负载分子信标的生物矿化纳米载体用于检测microRNA

Molecular Beacon-Loaded Biomineralized Nanocarrier for MicroRNA Detection

摘要

为了提高分子信标（MB）检测肿瘤细胞内微小核糖核酸（miRNA）的灵敏度和准确性，设计了一种酸响应的生物矿化纳米载体BSA/CaP，可高效负载MB制备MB@BSA/CaP纳米探针，用于人源乳腺肿瘤细胞中miRNA-155的检测。BSA/CaP纳米载体为中空球型结构，负载MB后粒径增大，MB负载量最高达到331.24 nmol/L，包封率为82.81%，可在酸性环境中（pH 5.00）释放MB。MB@BSA/CaP纳米探针更容易被肿瘤细胞摄取，其摄取效率是商用脂质体载体的约5倍，可将更多的MB递送至细胞内与miRNA-155结合，显著增强探针对细胞内miRNA-155的荧光成像检测灵敏度。同时，由于BSA/CaP纳米载体可保护MB不被核酸酶降解，减少了假阳性信号的产生，提高了探针检测的准确性。

Abstract

In order to improve the sensitivity and accuracy of molecular beacon (MB) in the detection of microRNA(miRNA) in tumor cells, the MB@BSA/CaP nanoprobe was obtained by loading MB on the acid-responsive biomineralized BSA/CaP nanocarrier for the detection of miRNA-155 in human breast tumor cells. The size of the nanocarrier with hollow structure increased after loading MB. The loading capacity and encapsulation efficiency of MB@BSA/CaP were calculated to be 331.24 nmol/L and 82.81%. The nanocarrier could release MB under acidic environment (pH 5.00). The cellular uptake efficiency of the nanoprobe was about 5 times as high as that of commercial liposome carriers. Therefore, more MBs could be delivered by the nanocarrier into cells and bind to miRNA-155, thereby significantly enhancing the detection sensitivity of the probe for intracellular miRNA-155 fluorescence imaging. In addition, the BSA/CaP nanocarrier could protect the MB from being degraded by nucleases, reducing the generation of false positive signals and improving the detection accuracy of probe.

Graphical abstract

关键词

纳米载体 / 分子信标 / 微小核糖核酸检测 / 细胞成像

Key words

nanocarrier / molecular beacon / microRNA detection / cell imaging

0　 引 言

微小核糖核酸microRNA（简称miRNA）是一类长度为19~23个核苷酸的短单链非编码RNA，其异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关，因此miRNA作为肿瘤标志物和治疗靶点的研究受到了广泛关注^{[1, 2]}。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是基因检测中最常用的miRNA检测方法，但由于设备昂贵、检测过程复杂，只能用于体外检测，不能满足在活细胞中检测miRNA的需求。分子信标（molecular beacon，MB）作为最常用的核酸探针具有高生物相容性和高选择性，且易于合成、可设计性强，在基因检测方面表现出很大优势^[3~5]。MB是一类具有茎环（stem-loop）发夹结构的单链核酸分子，识别序列位于环路区域，其茎区域荧光团的荧光易被附近的猝灭基团猝灭^[4]；当遇到特定RNA时，MB的发夹结构与其形成稳定的杂化双链而打开，可使荧光恢复^[6，7]。因此，可以利用体系中MB荧光信号的变化来检测目标RNA。但通常情况下，游离的MB不易被活细胞摄取，而易被细胞内的核酸酶降解，导致假阳性信号的产生，从而影响MB的检测效果^[8]。为了实现活细胞内高灵敏度检测miRNA，迫切需要设计一种能将MB高效递送至细胞内的纳米载体。用于递送MB的无机纳米载体主要有金属及其化合物^[9，10]、金属-有机框架^[11]、碳基材料^[12]等。但这些材料存在难以降解的问题，可能导致生物毒性。使用不同的生物模板（如蛋白质和多肽）修饰无机物，可以得到生物矿化纳米载体，制备方法简单、降解性能好，且易于修饰，具有广阔的临床应用前景^{[13, 14]}。磷酸钙、碳酸钙、硅酸钙等是生物硬组织的主要无机成分，可以在酸性环境下降解成无毒的离子，参与生命体的正常代谢。因此，基于磷酸钙、碳酸钙、硅酸钙等的生物矿化纳米材料具有良好的生物相容性和降解性能，可用于递送蛋白质、多肽和药物，广泛用于疾病的诊断与治疗^[15~18]。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为一种生物矿化相关蛋白，其分子中的酸性残基可以螯合过饱和亚稳态溶液中的Ca²⁺形成成核位点，不断浓缩Ca²⁺以增加局部过饱和度，随后在磷酸盐参与下，自发形成磷酸钙（CaP）^[19，20]。基于以上研究，本文以白蛋白为生物模板，表面矿化磷酸钙，得到一种生物矿化纳米载体BSA/CaP，再通过Ca²⁺与MB的静电相互作用负载MB，得到纳米探针MB@BSA/CaP，并将其用于检测肿瘤细胞中过表达的标志物miRNA-155。

1　 实验部分

1.1　试剂及仪器

仪器：RF-6000型荧光光谱仪（Shimadzu公司），Nicolet iS10型Fourier转换红外光谱仪（FT-IR，Thermo Scientific公司），JEM-2100型透射电子显微镜（TEM，JEOL公司），ZS90型纳米粒度电位仪（DLS，马尔文公司），LSM-880型多光子共聚焦荧光显微镜（CLSM，Zeiss公司）。

试剂：氯化钙、BSA均为国产分析纯试剂；噻唑蓝（MTT）、细胞核染色剂（Hoechst 33342）均为国产生化纯试剂；脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅰ）购自宝生物工程（大连）有限公司；Dulbecco改良培养基（DMEM）和商用脂质体载体（Lipofectamine 2000）均来自赛默飞世尔科技公司；DNA寡核苷酸和miRNA购于上海生工生物工程公司，详细序列见表1；实验用水均为超纯水。

1.2　合成方法

1.2.1　BSA/CaP纳米载体的合成

根据文献方法^[19]制备纳米载体。将10 mg BSA加入到1 mL DMEM（含有0.9 mmol/L PO₄^3-）培养基中，用封口胶密封，在37 ℃培养箱中静置孵育24 h后，加入10 μL CaCl₂（1 mol/L）溶液，继续孵育24 h，13 300 r/min离心15 min，用超纯水清洗干净，得到BSA/CaP纳米载体。将BSA/CaP在超纯水中分散，配制1 mg/mL分散液，于-20 ℃保存备用。

1.2.2　MB@BSA/CaP纳米探针的合成

将10 mg BSA加入到1 mL DMEM培养基中，用封口胶密封，在37 ℃培养箱中静置孵育24 h。将10 μL CaCl₂（1 mol/L）分别与不同浓度的MB分散液（100~400 nmol/L）混合，振荡2 h，加入到上述体系中，继续孵育24 h，13 300 r/min离心15 min，用超纯水清洗干净，得到MB@BSA/CaP纳米探针。将MB@BSA/CaP在超纯水中分散，配制1 mg/mL分散液，于-20 ℃保存备用。

另外，将商用脂质体载体Lipofectamine 2000（1 mg/mL, 2 μL）与MB分散液（100 μmol/L,1 μL）混合，加入100 μL培养基，静置20 min，得到Lipofectamine 2000/MB，用作细胞实验的对照组。

1.3　检测方法

测试MB的选择性。将100 nmol/L的miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-21、miRNA-221、miRNA-let 7a、miRNA-155与100 nmol/L的MB在pH为7.40的Tris-HCl杂交缓冲溶液（含1 mmol/L的MgCl₂和100 mmol/L的 KCl）中共孵育40 min，用荧光光谱仪测试体系的荧光光谱，考察MB的选择性。此MB的荧光基团是FAM，猝灭基团是BHQ1。

使用仅修饰荧光团FAM的MB-FAM测试在BSA/CaP纳米载体中的负载量。将10 μL 1 mol/L CaCl₂溶液分别与不同浓度（100、200、300、400 nmol/L）的MB-FAM混合，振荡2 h。样品用超纯水多次离心、洗涤，除去未负载的MB-FAM。根据MB-FAM荧光标准曲线，计算负载量和包封率。

测试纳米载体的保护性能。将不同MB负载量的MB@BSA/CaP纳米探针在超纯水中分散，使MB的终浓度均为100 nmol/L。在MB分散液和不同MB负载量的MB@BSA/CaP分散液中分别加入10 μL的100 U/mL DNase Ⅰ，于摇床中37 ℃振荡30 min，测试体系的荧光光谱。同时检测相同条件下不加DNase Ⅰ的体系的荧光光谱。此实验中使用的MB荧光基团是FAM，猝灭基团是BHQ1。

1.4　细胞内检测miRNA-155

人源乳腺癌细胞（MCF-7细胞）和鼠源脑微血管内皮细胞（bEnd.3细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司）的培养：将细胞置于含10%胎牛血清、1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂的湿润环境中培养。

为了检测细胞内miRNA-155，首先将MCF-7细胞（或bEnd.3细胞）接种于35 mm玻璃底培养皿中，每皿的接种密度为1×10⁵个细胞，于培养箱中37 ℃孵育24 h，移去培养基，再加入含有Lipofectamine 2000/MB或MB@BSA/CaP的新鲜培养基，MB的终浓度为100 nmol/L，再次孵育6 h，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗3次，加入细胞核染色剂Hoechst 33342（终浓度7.5 μg/mL）与细胞共培养10 min，标记细胞核，最后用共聚焦荧光显微镜进行细胞成像分析。此实验中使用的MB荧光基团是Cy5，猝灭基团是BHQ2。

2　 结果与讨论

2.1　BSA/CaP纳米载体的表征

本文制备了BSA/CaP纳米载体，并通过多种测试手段对其表征，如图1和图2(a)~(d)所示。从CaP、BSA和BSA/CaP的FT-IR图（图1）可以看出，BSA/CaP的谱中同时观察到BSA的C=O振动特征峰（1 643 cm^-1）和CaP的P—O振动特征峰（1 036 cm^-1），证明BSA/CaP纳米载体成功合成。从BSA/CaP的TEM图（图2(a)）可以看出，BSA/CaP纳米载体为中空球型结构，平均尺寸约60 nm；BSA/CaP的DLS图（图2(b)）显示，BSA/CaP的水合粒径为118 nm，分散系数（PDI）为0.119，具有良好的分散性；BSA/CaP的Zeta电位图（图2(c)）显示，BSA/CaP表面带负电荷，其表面电位与BSA的电势接近。将BSA/CaP负载带正电荷的荧光染料Cy7，分别加入到pH 5.00和pH 7.40的缓冲溶液中，考察了体系的荧光强度变化。如图2(d)所示，在中性环境中（pH 7.40），体系荧光强度（激发波长λ_ex=750 nm，发射波长λ_em=796 nm）较弱，说明有少量的Cy7从载体中释放；而当pH值为5.00时，体系荧光信号显著增强，表明有大量Cy7从载体中释放。这是由于BSA/CaP纳米载体中的CaP在酸性环境下水解生成了钙离子和磷酸根离子^[15]，使载体不稳定，导致大量Cy7的释放。 纳米载体的酸响应性能有助于其在细胞溶酶体酸性环境（pH 5.00）中快速释放负载的MB，并在钙离子作用下促进MB从溶酶体中逃逸，与细胞质中miRNA-155反应，避免MB在溶酶体中长时间滞留而被酶降解，从而提高探针检测miRNA-155的灵敏度。

2.2　MB@BSA/CaP纳米探针的表征

对MB@BSA/CaP纳米探针进行表征，结果如图3(a)~(c)所示。在构建MB@BSA/CaP纳米探针之前，首先考察了MB对miRNA-155的选择性。此MB的荧光基团是FAM，猝灭基团是BHQ1。如图3(a)所示，MB与miRNA-155共孵育40 min后，体系的荧光强度（λ_ex=490 nm，λ_em=523 nm）显著增强，增强倍数（F/F₀）为25，而与miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-21、miRNA-221和miRNA-let 7a等非目标miRNA几乎不发生反应，表明MB对miRNA-155表现出良好的响应能力和选择性。

将仅修饰荧光基团FAM的MB-FAM负载到BSA/CaP纳米载体中，考察体系荧光强度（λ_em=523 nm）的变化，并根据体系荧光强度随浓度变化的标准曲线（图3(b)），计算负载量和包封率，结果如图3(c)所示。在BSA/CaP纳米载体中加入400 nmol/L MB-FAM时，MB-FAM的负载量为331.24 nmol/L，包封率为82.81%，表明BSA/CaP纳米载体可高效负载MB-FAM。

研究了不同MB负载量对MB@BSA/CaP纳米探针的粒径和形貌的影响。如图4所示，不同MB负载量的纳米探针形貌相似，均为中空球型结构，且随着加入MB浓度的逐渐增加，纳米探针的粒径由（57.7±3.3） nm增加至（78.1±4.0） nm。进一步通过DLS测得MB@BSA/CaP纳米探针的水合粒径也是随着MB负载量的增加而增大（表2），但其PDI值始终在0.200左右，表明纳米探针具有良好的分散性。

2.3　MB@BSA/CaP纳米探针的抗DNase Ⅰ降解性能

研究了游离MB和不同MB负载量MB@BSA/CaP纳米探针抗DNase Ⅰ（1 U/mL）降解的性能，结果如图5(a)所示。游离的MB与DNase Ⅰ共孵育后荧光显著增强，是由于游离MB容易在DNase Ⅰ作用下被降解，荧光基团和猝灭基团之间距离增大，荧光共振能量转移（FRET）作用消失，从而使荧光信号恢复。相比之下，不同MB负载量MB@BSA/CaP纳米探针与DNase Ⅰ共孵育，荧光强度发生了不同程度的增强。当MB的加入量为100 nmol/L或200 nmol/L时，纳米探针的荧光信号仅有微弱增强，表明纳米载体可以有效阻止MB被DNase Ⅰ降解。当MB的加入量为300 nmol/L或400 nmol/L时，荧光信号增强明显，证明MB部分被DNase Ⅰ降解，纳米载体的保护作用有所减弱。这是因为加入MB浓度过大时，MB会吸附至纳米载体外表面，导致纳米载体的保护作用减弱。分别将游离的MB和不同MB负载量MB@BSA/CaP纳米探针与目标物miRNA-155（100 nmol/L）在杂交缓冲溶液中共孵育（如图5(b)所示），可以发现，随着MB负载量增加，纳米探针对miRNA-155响应的荧光信号逐渐增强，也证明了纳米载体对MB的保护作用逐渐减弱。因此，为了提高纳米探针在细胞内检测miRNA的准确性，避免产生假阳性信号，MB的加入量应低于200 nmol/L。

2.4　MB@BSA/CaP纳米探针的细胞内荧光成像

将不同用量的MB@BSA/CaP纳米探针与MCF-7细胞共孵育24 h后，通过MTT（噻唑蓝）法测定细胞存活率，考察了MB@BSA/CaP纳米探针的细胞毒性。纳米探针的用量在10~400 μg/mL范围内，细胞存活率均大于90%，表明纳米探针细胞毒性低，具有良好的生物安全性，适用于细胞成像。

研究了MB@BSA/CaP纳米探针对MCF-7细胞内miRNA-155的荧光成像。此实验中使用的MB荧光基团是Cy5，猝灭基团是BHQ2。将游离MB、MB@BSA/CaP和Lipofectamine 2000/MB分别加入到MCF-7细胞中共孵育（MB 100 nmol/L），通过共聚焦荧光显微镜观察成像效果，结果见图6。如图6(a)所示，MCF-7细胞与游离MB共孵育几乎无明显荧光，这是因为游离MB很难穿透细胞膜而被细胞摄取，导致成像效果差。将商用脂质体载体Lipofectamine 2000负载MB制备探针Lipofectamine 2000/MB，加入到MCF-7细胞中，观察到较明显的红色荧光。而在MCF-7细胞中加入MB@BSA/CaP纳米探针后观察到强烈红色荧光，是由于纳米探针被MCF-7细胞摄取后，在胞内溶酶体酸性环境下释放MB与miRNA-155杂交，使MB的发夹结构打开，荧光恢复。根据图6(b)，MB@BSA/CaP组的细胞平均红色荧光强度是Lipofectamine 2000/MB组细胞的5.07倍。这也进一步证实MB@BSA/CaP比Lipofectamine 2000更容易被MCF-7细胞摄取，能够将更多的MB递送至细胞内与miRNA-155反应，从而提高MB检测细胞内miRNA的灵敏度。

miRNA-155可能与多种肿瘤的发生和发展有密切关系^{[21, 22]}。因此，进一步通过测定MB@BSA/CaP（MB 100 nmol/L）纳米探针在肿瘤细胞（MCF-7）和正常细胞（bEnd.3）中的荧光强度，评估不同细胞内miRNA-155的表达。如图7所示，与bEnd.3细胞相比， MCF-7细胞与MB@BSA/CaP纳米探针共孵育后的体系显示出更强的荧光信号，其平均红色荧光强度是bEnd.3细胞体系的8.10倍。这是由于肿瘤细胞中表达了更多的miRNA-155所致。结果表明，该纳米探针可对细胞内不同表达量的miRNA-155进行可视化成像检测。

3　 结 语

本文利用生物矿化法构建了一种酸响应的生物矿化纳米载体BSA/CaP，通过静电相互作用高效负载MB，制备了MB@BSA/CaP纳米探针。该纳米探针制备方法简单、分散性良好，为中空球型结构，MB负载量高（331.24 nmol/L），其粒径随着MB负载量的增加而增大，且细胞毒性低，可被肿瘤细胞高效摄取,并可用于胞内miRNA-155可视化成像检测。另外，该纳米载体可保护MB不被DNase Ⅰ降解，从而减少假阳性信号的产生，提高了探针检测的准确性。本工作为肿瘤标志物的检测提供了一种新颖可靠的方法，有望在复杂的生理环境中识别肿瘤细胞。

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基金资助

国家自然科学基金(22107025)