基于石墨烯量子点的类过氧化物酶活性用于过氧化氢的检测

Graphene Quantum Dots with Peroxidase-Like Activity for the Detection of Hydrogen Peroxide

摘要

以石墨纳米颗粒为原料，通过超声剥离法与化学氧化法分别制备出含氧量较低的石墨烯量子点（GQDs）与含氧量较高的石墨烯量子点（GOQDs）。采用透射电子显微镜（TEM）、Fourier变换红外光谱 （FT-IR）、荧光分光光度计及电化学阻抗（EIS）分别对GQDs和GOQDs的粒径、结构、荧光性能及电子传递速率进行表征。具有类过氧化物酶活性的GQDs和GOQDs可催化过氧化氢 （H₂O₂） 将无色的3，3'，5，5'-四甲基联苯胺 （TMB） 氧化为蓝色，催化反应遵循Michaelis-Menten 动力学模型；GQDs和GOQDs对于底物H₂O₂的米氏常数 （K_m） 分别为26.19 mmol/L与15.880 mmol/L，表明含氧量较高的GOQDs具有更高的类过氧化物酶活性。基于GOQDs构建的传感器对H₂O₂的检出限为0.4 μmol/L （S/N=3），在0.002~2.4 mmol/L范围内具有较好的线性关系，为H₂O₂的检测提供了一种简便有效的方法。

Abstract

Graphene quantum dots (GQDs) with low oxygenous content and oxidized GQDs (GOQDs) with high oxygenous content were prepared by the ultrasonic stripping and the oxidation of graphite nanoparticles, respectively. The size, structure, fluorescent property, and electron transfer rate of both GQDs and GOQDs were characterized by transmission electron microscopy (TEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), fluorescence spectrophotometer, and electrochemical impedance spectroscopy (EIS), respectively. Both GQDs and GOQDs exhibited the peroxidase-like activity, and could catalytically oxidize the colorless 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) by hydrogen peroxide (H₂O₂) into a blue solution. The catalytic reaction followed the Michaelis-Menten kinetic model and the Michaelis constants (K_m) for H₂O₂ by GQDs and GOQDs as peroxidase was 26.19 mmol/L and 15.880 mmol/L, respectively. The results show that GOQDs with high oxygenous content had high catalytic activity as peroxidases. The linear range of GOQDs for H₂O₂ detection was 0.002-2.4 mmol/L with 0.4 μmol/L for the detection limit (S/N=3), which provides a simple and effective method for H₂O₂ detection.

Graphical abstract

关键词

石墨烯量子点 / 过氧化物酶 / 含氧量 / 催化活性

Key words

graphene quantum dot / peroxidase / oxygenous content / catalytic activity

0　 引 言

纳米酶 (nano-enzyme) 是具有类酶活性的纳米催化材料，与天然酶和传统人工酶相比，具有稳定性好、成本低、可重复利用、便于修饰等优点^[1~3]。纳米酶已经成功模拟了包括氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和水解酶等天然酶，在生物传感、癌症诊断、组织工程、环境保护等多个领域得到应用^[4~9]。碳质纳米材料作纳米酶具有稳定性好、廉价易得、生物毒性低以及易于化学修饰等特点，受到广泛的关注^[10]。1996年，Dugan等^[11]首次报道富勒烯及其衍生物具有类似超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性^[11]，随后越来越多的碳质纳米材料，包括碳纳米管^[12，13]、石墨烯量子点(GQDs) ^[14，15]、氮化碳^[16，17]等相继被发现具有类酶活性。Zheng等^[18]报道了GQDs具有高效的类过氧化物酶催化活性，其活性远远高于大尺寸氧化石墨烯。Sun等^[15]通过选择性失活特定的含氧官能团，探究了GQDs表面官能团对GQDs衍生物作为过氧化物酶模拟物的催化活性，发现GQDs表面的羰基 (—C=O) 是催化活性位点，羧基 (—COOH) 可作为底物的结合位点，羟基 (—OH) 对催化反应起到抑制作用。Nirala等^[14]研究了外界因素对GQDs作为类过氧化物酶的催化活性的影响，发现GQDs的催化活性与催化剂的用量、底物的浓度、检测液的pH值和温度密切相关。目前，GQDs的过氧化物酶性质研究还处于初期阶段，尚缺乏深入的基础研究。因此，如何提高GQDs作过氧化物酶的活性以促进GQDs在催化领域的应用，具有重要意义。

本文采用超声剥离法与化学氧化法分别制备了含氧量较低的GQDs与含氧量较高的GOQDs，用于3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)与过氧化氢 (H₂O₂) 体系 (TMB/H₂O₂)的催化，探讨了GQDs表面的含氧量对其类过氧化物酶催化活性的影响，并在此基础上构建的一种基于GOQDs的H₂O₂分析方法。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：石墨纳米颗粒（GNPs，纯度高于93%，平均直径为3~4 nm）购自SkySpring纳米材料公司；C₂H₅OH、H₂SO₄、K₄[Fe(CN)₆]‧3H₂O、K₃[Fe(CN)₆]、KMnO₄、H₂O₂ (30%)、HCl等试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,3',5,5'-四甲基联苯胺购自上海麦克林生化科技有限公司；实验室用水均为超纯水。

仪器：JEM-2100F 型高分辨透射电子显微镜 (TEM, JEOL公司)、Autolab PGSTAT302N 型电化学工作站 (Metrohm公司)、Avatar 360 型 Fourier 变换红外光谱仪 (FT-IR, Thermo Nicolet公司)、RF-6000型 荧光分光光度计 (Shimadzu 公司)、TU-1901 (UV-Vis)型双光束紫外-可见光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2　GQDs、GOQDs及修饰电极的制备

1.2.1　GQDs 的制备

将30 mg GNPs加入到100 mL圆底烧瓶中，加入30 mL乙醇/水(体积比1∶1)，在冰浴中超声振荡6 h，所得悬浊液以10 000 r/min 转速离心20 min，收集上层清液，旋转蒸发去除溶剂，重新分散到超纯水中，所得浅棕色分散液记为GQDs。

1.2.2　GOQDs 的制备

将0.5 g GNPs加入到含17 mL H₂SO₄与0.38 g NaNO₃的250 mL 圆底烧瓶中，置于冰浴中，剧烈搅拌下缓慢加入2.5 g KMnO₄，反应2 h后，向反应体系中加入50 mL超纯水。然后，向上述溶液中滴加2 mL 30%的H₂O₂，将反应体系转入到250 mL HCl/H₂O（体积比为1∶10）溶液中，以20 000 r/min转速离心20 min，去除上清液，反复加入超纯水洗涤，直至悬浮液接近中性。将上述悬浮液在冰浴中超声3 h，以10 000 r/min转速离心30 min，收集上层棕色清液，记为GOQDs。

1.2.3　修饰电极的制备

采用粒径为0.3 mm和0.05 mm Al₂O₃粉末依次对玻碳电极 (GCE，直径3.0 mm) 进行抛光，超声清洗后，用N₂吹干电极表面。电极倒置，将5 μL GQDs溶液滴在GCE表面，室温风干，得到GQDs修饰的GCE电极，记为GQDs/GCE。

同上述步骤，制备GOQDs修饰的GCE电极，记为GOQDs/GCE。

1.3　电化学检测

循环伏安法（CV）、电化学阻抗法（EIS）与电流-时间曲线（I-t）测试均在电化学工作站上进行。以饱和甘汞电极作参考电极、铂丝作对电极、GCE及其修饰电极 (GQDs/GCE、GOQDs/GCE) 作工作电极，组成三电极体系。

CV测试在0.2 mol/L pH 3.8的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(CPBS)中进行，电势扫描范围为-1.0~ +0.2 V，扫描速率为 50 mV/s，测试过程中采用N₂保护。EIS测试在含10 mmol/L K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆(摩尔比1∶1)的0.1 mol/L KCl溶液中。在0.2 mol/L pH 3.8 CPBS 中，连续加入不同浓度的H₂O₂，采集GOQDs/GCE修饰电极的I-t数据。

1.4　GQDs和GOQDs的类过氧化物酶活性测试

以TMB/H₂O₂体系的显色反应考察GQDs和GOQDs的类过氧化物酶活性，操作步骤如下：依次将10 μL GQDs (0.2 mg/mL)、100 μL H₂O₂ (50 mmol/L)、100 μL TMB (0.8 mmol/L) 和1 mL乙酸盐缓冲液 (0.2 mol/L, pH 3.5) 加入到离心管中，置于50 ℃水浴中反应10 min，测试反应后的溶液在500~800 nm 波长范围内的吸收光谱。

同上述步骤，考察GOQDs的类过氧化物酶活性。

2　 结果与讨论

2.1　材料表征

2.1.1　TEM 分析

采用TEM对GQDs与GOQDs的粒径与形貌进行表征，结果如图1所示。由图1可知，所制备的GQDs与GOQDs粒径较均一,形状接近圆形,且具有较好的分散性。分别对200颗左右的GQDs与GOQDs进行粒径统计，GQDs与GOQDs的平均粒径分别为（3.3±0.2） nm与（3.4±0.5） nm，两种碳质纳米颗粒的粒径接近。

2.1.2　FT-IR 分析

采用FT-IR对GQDs与GOQDs表面的官能团进行表征，结果如图2所示。由图2可知，位于3 440、1 610、1 110 cm^-1 处的吸收峰分别归属于GQDs与GOQDs表面上羟基(—OH)伸缩振动、羰基(C=O) 伸缩振动及(C—O—C)醚键伸缩振动。而GOQDs谱图在1 740、1 242 cm^-1处有羧基中的C=O伸缩振动和C—O伸缩振动。由此可知，与GQDs相比，GOQDs表面具有更丰富的含氧官能团，这归因于GOQDs制备过程中采用了强氧化反应体系。

2.1.3　XPS 分析

采用XPS技术对GQDs与GOQDs的组成进行表征，结果如图3所示。由图3可知，GQDs与GOQDs均由C和O组成，位于 284. 2 eV 和534.5 eV 的特征峰分别归属于C 1s与O 1s。对目标元素C 1s和O 1s的峰面积进行积分，采用相对灵敏度因子法^[19]得到各目标元素的百分含量，GQDs与GOQDs中O/C的含量之比分别为0.11与0.52。由此可以得出，与GQDs相比较，GOQDs表面具有更丰富的含氧官能团，与FT-IR测试结果一致。

2.1.4　荧光分析

采用荧光分光光度计，在240~500 nm 波长范围内，以20 nm幅度改变激发波长，观察GQDs与GOQDs的水溶液发射波长的变化，结果如图4所示。由图4可知，GQDs与GOQDs的荧光发射波长随激发波长的改变而改变，其荧光性能表现出激发依赖性；GQDs的最佳发射波长位于390 nm，GOQDs的最佳发射波长位于536 nm；在365 nm紫外灯照射下，GQDs水溶液呈现蓝色荧光，而GOQDs水溶液呈现蓝绿色荧光。与GQDs相比较，GOQDs 的荧光发射波长有比较明显的红移，这归因于GOQDs表面含氧官能团的增加^{[19, 20]}。

2.2　GQDs与GOQDs的类过氧化物酶催化活性

2.2.1　GQDs/GCE与GOQDs/GCE修饰电极的CV分析

将GQDs与GOQDs分别修饰到GCE电极上，在含6 mmol/L H₂O₂的0.2 mol/L pH 3.8 CPBS 中采用CV测试考察GQDs与GOQDs作为类过氧化物酶对底物H₂O₂的催化能力，结果如图5所示。由图5可知，在相同实验条件下，相对于裸电极GCE，GQDs/GCE与GOQDs/GCE对底物H₂O₂均有较大的响应电流，这归因于GQDs与GOQDs的类过氧化物酶催化活性^[14，15]；相对于GQDs/GCE，GOQDs/GCE上的响应电流增加显著，在-0.92 V附近，GQDs/GCE与GOQDs/GCE对H₂O₂的还原电流峰值分别为0.38、1.65 mA，GOQDs展现出更好的催化活性。CV测试结果表明，GQDs与GOQDs均对H₂O₂展现出类过氧化物酶活性，含氧量较高的GOQDs展现出更好的催化活性。

2.2.2　GQDs/GCE与GOQDs/GCE修饰电极的EIS分析

采用EIS技术测试GQDs/GCE与GOQDs/GCE在含10 mmol/L K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ (1∶1) 的0.1 mol/L KCl溶液中对电子的转移能力^[21]，结果如图6所示。由图6可知，以[Fe(CN)₆]^3-/4-作探针的交流阻抗图谱中，裸电极GCE的电子转移阻碍常数(R_et) 为780 Ω；修饰电极GQDs/GCE的R_et几乎为0，表明GQDs碳质纳米材料具有良好的导电性能；修饰电极GOQDs/GCE的R_et增加至8 780 Ω，表明GOQDs对探针具有较强的排斥作用，这归因于GOQDs表面丰富的含氧官能团降低了碳质纳米材料的导电性能，抑制了电极表面的电子传递。

2.2.3　GQDs与GOQDs的类过氧化物酶活性

采用TMB/H₂O₂体系的显色反应考察GQDs和GOQDs的类过氧化物酶活性。如图7(a)(b)所示，GQDs和GOQDs均可通过催化H₂O₂的反应，将溶液中的TMB氧化为氧化态TMB (oxTMB)，溶液由无色变为蓝色，oxTMB在652 nm处具有特征吸收峰 (曲线e与f)^[22]；当GQDs或者GOQDs单独与TMB反应时，溶液仍然为无色，无法被氧化(曲线c与d)，从而证实GQDs与GOQDs具有类过氧化物酶活性。图7(b)显示了GOQDs 催化H₂O₂氧化TMB显色的过程。

采用酶动力学实验探究GQDs与GOQDs的类过氧化物酶活性，在保持TMB或H₂O₂浓度不变的条件下，通过改变另一底物的浓度，进行酶促反应^[22]。如图7(c)~(f)所示，底物TMB的浓度在0~0.12 mmol/L或底物H₂O₂的浓度在0~300 mmol/L的范围内，GQDs或GOQDs与TMB/H₂O₂体系的催化反应遵循Michaelis-Menten动力学模型^[23]，即满足1/v=K_m/(v_max[S])+1/v_max，其中，v为不同底物浓度下的初始反应速率；[S]为底物的浓度；K_m为米氏常数（为反应速度达到最大速度一半时的底物浓度，通常用于表示酶与底物的亲和力，K_m数值越小，酶与底物的亲和力越强）；v_max为最大初始反应速率。通过方程式的斜率和截距可以得出K_m和v_max。

GQDs的类过氧化物酶活性：对于TMB，K_m=0.040 mmol/L，v_max=3.69×10^-8 mol/(L·s)； 对于H₂O₂，K_m=26.19 mmol/L，v_max=30.92×10^-8 mol/(L·s)。GOQDs的类过氧化物酶活性：对于TMB，K_m=0.011 mmol/L，v_max=3.11×10^-8 mol/(L·s)；对于H₂O₂，K_m=15.880 mmol/L，v_max=13.64×10^-8 mol/(L·s)。GOQDs的K_m值低于GQDs，说明GOQDs对于底物H₂O₂具有更好的亲和力。与目前报道的其他碳质纳米材料的类过氧化物酶活性相比（见表1），本文中GOQDs的K_m值更低，具有更高的催化活性^[15]。

2.2.4　GOQDs/GCE的I-t曲线分析

通过施加-0.92 V外加电场，在 0.2 mol/L CPBS (pH 3.8) 中连续加入H₂O₂，测试GOQDs/GCE对目标物H₂O₂的响应电流。如图8(a)所示，加入低至0.002 mmol/L H₂O₂时，催化电流有明显的增加，随着H₂O₂的连续加入，相应电流呈阶梯式增加。如图8(b)所示，在 0.002~2.4 mmol/L 范围内，GOQDs/GCE 的电流响应与H₂O₂的浓度有较好的线性关系，线性拟合方程为I(mA)=-0.357 3 c (mmol/L)-0.120 9 (R²=0.995)，检出限为0.4 μmol/L (信噪比S/N=3)。在H₂O₂浓度低至0.002 mmol/L时，响应电流在3 s内能达到稳态，表明GOQDs/GCE对小分子有较好的响应，归因于GOQDs表面上存在类过氧化物酶的活性位点^[15]。

3　 结 语

本文以GNPs为原料，制备了含氧量低的GQDs与含氧量高的GOQDs，探究了含氧量对GQDs类过氧化物酶活性的影响。实验结果表明，相对于修饰电极GQDs/GCE，GOQDs/GCE对电子具有较大排斥作用，但对小分子H₂O₂具有更大响应电流；GQDs与GOQDs均具有类过氧化物酶活性，相对于GQDs，GOQDs的K_m数值更小，对底物具有更好的亲和力；含氧量高的GOQDs展现出更好的类过氧化物酶活性，证实丰富含氧官能团对GQDs的类过氧化物酶活性具有重要作用，为提高GQDs过氧化物酶催化活性提供了思路。在此基础上，构建GOQDs/GCE的检测平台对H₂O₂的检出限为0.4 μmol/L (S/N=3)，在0.002~2.4 mmol/L范围内具有较好的线性关系，为H₂O₂检测提供了一种简便有效的方法。

参考文献

[1] WEI H， WANG E K. Nanomaterials with enzyme-like characteristics （nanozymes）： Next-generation artificial enzymes［J］. Chemical Society Reviews， 2013， 42（14）： 6060-6093. DOI：10.1039/c3cs35486e .

[2] WU J， WANG X Y， WANG Q， et al. Nanomaterials with enzyme-like characteristics （nanozymes）： Next-generation artificial enzymes （Ⅱ）［J］. Chemical Society Reviews， 2019， 48（4）： 1004-1076. DOI：10.1039/c8cs00457a .

[3] LIANG M M， YAN X Y. Nanozymes： From new concepts， mechanisms， and standards to applications［J］. Accounts of Chemical Research， 2019， 52（8）： 2190-2200. DOI：10.1021/acs.accounts.9b00140 .

[4] CHENG H， WANG X， WEI H. Artificial enzymes： The next wave［J］. Encyclopedia of Physical Organic Chemistry， 2016： 1-64. DOI：10.1002/9781118468586.epoc5016 .

[5] DUGAN L L， TURETSKY D M， DU C， et al. Carboxy fullerenes as neuroprotective agents［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1997， 94（17）： 9434-9439. DOI：10.1073/pnas.94.17.9434 .

[6] MANEA F， HOUILLON F B， PASQUATO L， et al. Nanozymes： Gold-nanoparticle-based transphosphorylation catalysts［J］. Angewandte Chemie （International Ed in English）， 2004， 43（45）： 6165-6169. DOI：10.1002/anie.200460649 .

[7] ALI S S， HARDT J I， QUICK K L， et al. A biologically effective fullerene （C60） derivative with superoxide dismutase mimetic properties［J］. Free Radical Biology and Medicine， 2004， 37（8）： 1191-1202. DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2004.07.002 .

[8] COMOTTI M， DELLA PINA C， MATARRESE R， et al. The catalytic activity of “naked” gold particles［J］. Angewandte Chemie （International Ed in English）， 2004， 43（43）： 5812-5815. DOI：10.1002/anie.200460446 .

[9] BARE S R， KELLY S D， SINKLER W， et al. Uniform catalytic site in Sn-β-zeolite determined using X-ray absorption fine structure［J］. Journal of the American Chemical Society， 2005， 127（37）： 12924-12932. DOI：10.1021/ja052543k .

[10] SUN H J， REN J S， QU X G. Nanozymology［M］. Singapore： Springer Singapore， 2020： 171-193. DOI：10.1007/978-981-15-1490-6_7 .

[11] DUGAN L L， GABRIELSEN J K， YU S P， et al. Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitotoxic and apoptotic death of cultured cortical neurons［J］. Neurobiology of Disease， 1996， 3（2）： 129-135. DOI：10.1006/nbdi.1996.0013 .

[12] XIA Y K， LIU M M， WANG L L， et al. A visible and colorimetric aptasensor based on DNA-capped single-walled carbon nanotubes for detection of exosomes［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2017， 92： 8-15. DOI：10.1016/j.bios.2017.01.063 .

[13] ZHANG Q Z， ZHAO B， YAN J， et al. Nanotube-based colorimetric probe for ultrasensitive detection of ataxia telangiectasia mutated protein［J］. Analytical Chemistry， 2011， 83（23）： 9191-9196. DOI：10.1021/ac2023684 .

[14] NIRALA N R， KHANDELWAL G， KUMAR B， et al. One step electro-oxidative preparation of graphene quantum dots from wood charcoal as a peroxidase mimetic［J］. Talanta， 2017， 173： 36-43. DOI：10.1016/j.talanta.2017.05.061 .

[15] SUN H J， ZHAO A D， GAO N， et al. Deciphering a nanocarbon-based artificial peroxidase： Chemical identification of the catalytically active and substrate-binding sites on graphene quantum dots［J］. Angewandte Chemie （International Ed in English）， 2015， 54（24）： 7176-7180. DOI：10.1002/anie.201500626 .

[16] MU X Y， HE H， WANG J Y， et al. Carbogenic nanozyme with ultrahigh reactive nitrogen species selectivity for traumatic brain injury［J］. Nano Letters， 2019， 19（7）： 4527-4534. DOI：10.1021/acs.nanolett.9b01333 .

[17] FAN Y F， ZHANG W C， LIU Y M， et al. Three-dimensional branched crystal carbon nitride with enhanced intrinsic peroxidase-like activity： A hypersensitive platform for colorimetric detection［J］. ACS Applied Materials & Interfaces， 2019， 11（19）： 17467-17474. DOI：10.1021/acsami.9b04320 .

[18] ZHENG A X， CONG Z X， WANG J R， et al. Highly-efficient peroxidase-like catalytic activity of graphene dots for biosensing［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2013， 49： 519-524. DOI：10.1016/j.bios.2013.05.038 .

[19] BAO L， ZHANG Z L， Tian Z Q， et al. Electrochemical tuning of luminescent carbon nanodots： From preparation to luminescence mechanism［J］. Advanced. Material， 2011， 23， 5801-5806. DOI：10.1002/adma.201102866 .

[20] LONG Y M， ZHOU C H， ZHANG Z L， et al. Shifting and non-shifting fluorescence emitted by carbon nanodots［J］. Journal of Materials Chemistry， 2012， 22（13）：5917-5920. DOI：10.1039/c2jm30639e .

[21] ZHANG X R， QI B P， Li Y， et al. Amplified electrochemical aptasensor for thrombin based on bio-barcode method［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2009， 25： 259-262. DOI：10.1016/j.bios.2009.06.026 .

[22] SHI W B， WANG Q L， LONG Y J， et al. Carbon nanodots as peroxidase mimetics and their applications to glucose detection［J］. Chemical Communications， 2011， 47（23）： 6695-6697. DOI：10.1039/C1CC11943E .

[23] JIANG B， DUAN D， GAO L， et al. Standardized assays for determining the catalytic activity and kinetics of peroxidase-like nanozymes［J］. Nature Protocols， 2018， 13（7）： 1506-1520. DOI：10.1038/s41596-018-0001-1 .

[24] WANG H， LIU C Q， LIU Z， et al. Specific oxygenated groups enriched graphene quantum dots as highly efficient enzyme mimics［J］. Small， 2018， 14（13）： 1703710. DOI：10.1002/smll.201703710 .

[25] WANG X H， QU K G， XU B L， et al. Multicolor luminescent carbon nanoparticles： Synthesis， supramolecular assembly with porphyrin， intrinsic peroxidase-like catalytic activity and applications［J］. Nano Research， 2011， 4（9）： 908-920. DOI：10.1007/s12274-011-0147-4 .

基金资助

湖北省教育厅科学技术研究项目(B2021157)

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目(PT012106)

湖北民族大学高水平科研成果校内培育项目(PY22006)

湖北民族大学博士启动基金项目(MY2015B019)