ONOO（图1），可特异性识别并检测细胞内ONOO^－。该探针对ONOO^－具有较短的反应时间（35 min），可应用于监测细胞外源性和内源性ONOO^－含量的变化，并可实现细胞炎症过程中对ONOO^－的高灵敏成像分析。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：SIN-1（5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-噁二唑盐酸盐）购自Cayman Chemical公司； DMEM细胞培养基购自Gibco公司；合成及细胞实验使用药品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所有溶剂均购自上海国药集团；所有试剂均为分析纯或更高纯级，使用前未经进一步纯化；实验所需溶液均使用超纯水配制。

仪器：UV-2550型紫外-可见分光光度计（UV-Vis，Shimadzu公司），RF-6000型荧光分光光度计（Shimadzu公司），LSM780 NLO型双光子激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss公司），6230 TOF型电喷雾-高分辨时间质谱仪（ESI-TOF，Agilent公司），Ascend 400型核磁共振仪（Bruker公司），Multiskan FC型酶标仪（ThermoFisher Scientific公司）。

1.2　探针GCT-ONOO的合成

GCTPOC和化合物1分别根据文献[14]和[15]方法合成。

GCT-ONOO的合成路线如图2所示。取300 mg GCTPOC（1.39 mmol）、525 mg 5-溴甲基-1-甲基吲哚啉-2,3-二酮（化合物1）（2.08 mmol）、60 mg NaOH（1.39 mmol）和20 mL无水乙腈于50 mL圆底烧瓶中，室温条件下搅拌反应8 h，采用薄层色谱法（TLC）监测反应过程。待反应完全后，用二氯甲烷萃取，再经柱层析分离（石油醚/乙酸乙酯体积比1∶1）得到橙色固体，即为GCT-ONOO，产率33.2%。产物的磁共振氢谱（¹H NMR，400 MHz, DMSO-d₆）化学位移值δ：7.75(d,J=8.1 Hz,1H),7.61(s,1H),7.34(d,J=8.6 Hz,2H),7.16(d,J=8.1 Hz,1H),6.71~6.55(m,2H),5.11(s,2H),5.03~4.94(m,1H),3.14(s,3H),2.40~2.35(m,2H),1.92(t,J=13.6 Hz,2H),1.67(t,J=9.7 Hz,1H),1.23(s,1H)；磁共振碳谱（¹³C NMR，100 MHz,DMSO-d₆）δ：196.68,183.72,161.83,158.77,157.44,151.54,138.16,132.05,131.71,130.71,128.19,125.42,117.94,115.83,111.05,109.99,102.43,75.01,69.01,38.69,29.46,26.56,17.80；高分辨质谱（HR-MS，ESI-TOF）数据：C₂₃H₂₀NO₅⁺[M+H]⁺ 理论值390.134 1；实验值390.135 6。

1.3　探针GCT-ONOO的性能测试

1.3.1　水溶性

配制不同浓度（0.25、5、10、15、20和25 µmol/L）的GCT-ONOO溶液，分别与300 µmol/L ONOO^－（由供体SIN-1产生）在37 ℃、170 r/min条件下反应35 min，然后测试体系的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱，观测体系在385 nm处吸光度的变化，考察GCT-ONOO的水溶性，并绘制标准曲线。

1.3.2　双光子荧光活性截面

采用双光子诱导荧光法测定GCT-ONOO于反应前后的双光子吸收截面^[16]。

首先，以10 µmol/L罗丹明B乙醇溶液为参比溶液，测得探针GCT-ONOO及GCTPOC在甲醇溶液中的荧光量子产率Φ_s。计算公式如下

{\Phi }_{\mathrm{s}}=\frac{A_{\mathrm{r}}(n_{\mathrm{s}}{)}^{\mathrm{2}}{F}_{\mathrm{s}}{\Phi }_{\mathrm{r}}}{A_{\mathrm{s}}(n_{\mathrm{r}}{)}^{\mathrm{2}}{F}_{\mathrm{r}}}

其中，A代表最大吸收波长的吸光度（A ≤ 0.05）；Φ代表量子产率，n代表溶剂的折射率；F代表利用最大吸收波长激发后的荧光光谱积分面积；下标s、r分别代表待测样品和参比溶液。此处，Φ_r为罗丹明B溶液的量子产率（0.71）。

以罗丹明6G的甲醇溶液（5 µmol/L）为参比溶液，测定GCT-ONOO在甲醇溶液中反应前后的双光子吸收截面δ（激发波长：760~900 nm），再通过δΦ计算双光子荧光活性截面。双光子吸收截面δ的计算公式如下：

{\delta }_{\mathrm{s}}=\frac{S_{\mathrm{s}}{\Phi }_{\mathrm{r}}(n_{\mathrm{s}}{)}^{\mathrm{2}}{c}_{\mathrm{r}}{\delta }_{\mathrm{r}}}{S_{\mathrm{r}}{\Phi }_{\mathrm{s}}(n_{\mathrm{r}}{)}^{\mathrm{2}}{c}_{\mathrm{s}}}

其中，S为双光子荧光光谱积分面积，c为溶液浓度；δ_r为罗丹明6G溶液的双光子吸收截面（70 GM，1 GM=1×10^-50 cm⁴·s·photons^-1·molecule^-1）。

1.3.3　光物理性质

配制含10 µmol/L GCT-ONOO，SIN-1分别为0、80 µmol/L的磷酸盐（PBS）缓冲液（pH 7.4，含10% DMSO（二甲基亚砜）），于37 ℃、170 r/min恒温振荡反应35 min，检测两种反应液的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，考察GCT-ONOO的光物理性质。

1.3.4　荧光发射光谱

配制含10 µmol/L GCT-ONOO、SIN-1分别为0、0.5、2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80 µmol/L的PBS缓冲液（pH 7.4，含10% DMSO），于37 ℃、170 r/min恒温振荡反应35 min。在激发波长为400 nm、激发和发射狭缝宽度均为5 nm条件下，扫描体系的荧光发射光谱。

1.3.5　时间依赖性

准确配制浓度为10 μmol/L的GCT-ONOO检测液（pH 7.4，含10% DMSO），测试该溶液分别与0、30、60 μmol/L SIN-1反应0、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min时的荧光发射光谱，并以每个时间点相应的荧光强度对时间作图。

1.3.6　pH稳定性

配制含10 µmol/L GCT-ONOO的检测液，在不同pH值的PBS缓冲液（pH值分别为5.0、5.4、5.8、6.2、 6.6、7.0、7.4、8.0、8.4，含10% DMSO）中，分别与0、60 µmol/L SIN-1溶液于37 ℃、170 r/min恒温振荡反应35 min，测试体系的荧光发射光谱，并以荧光强度对pH值作图。

1.3.7　选择性

向10 µmol/L的GCT-ONOO溶液中，分别加入生物分子（1.0 mmol/L 同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys））、活性氧（100 µmol/L 过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O₂^•-）和次氯酸（HClO））、活性氮（100 µmol/L 一氧化氮（NO）、亚硝酸根离子（NO₂^-））、活性硫（H₂S）、金属离子（20 µmol/L Fe³⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺）和ONOO^－（60 µmol/L）的PBS缓冲液（10 mmol/L, pH 7.4，含10% DMSO），于37 ℃、200 r/min恒温振荡反应35 min，测试体系的荧光发射光谱。

1.3.8　探针GCT-ONOO的检出限

GCT-ONOO对ONOO^－的检出限（LOD）根据LOD=3σ/k计算。其中，σ表示11组GCT-ONOO (10 µmol/L)溶液在520 nm处的荧光强度标准偏差，k表示GCT-ONOO在线性范围内的斜率。

1.4　探针GCT-ONOO的细胞实验

1.4.1　细胞培养

将处于对数生长期的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞，购自武汉尚恩生物技术有限公司，细胞数大于5×10⁵ cells/mL）置于含1%青霉素、1%链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37 °C培养箱（5% CO₂、95%空气）中培养。成像前一天将细胞转移至玻底培养皿（直径35 mm）中使其贴壁生长到合适密度。在与药物或刺激物共同孵育前，先用37 °C预热过的PBS缓冲溶液将细胞清洗两次，除去液体，置于含有药物或刺激物的新鲜培养基中继续孵育。细胞成像前将PC12细胞用PBS缓冲液清洗两次，成像时双光子激发波长为860 nm，荧光收集范围为480~580 nm（绿色通道）。

1.4.2　细胞毒性实验

采用MTT（噻唑蓝）法测定GCT-ONOO的细胞毒性。将PC12细胞接种于96孔板中，将0、5、10、20、30 µmol/L GCT-ONOO分别加入到含10% DMSO溶液的100 μL DMEM培养基中（每个浓度设置3组平行实验）。将上述用不同浓度GCT-ONOO标记的PC12细胞孵育24 h后，在每孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培育4 h，除去上清液，再加入150 µL DMSO溶液，低速振荡10 min，用酶标仪测试各体系在490 nm处的吸光度。根据GCT-ONOO标记组和对照组的吸光度计算细胞存活率。

2　 结果与讨论

2.1　探针GCT-ONOO的水溶性

首先考察了GCT-ONOO与ONOO^－反应后的水溶性。图3为不同浓度（0.25~25 µmol/L）GCT-ONOO与300 µmol/L ONOO^－反应后的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱。由图3可知，体系最大吸收峰（385 nm）处的吸光度值与GCT-ONOO浓度呈现出良好的正比例关系，相关系数R²=0.996；在GCT-ONOO浓度达到25 µmol/L时，最大吸光度仍在上升，说明GCT-ONOO具有良好的水溶性。这为GCT-ONOO用于水溶液检测和细胞成像奠定了基础。

2.2　探针GCT-ONOO的双光子荧光活性截面

通过双光子诱导荧光法测定并计算GCT-ONOO（5 µmol/L）与ONOO^－（80 µmol/L）反应前后的双光子荧光活性截面，结果如图4所示。实验结果表明，在760~900 nm范围内，GCT-ONOO与ONOO^－反应前双光子荧光活性截面很小，而反应后在860 nm处出现最大的双光子荧光活性截面（262 GM），表明该荧光染料具有良好的双光子性能，可应用于双光子共聚焦成像。

2.3　探针GCT-ONOO的光物理性质

进一步测试了GCT-ONOO（10 µmol/L）与ONOO^－（80 µmol/L）反应前后的UV-Vis光谱和荧光发射光谱。由图5(a)可以看出，GCT-ONOO反应前的吸收峰强度可忽略不计，而与ONOO^－反应后在385 nm处荧光强度显著增强，出现强吸收峰。由图5(b)可以看出，反应前探针背景荧光强度很低，反应后在520 nm处出现强吸收峰，Stokes位移达到135 nm。

2.4　探针GCT-ONOO的荧光响应

探究了GCT-ONOO(10 µmol/L, pH 7.4,含10% DMSO)对不同浓度ONOO^－(0~80 µmol/L)反应35 min 后的浓度依赖关系。如图6(a)所示，随着ONOO^－浓度的不断增加，反应体系在520 nm处的荧光强度不断增强，加入ONOO^－(80 µmol/L)比未加ONOO^－的反应体系荧光强度增加了34.6倍。图6(b)为520 nm处荧光强度与ONOO^－浓度的关系曲线。图6(c)显示，在0.5~60 µmol/L之间，GCT-ONOO溶液的荧光强度与ONOO^－浓度之间存在良好的线性关系，相关系数达0.996，由3σ/k（σ表示11组GCT-ONOO溶液(10 µmol/L)在520 nm处的荧光强度标准偏差，k表示GCT-ONOO滴定光谱曲线在线性范围内的斜率）计算得到检出限LOD为13.5 nmol/L，说明该探针的灵敏度高。图6(d)显示，探针GCT-ONOO与ONOO^－（30、60 µmol/L）可在35 min内反应完全，之后随着时间延长体系荧光强度基本保持不变，表明该探针对ONOO^－的响应较快。对GCT-ONOO与ONOO^－（60 µmol/L）在不同pH值的PBS缓冲液中的荧光响应进行了考察。如图6(e)所示，pH值对未加入ONOO^－的GCT-ONOO荧光强度几乎无影响，而对加入ONOO^－（60 µmol/L）后的体系荧光强度影响较大；pH 5.0~5.8范围内，GCT-ONOO与ONOO^－反应后荧光强度基本没有变化，而pH 5.8~8.4范围内，体系的荧光强度随着pH值的增加逐渐增强。这是因为在碱性条件下，GCT-ONOO与ONOO^－反应产物中的羟基变为氧负离子，给电子能力增强而发出更强的荧光。本文还探讨了GCT-ONOO(10 µmol/L)对13种不同干扰物的响应情况(1.0 mmol/L Hcy、GSH、Cys，100 µmol/L H₂O₂、O₂^{• -}、HClO、NO、NO₂^-、H₂S和20 µmol/L Fe³⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)。如图6(f)所示，除ONOO^－外，干扰物分子均未使探针GCT-ONOO的荧光强度发生明显变化，显示该探针对ONOO^－具有高度的选择性。

2.5　探针GCT-ONOO的细胞毒性

为了考察GCT-ONOO能否用于细胞内ONOO^－的检测，采用MTT（噻唑蓝）法评估GCT-ONOO的细胞毒性。结果显示，PC12细胞与不同浓度（0~30 µmol/L）的GCT-ONOO共孵育24 h，细胞存活率仍达到93%以上，说明该探针细胞毒性低，可用于后续的细胞成像分析。

2.6　细胞外/内源性ONOO^－的检测

先考察GCT-ONOO对细胞外源性ONOO^－的荧光成像。在PC12细胞中加入不同浓度的ONOO^－释放剂SIN-1（0、5、10、30 µmol/L）孵育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 µmol/L）继续孵育20 min，然后进行细胞成像。从图7结果可知，体系荧光强度随ONOO^－浓度的增加而增强，表明该探针可实现对外源性ONOO^－的检测。

SIN-1之所以可释放ONOO^－是因为它可同时释放NO和O₂^•-，随即反应生成ONOO^－[17]。因此，为了排除其他干扰物如活性氧及活性氮存在的潜在干扰，在体系中分别加入HClO及ONOO^－清除剂Minocycline（二甲胺四环素）、O₂^•-清除剂TEMPO（四甲基哌啶氮氧化物）和NO合成酶抑制剂AG（氨基胍）3种试剂，设置了6组细胞实验：a组将PC12细胞用GCT-ONOO（10 µmol/L）孵育20 min建立 Sham组；b组中加入30 µmol/L HClO孵育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 µmol/L）孵育20 min；c组将PC12细胞置于30 µmol/L SIN-1孵育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 µmol/L）孵育20 min建立对照组；d~f组在加入30 µmol/L SIN-1孵育30 min后，再分别加入5 µg/mL Minocycline、TEMPO和AG，然后加入GCT-ONOO（10 µmol/L）孵育20 min。如图8所示，加入SIN-1后体系荧光强度显著增加，而加入3种抑制剂及HClO后，荧光强度相对于对照组几乎可忽略，进一步表明GCT-ONOO在细胞中可灵敏且特异性地识别ONOO^－。

进一步考察了GCT-ONOO对细胞内源性ONOO^－的荧光成像。设计了5组实验：a组为Sham组；b组加入1 µg/mL脂多糖（LPS）、100 ng/mL γ-干扰素（IFN-γ）和10 ng/mL佛波酯（PMA）进行预处理以刺激细胞发生炎症并产生内源性ONOO^－，再加入GCT-ONOO（10 µmol/L）孵育20 min建立对照组；c~e组在加入与b组等量的LPS、IFN-γ和PMA后，分别加入20 µg/mL Minocycline、TEMPO和AG三种试剂孵育30 min，再加入GCT-ONOO（10 µmol/L）继续孵育20 min。如图9所示，只加LPS、IFN-γ和PMA三种刺激剂时，体系绿色荧光显著增强（b组），而加入Minocycline、TEMPO和AG后（c-e组），却只显示很微弱的荧光。结果表明，GCT-ONOO可用于检测细胞内源性ONOO^－。

3　 结 语

本文采用具有优异双光子荧光活性截面的GCTPOC为双光子荧光团、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮为ONOO^－的识别基团，设计并合成了一种ONOO^－双光子荧光探针GCT-ONOO。该探针水溶性较好，荧光响应倍数较高（荧光强度增加34.6倍）、响应速度较快（35 min）、灵敏度好（检出限低至13.5 nmol/L）、Stokes位移大（135 nm），选择性好，且可用于检测细胞外源性ONOO^－，并成功应用于细胞炎症模型中ONOO^－的荧光成像分析。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金(22166017)

湖北省重点实验室开放基金(PT012003)