LED光照增强Ag₂O/TiO₂复合材料抗变异链球菌的作用机理

Mechanism of Ag₂O/TiO₂ Composite Enhanced by LED Light against Streptococcus mutans

摘要

变异链球菌（Streptococcus mutans， S. mutans）感染是导致龋齿的主要原因。本研究将光催化剂Ag₂O/TiO₂复合材料与牙科常用的发光二极管（LED）固化灯相结合，探究了该材料在LED光照下对S. mutans的抗菌作用及机理。结果表明，Ag₂O/TiO₂复合材料在LED光照下抗菌作用显著增强，0.500 mg/mL Ag₂O/TiO₂在5 min照射后可将S. mutans全部杀死。进一步研究发现，Ag₂O/TiO₂在LED光照下产生羟基自由基（·OH）是抗菌活性增强的主要原因，材料产生的·OH进入细胞内，氧化生物大分子，从而导致细菌死亡。

Abstract

Streptococcus mutans (S. mutans) infection is the main cause of caries. In this study, the photocatalyst Ag₂O/TiO₂ composite was combined with light-emitting diode (LED) curing light commonly used in dentistry to explore the antibacterial effect and mechanism against S. mutans. The results showed that antibacterial effect of Ag₂O/TiO₂ composite was significantly enhanced under LED light, and 0.500 mg/mL Ag₂O/TiO₂ conbined with 5 min irradiation killed S. mutans completely. Further research found that the hydroxyl radical (·OH) produced by Ag₂O/TiO₂ under LED irradiation was the main reason for the enhanced antibacterial activity. The ·OH produced by the material entered the cells and oxidized the biomacromolecules, which resulted in the death of bacterial.

Graphical abstract

关键词

Ag₂O/TiO₂ / 变异链球菌 / LED固化灯 / 抗菌 / 机理

Key words

Ag₂O/TiO₂ / Streptococcus mutans / LED curing light / antibacterial / mechanism

0　 引 言

龋齿是一种慢性细菌性口腔疾病。细菌对食物中的碳水化合物进行发酵会产生酸性有害物质，这些有害物质通过局部破坏敏感的牙齿硬组织形成龋齿^[1]。龋齿对全球60%的儿童和几乎所有的成人造成影响，若治疗不及时，细菌会在牙齿表面产酸并形成牙菌斑生物膜，导致牙齿出现空洞或腐烂^[2]。变异链球菌(Streptococcus mutans，S. mutans)是致龋齿的主要病原菌，广泛存在于口腔中，与糖代谢产酸和牙菌斑有关^[3]。目前最常用的口腔抗菌药物有洗必泰^[4]和抗生素^[5]等。但是这些药物都存在着一些不足，如长时间使用洗必泰会造成牙齿变色、牙龈脱落和刺激口腔黏膜等问题^[6]，而过度使用抗生素会造成致龋细菌产生耐药性^[7]。因此，研究新的口腔抗菌策略具有重要意义。

近年来，光催化技术在抗菌领域的应用引起人们的广泛关注。光催化剂在光诱导下产生活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)，如羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O₂^-•)等，它们通过破坏细胞膜进入细胞内影响细菌活性^[8]。二氧化钛(TiO₂)因性能稳定、催化效率高、生物相容性好等优点而被广泛地应用于催化和抗菌领域^[9，10]，同时，因其长效抗菌效率、表面防腐蚀特性被广泛应用于口腔疾病的治疗^[11]。TiO₂在紫外光照射下对口腔致病菌白色念珠菌有抑制作用^[12]。但TiO₂的广泛应用受到其宽带隙(如锐钛矿型TiO₂带隙为3.2 eV)的限制^[13]。宽带隙使TiO₂只能被波长小于390 nm的紫外光激发，光利用率较低^[14，15]。将金属和金属氧化物负载至TiO₂的晶格中对其表面进行光敏化，能有效增强TiO₂的光利用率^[16]。铜等金属掺入TiO₂使其带隙向可见光谱移动，这使其在暴露于可见光时表现出光催化活性增强^[17]。少量的银掺入TiO₂也能在可见光照射下对S. mutans产生抗菌作用^[18]，但其抗菌机理尚未见报道。

发光二级管(light-emitting diode，LED)固化灯常用于牙科复合树脂等修复材料的光固化，其波长在420~480 nm可见光范围^[19]。有报道将LED固化灯与光敏剂联合应用于口腔细菌的治疗^[20]，但是这些光敏剂多为有机染料，具有生物相容性和稳定性较差等缺点。根据已有的研究^[21]，Ag/ZnO纳米复合材料与LED联合使用在5 min内能杀灭99.8%的S. mutans。Liu等^[13]也发现Ag₂O/TiO₂复合材料能够在可见光下被激发产生ROS抑制大肠杆菌的生长。本实验室前期发现单独的Ag₂O/TiO₂长时间(24 h)作用于S. mutans有明显的抗菌效果^[22]，但长时间的药物作用不利于牙科疾病的治疗。基于上述工作，本研究将Ag₂O/TiO₂复合材料与牙科常用的LED固化灯结合，测定材料在LED光照下短时间(5 min)的抗菌活性以及抗菌机理，为其用于牙科疾病治疗提供理论基础。

1　 实验和方法

1.1　试剂和仪器

试剂：钛酸四丁酯(TBT)(天津百世有限公司)，硝酸银(AgNO₃)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(阿拉丁试剂有限公司)，活死细菌染色试剂盒LIVE/DEAD BacLight^TM Bacterial Viability Kit1897713 (Thermo Fisher公司)，对苯二甲酸(TA)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)(Adamas试剂有限公司)，厌氧产气袋(三菱瓦斯化学株式会社AnaeroPack)，二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)(Sigma有限公司)；上述试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化；变异链球菌UA159 (Streptococcus mutans UA159，S. mutans)来自武汉大学口腔医学院，培养基为心浸液肉汤培养基(BHI，Oxoid公司)和琼脂粉(BioFroxx生物试剂公司)。

仪器：D8 ADVANCE型X射线粉末衍射仪(XRD，Bruker公司)，JSM 5510LV型扫描电镜(SEM，日本电子株式会社)，GeminiSEM 300型场发射电子扫描电镜(FE-SEM，Carl Zeiss公司)，F-4700型荧光分光光度计(日本电子株式会社)，UV-2600型紫外-可见分光光度计(UV-Vis，岛津公司)，Ⅸ73型倒置荧光显微镜(奥林巴斯公司)；采用牙科临床常用的LED55-B型LED灯(TPC医疗器械有限公司，420 nm<λ<480 nm，150 mW/cm²)作为光源，灯源截面直径为0.6 cm，灯源与混合液液面保持0.5 cm的距离。

1.2　Ag₂O/TiO₂的制备和表征

Ag₂O/TiO₂的制备参照文献方法^[23]。取2 mL TBT溶液(质量分数98%)逐滴加入60 mL冰醋酸中，超声分散后将混合液倒入反应釜中，于160 °C反应5 h，8 000 r/min离心10 min，所得沉淀经洗涤、干燥后研磨得到白色TiO₂粉末。将Ag₂O和TiO₂按摩尔比1∶10制备Ag₂O/TiO₂。称取0.2 g合成的TiO₂超声分散于25 mL去离子水中，与25 mL 20 mmol/L AgNO₃溶液超声混合，在避光条件下向上述混合液中逐滴加入25 mL 0.2 mol/L NaOH溶液，反应30 min后以8 000 r/min转速离心10 min，所得沉淀经洗涤、干燥后研磨得到淡黄色Ag₂O/TiO₂粉末。

样品的组成通过XRD在2θ=10°~80°范围内表征，漫反射光谱(DRS)通过紫外-可见分光光度计在200~800 nm范围扫描获得，形貌通过FE-SEM观察。

1.3　抗菌实验和活死细菌染色

过夜培养的S. mutans用BHI液体培养基稀释至2×10⁷ CFU/mL，分别与终浓度为0.125、0.250、0.500 mg/mL的Ag₂O/TiO₂ BHI悬浮液和1 mg/mL的TiO₂ BHI悬浮液在96孔板中混合均匀，总体积为120 μL。LED固化灯光照5 min，将菌液倍比稀释后取10 μL均匀涂布在培养皿上，于37 °C培养24 h后进行平板计数。未被材料和LED光作用的细菌设为对照组，实验重复3次。

用活死细菌染色试剂盒对光照作用完成后的菌液进行染色处理0.5 h。其中染色剂SYTO 9和PI的终浓度分别为6 μmol/L和30 μmol/L。取10 μL染色后的菌液滴加到载玻片上，用荧光显微镜观察。未被材料和LED光作用的细菌作为对照组。

1.4　细菌形貌观察

LED固化灯照射Ag₂O/TiO₂（0.500 mg/mL）和S. mutans的混合液5 min，用2.5%戊二醛在4 ºC固定细菌细胞2 h，然后用酒精（50%）将细菌脱水3 min，再分别用75%、85%、95%和100%酒精进行梯度脱水，用FE-SEM观察细菌的形貌。未被材料和LED光作用的组设为对照组。

1.5　ROS检测

反应过程中产生的ROS利用TA和NBT检测。TA本身无荧光，但与·OH反应生成2-羟基对苯二甲酸复合物时产生荧光，且荧光强度与·OH浓度直接相关；NBT在259 nm处有吸收峰，当与O₂^-•反应后此吸收峰消失^[24]。将0.125、0.250、0.500 mg/mL的Ag₂O/TiO₂悬浮液分别与终浓度为20 μmol/L TA溶液和20 μmol/L NBT溶液混合，LED光照5 min后检测混合溶液在315 nm光的激发下，425 nm处发射峰的荧光强度和259 nm处吸收峰的光强度。

细胞内ROS利用荧光探针DCFH-DA检测。DCFH-DA本身没有荧光，进入细胞后被酯酶水解生成DCFH。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的二氯荧光素（DCF）^[25]。用LED分别光照0.125、0.250、0.500 mg/mL的Ag₂O/TiO₂和2×10⁸ CFU/mL S. mutans混合液，再向体系中加入100 μmol/L DCFH-DA，检测混合溶液在488 nm光激发下，在535 nm处发射峰的荧光强度。

2　 结果与讨论

2.1　Ag₂O/TiO₂复合材料的表征

图1(a)为复合材料的XRD图，所合成的TiO₂衍射峰与锐钛型TiO₂ (JCPDS 4-477)的特征峰相一致；复合材料中除了能观察到TiO₂的衍射峰以外，还能观察到Ag₂O的特征峰(JCPDS 1-1041)，表明Ag₂O/TiO₂成功合成。图1(b)是合成样品的DRS图，TiO₂仅能吸收波长小于390 nm的光，负载Ag₂O颗粒后，Ag₂O/TiO₂在200~800 nm波长范围内都表现出高的吸收，表明Ag₂O/TiO₂具有广谱的光吸收能力。TiO₂和Ag₂O/TiO₂的SEM图分别如图1(c)和(d)所示，可以观察到TiO₂为直径1~2 μm的微球，TiO₂负载Ag₂O后形貌和大小均无明显改变。

2.2　Ag₂O/TiO₂+LED对S. mutans的抗菌活性

图2(a)~(b)显示了LED光照下Ag₂O/TiO₂对S. mutans的抗菌活性。由图2(a)可知，1 mg/mL TiO₂在5 min LED光照下对浮游态S. mutans几乎无抗菌作用，0.500 mg/mL Ag₂O/TiO₂在无LED光照时对S. mutans的存活数量也无明显影响(图2(b))。但Ag₂O/TiO₂在LED照射5 min后，S. mutans的菌落数明显减少。与无光照相比，LED光照使0.125、0.250 mg/mL Ag₂O/TiO₂作用S. mutans的菌落数的lgCFU分别下降了1.33和3.58，使0.500 mg/mL Ag₂O/TiO₂将S. mutans全部杀死(图2(b))。以上结果表明LED光照有效增强了Ag₂O/TiO₂在短时间内对S. mutans的杀灭作用。根据报道，氧化铜纳米颗粒对S. mutans的最低抑菌浓度为1 mg/mL^[26]；二氧化铈纳米颗粒对S. mutans的最低抑菌浓度为1 mg/mL^[27]；银修饰的还原石墨烯纳米复合物对S. mutans的最低抑菌浓度为1.28 mg/mL^[28]；锂掺杂的生物玻璃对S. mutans的最低抑菌浓度为50 mg/mL^[29]；1 mg/mL Ag/ZnO在LED光照条件下能杀死99.8%的S. mutans^[21]。可见，利用LED光照增强Ag₂O/TiO₂抗菌活性，可以使用相对较小量的催化剂达到与文献相当的抑菌效果。

为了更加直观地观察LED光照增强Ag₂O/TiO₂的抗菌效果，加入荧光染色剂SYTO 9（绿色荧光）和PI（红色荧光）分别对活、死细菌进行染色。如图2(c)所示，未经处理的空白组（Control）和仅用LED或仅用Ag₂O/TiO₂作用5 min的组别，呈现的几乎都是绿色荧光，表明上述操作均不能杀灭浮游态S.mutans；而在Ag₂O/TiO₂与LED固化灯联用的组别中，可以看到荧光全部呈现红色，说明浮游态S. mutans几乎被完全杀灭。

2.3　Ag₂O/TiO₂+LED作用后S. mutans的形貌

细菌结构的破坏是导致其死亡的原因之一。如图3(a)~(d)所示，在未经处理的空白组(图3(a))和仅用LED(图3(b))或仅用Ag₂O/TiO₂作用5 min(图3(c))的组别中，细菌细胞表面光滑圆润，形貌未受到影响。而在Ag₂O/TiO₂与LED联用(图3(d))的组别中，可以明显观察到细菌细胞表面变得粗糙、皱缩，出现破损，表明细菌遭到破坏。

2.4　Ag₂O/TiO₂+LED产生的ROS种类

光催化材料在光照条件下产生的ROS主要为·OH和O₂^{-• [11]}。本文考察了LED光照下Ag₂O/TiO₂产生的ROS种类，结果如图4(a)~(d)所示。为了检测LED光照Ag₂O/TiO₂所产生的ROS种类，引入·OH的捕获剂TA和O₂^-• 的捕获剂NBT。Ag₂O/TiO₂和TA在无LED光照条件下作用5 min，反应体系中仅0.500 mg/mL的Ag₂O/TiO₂可以检测到少量的·OH产生(图4(a))；而Ag₂O/TiO₂在LED光照后，即使Ag₂O/TiO₂浓度低至0.125 mg/mL也能产生·OH，且·OH的生成量显著高于未加光照的高浓度组的生成量(图4(b))。图4(c)和(d)是NBT捕获O₂^-• 的实验结果，可以看到，无论在有或无LED光照射下，Ag₂O/TiO₂均没有O₂^-• 的产生。以上结果表明，在LED光照下Ag₂O/TiO₂的体系中产生的ROS为·OH。

2.5　LED光照增强Ag₂O/TiO₂抗菌活性的机理

光催化材料在光照时产生ROS，这些ROS进入细菌内部会氧化DNA、脂质、蛋白质等生物大分子，导致细菌死亡^[30]。

为了探究Ag₂O/TiO₂在LED光照下是否通过产生ROS发挥抗菌作用，加入ROS捕获剂NAC对材料在光照下产生的ROS进行捕获并测定其抗菌活性。由图5(a)可知，单独的NAC (5 mmol/L)在LED光照下对S. mutans无抗菌作用；Ag₂O/TiO₂+LED能够在5 min内杀灭S. mutans；而Ag₂O/TiO₂+LED组在加入NAC后，S. mutans的存活率与空白组相比几乎无改变。上述结果表明，LED增强Ag₂O/TiO₂的抗菌活性主要通过光照使材料产生ROS，从而发挥抗菌作用。

为了进一步确定ROS能否进入细菌细胞内使细菌发生氧化损伤，采用DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS。如图5(b)所示，无光照条件下Ag₂O/TiO₂作用5 min仅产生低的荧光强度，表明胞内ROS产生较少；而LED光照Ag₂O/TiO₂作用S. mutans 5 min后，荧光强度显著提高，说明LED光照Ag₂O/TiO₂使S. mutans细胞内的ROS显著地增加(图5(c))。这些ROS氧化了胞内生物大分子，导致了细菌死亡。

3　 结 语

本文将Ag₂O/TiO₂复合材料与牙科常用LED固化灯结合，测定在LED短时间(5 min)照射下Ag₂O/TiO₂复合材料对龋齿主要致病菌S. mutans的抗菌活性，并探讨了其作用机理。根据本文的结果，LED固化灯光照显著增强了Ag₂O/TiO₂复合材料在短时间内对S. mutans的杀灭能力。其机制涉及LED光照使Ag₂O/TiO₂产生·OH，破坏了细菌细胞结构，并进入细菌细胞内，促使细菌细胞内ROS含量增加，从而破坏生物大分子的功能。LED光照射Ag₂O/TiO₂复合材料的抗菌治疗方法简便、易行，作用时间短，抗菌效果显著，具有应用于牙科临床抗菌的潜力。

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基金资助

国家自然科学基金(21371139)

武汉工程大学研究生创新基金(CX2020342)