基于窄内径毛细管-LIF检测系统的miR-221-3p超小体积无扩增检测

Amplification-Free Determination of miR-221-3p in Ultra-Small Volume Based on Narrow Capillary-LIF Detection System

摘要

微小核糖核酸（microRNA， miRNA）是多种疾病和生物过程的一类标志物，无扩增的miRNA检测具有保真度高以及成本低的特点。本研究采用内径为1.06 µm的窄内径毛细管作为检测通道，耦联高灵敏的激光诱导荧光（LIF）检测系统用于微小核糖核酸221-3p（miR-221-3p）的超小体积无扩增检测。以miR-221-3p为靶标设计锁核酸（LNA）修饰的分子信标（MB）探针LNA/MB-221，该探针在MgCl₂溶液浓度大于3 mmol/L时背景信号较弱，背景干扰更小；杂交温度为65 ℃时杂交样品的荧光信号更强。探针与靶标miR-221-3p的杂交样品在低浓度范围（1~10 nmol/L）内线性关系较好，样品消耗仅850 fL时检出限达到8.5×10^-22 mol（约508个分子）。该方法也可实现人胚肺成纤维细胞HFL-1和非小细胞肺癌细胞A549的无扩增检测及相对表达量分析。

Abstract

Micro-ribonucleic acid (microRNA, miRNA) is a class of important biomarkers for a variety of diseases and biological processes. Amplification-free determination of miRNA has the characteristics of high fidelity and low cost. In this study, a narrow capillary with an inner diameter of 1.06 µm was used as the detection channel and coupled with a highly sensitive laser-induced fluorescence (LIF) detection system for amplification-free determination of micro-ribonucleic acid 221-3p (miR-221-3p) in ultra-small volume. The molecular beacon probe with locked nucleic acid (LNA/MB-221) modification for miR-221-3p was designed. The probe had weak background signal when the concentration of MgCl₂ solution was greater than 3 mmol/L, providing less background interference, and the signal was better when the hybridization temperature was 65 ℃. The hybrid of miR-221-3p with LNA/MB-221 probe had excellent linearity in the concentration range of 1 nmol/L to 10 nmol/L. The limit of detection with the sample consumption of 850 fL was 8.5×10^-22 mol (approximately 508 molecules). We used this method to detect the miR-221-3p level in human fetal lung fibroblast 1 (HFL-1) and non-small cell lung cancer cell (A549), and realized the non-amplification detection and relative expression analysis of miR-221-3p in cells.

Graphical abstract

关键词

窄内径毛细管 / 激光诱导荧光 / 分子信标 / 微小核糖核酸

Key words

narrow capillary / laser-induced fluorescence / molecular beacon / microRNA

0　 引 言

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类序列非常短的（约19-24 nt）蛋白质非编码RNA分子，主要通过诱导信使RNA（mRNA）降解和翻译抑制来调节基因表达。miRNA的异常表达与许多生物过程和疾病有关^[1，2]，尤其是癌症^[3，4]、心脏病^[5]、神经系统疾病^[6，7]等^[8，9]，且每种疾病的发生往往伴随着多种miRNA的异常表达。因此，miRNA的检测可以为了解多种生物过程及准确诊断疾病提供有价值的信息。miRNA具有尺寸小、丰度低、易降解、家族成员间序列相似等特点^{[10, 11]}，因此，直接定量检测miRNA是具有挑战性的难题。多数miRNA检测方法是基于扩增或修饰的，比如实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）^[12]、微阵列^[13]、二代测序^[14]、等温扩增^[15]等技术。这些依赖于扩增的方法会引起定量偏差、保真度低等问题。因此，发展无扩增的miRNA检测方法具有重要意义。

通常，基于无扩增的miRNA检测方法其特异性和灵敏度均比基于扩增的方法低，因此，对探针的识别能力和仪器的灵敏度要求更高。通过设计miRNA的杂交探针，可以在复杂体系中特异性识别miRNA。常用的miRNA杂交探针有两种：单链DNA^[16]和茎环结构的DNA^[17]。分子信标（molecular beacon，MB）是Tyagi和Kramer在1996年设计的一种茎环结构的寡核苷酸荧光探针^[18]，可以对核酸进行识别，具有特异性强、背景信号弱、灵敏度高等特点，在生物医学等领域广泛应用。此外，具有高亲和力和高特异性的锁核酸（locked nucleic acid，LNA）和肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）的探针也被用于miRNA的无扩增检测。

随着液相色谱设备逐渐微型化，内径较小的微/纳米通道由于具有超小体积需求以及高的分离效率被用于液相色谱分析^{[19, 20]}，在DNA、蛋白质、氨基酸等生物样品的分析中表现出较高的分离效率以及灵敏度^[21~23]。本研究将内径为1.06 μm的窄内径毛细管与高灵敏的激光诱导荧光检测系统耦联，构建窄内径毛细管-激光诱导荧光（LIF）检测系统，并用于分子信标探针标记的微小核糖核酸221-3p（miR-221-3p）的无扩增检测，以miR-221-3p为检测靶标设计了锁核酸（LNA）修饰的MB（LNA/MB-221）探针，优化了LNA/MB-221探针的缓冲体系以及与靶标杂交的最适温度，评价了方法的检出限，并对人胚肺成纤维细胞和非小细胞肺癌细胞的miR-221-3p进行了检测及相对表达量分析。

1　 实验部分

1.1　仪器、试剂与材料

仪器：VeritiPro™ 96孔梯度型热循环仪（Thermo Fisher公司）；Generadar 618型核酸电泳仪（深圳市海普诺科技发展有限公司）；Gel Doc XR+型凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；BioPhotometer Plus型核酸蛋白测定仪（Eppendorf公司）；LightCycler 96型实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；GenPure UV/UF型超纯水系统（Thermo Fisher Scientific公司）。

试剂与材料：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化镁（MgCl₂·6H₂O）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、硼酸（H₃BO₃）等试剂均为分析纯，购于国药集团；RPMI-1640培养基、Ham’s F-12K培养基、胎牛血清（FBS）、青-链霉素以及L-谷氨酰胺等细胞培养相关试剂购于Gibco公司；miRNA标准品和焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水购于苏州吉玛基因股份有限公司；琼脂糖购于Biowest公司；DNA标准分子量Marker和上样缓冲液购于上海捷瑞生物工程有限公司；iTaq Universal qPCR mix购自Bio-Rad公司；miRNA第一链cDNA合成试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；LNA/MB-221探针由Takara公司合成；QIAzol裂解液和miRNeasy试剂盒购于Qiagen公司；实验用水为超纯水。

1.2　试剂配制

Tris-EDTA（TE）缓冲液：称取2.423 g Tris和0.744 5 g EDTA溶于200 mL超纯水中，用1 mol/L的HCl调节pH值至8.01，得到浓度为100 mmol/L的TE溶液。

MgCl₂溶液：称取2.030 g MgCl₂·6H₂O溶于100 mL超纯水中，用1 mol/L NaOH调节pH值至8.0，得到浓度为100 mmol/L的MgCl₂溶液。

Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液：称取54.0 g Tris、3.72 g EDTA和27.4 g硼酸溶于1 L超纯水中，用1 mol/L NaOH调节pH值至8.3，配制成TBE储液（5×），再稀释为TBE缓冲液（0.5×）作为电泳工作液。

1.3　样品处理及核酸杂交

本研究中所使用的miRNA序列从miRBase数据库中获取，探针序列根据miRNA序列设计。miR-221-3p的序列如下：AGC UAC AUU GUC UGC UGG GUU UC；LNA/MB-221探针序列如下：FAM-AGC GTC GAA ACC CAG CAG ACA ATG TAG CTG ACG CT-Dabcyle（FAM为6-羧基荧光素；Dabcyle为4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸）。样品溶解之前先置于高速离心机内，以12 000 r/min的转速离心1 min，将吸附于管壁或盖子中的样品离心至管底。根据样品管壁上标注的物质的量加入适量的溶剂，将LNA/MB-221探针用超纯水溶解至20 μmol/L，miRNA用DEPC溶液溶解至20 μmol/L。为避免样品反复冻融，分别将DNA和miRNA以10 μL分装后于冰箱中-80 ℃保存，使用时稀释至2 μmol/L。将等浓度等体积的miR-221-3p和LNA/MB-221混合，在热循环仪中以95 ℃ 5 min、不同退火温度（室温、55~75 ℃）孵育30 min、4 ℃ 5 min的条件下进行杂交。

1.4　窄内径毛细管-LIF检测系统的构建

窄内径毛细管-LIF检测系统是由窄内径毛细管、压力舱和可视化聚焦的激光诱导荧光检测器组成，如图1(a)所示。所用激光诱导荧光检测系统由本课题组自行搭建，检测系统由激发光路、荧光收集光路和成像校准光路构成^[24]。本小组将原焦距750 mm的平凸圆形柱面透镜改为焦距300 mm的柱透镜，使光学系统拥有更好的聚光能力，同时减小可视化实时成像校准激光诱导荧光检测系统的体积。

采用扫描电子显微镜（SEM）对窄内径毛细管的截面进行表征。如图1(b)所示，毛细管内径为1.06 µm。将窄内径毛细管安装在检测系统上，向毛细管内注入TE缓冲液，通过可视化实时成像聚焦，然后向毛细管内注入样品，在稳定激光功率（1 mW）下检测样品的荧光信号。采用LabVIEW软件对检测过程进行实时监测。

1.5　LNA/MB-221探针与miR-221-3p杂交效率的检测

用0.5 g琼脂糖与50 mL TBE缓冲液制作浓度为1%的琼脂糖凝胶，将待检测的杂交样品与上样缓冲液（5×）混匀，依次取5 μL于点样孔中，在100 V电压下电泳45 min。电泳结束后，在凝胶成像系统中观察并拍照，根据电泳条带数量评价杂交效率。

1.6　细胞培养及miRNA提取

非小细胞肺癌细胞系A549细胞、人胚肺成纤维细胞系HFL-1细胞均购于中国科学院细胞库。A549细胞和HFL-1细胞分别使用RPMI-1640和Ham’s F-12K培养基培养。RPMI-1640培养基中加入体积分数10%的胎牛血清、200 μg/mL的L-谷氨酰胺和100 U/mL的青-链霉素；Ham’s F-12K培养基中加入体积分数10%的胎牛血清、1%的L-谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸和1%的丙酮酸钠溶液。将细胞以每孔3×10⁵个的密度接种于6孔板中，置于37 ℃，含5% CO₂的培养箱中培养。当细胞覆盖度达到90%时，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗，弃上清，添加1 mL QIAzol裂解液裂解细胞。将裂解物收集在1.5 mL微量离心管中，使用miRNeasy试剂盒提取miRNA。用核酸蛋白测定仪测定miRNA浓度，A549细胞和HFL-1细胞中提取到的总miRNA浓度分别为2 469.4 ng/μL和812.7 ng/μL。

1.7　RT-qPCR检测miRNA表达

miRNA第一链cDNA合成：反应体系为20 μL，其中反转录缓冲液10 μL、酶2 μL、总miRNA 100 ng，加无RNA酶的水定容至20 μL。反应条件为：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，再冷却至4 ℃保存。

miRNA荧光定量PCR：miR-221-3p的引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列为5'-CAG CTA CAT TGT CTG CTG GGT TTC-3'。将cDNA合成产物稀释50倍后进行PCR检测，反应总体系为20 μL，其中iTaq Universal qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、稀释后的cDNA 2 μL，最后加无RNA酶的水定容至20 μL。使用Roche Light Cycler 96扩增仪进行PCR扩增反应，反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40个循环。以U6作为内参基因，用于标准化分析，采用比较Ct法定量计算相对基因表达。

2　 结果与讨论

2.1　条件优化

MB是一种具有发夹结构的荧光标记核酸探针，影响MB探针的外部因素有温度、pH值和缓冲液的离子浓度^[25]。高温以及高pH值均会破坏分子信标的茎环结构，使其变成随机的线状结构，导致荧光基团和猝灭基团间的距离变大，猝灭基团不能汲取荧光从而产生荧光信号。缓冲液中的离子浓度影响MB探针茎环结构的稳定性，进而影响探针的荧光强度。由于本研究中不涉及高pH值环境，因此，仅对缓冲体系中的MgCl₂浓度以及杂交温度进行优化。

2.1.1　缓冲体系MgCl₂浓度

在保持室温和pH 8.0不变的TE缓冲体系中，探讨了MgCl₂浓度对LNA/MB-221探针荧光信号的影响。图2(a)为LNA/MB-221探针（0.01~1 µmol/L）在不同浓度（0~7 mmol/L）MgCl₂溶液中的荧光强度变化。可以观察到，不同浓度的LNA/MB-221探针在不含MgCl₂的溶液中荧光强度均是最高的，而加入MgCl₂之后，探针的信号显著降低，且随着MgCl₂溶液浓度的不断升高，探针的信号强度逐渐减弱；当MgCl₂溶液浓度大于等于3 mmol/L时，探针的信号强度趋于稳定。图2(b)为10 nmol/L LNA/MB-221探针在不同浓度MgCl₂溶液中的荧光强度。可以观察到，当MgCl₂溶液浓度大于等于3 mmol/L时，LNA/MB-221探针无明显的荧光信号，接近基线。因此，为保证探针本身的信号不干扰miRNA的检测，本文选用4 mmol/L的MgCl₂溶液作为缓冲体系。

2.1.2　杂交温度

杂交过程的退火温度会影响核酸的稳定性及杂交效率。在室温~75 ℃考察了温度对LNA/MB-221探针和miR-221-3p杂交样品的影响。如图3所示，从室温至75 ℃，LNA/MB-221探针均能与miRNA杂交，图中未出现非特异性条带。采用激光诱导荧光检测不同温度下杂交样品的荧光强度。不同杂交温度下的样品荧光强度间差异较小，其中以温度为65 ℃时的样品荧光信号略强。因此，本文选用的杂交温度为65 ℃。

2.2　检出限

由MgCl₂浓度优化实验结果可知，10 nmol/L LNA/MB-221探针在3~7 mmol/L MgCl₂缓冲体系中几乎无荧光信号，因此可认为，探针本身在所检测条件下对背景信号无贡献，只有与靶标结合后才会产生荧光信号。

将LNA/MB-221探针与等摩尔量的miR-221-3p杂交，检测不同浓度杂交样品的荧光信号强度，以评价检测方法的灵敏度。在100 psi（145 psi=1 MPa）气压下进样10 s，再以800 psi的气压驱动，检测LNA/MB-221探针与miR-221-3p杂交后样品（1~10 nmol/L）的荧光强度，进样量约为850 fL，结果如图4(a)所示。浓度为1、2.5、5、7.5、10 nmol/L的杂交样品峰高的相对标准偏差分别为4.4%、5.2%、6.2%、4.2%和7.4%（n=3），表明该方法对LNA/MB-221与miR-221-3p杂交样品的检测具有良好的重现性。1 nmol/L杂交样品色谱峰的信噪比约为3.26（大于3倍信噪比），因此，基于分子信标探针对miR-221-3p的浓度检出限为1 nmol/L，物质的量检出限为8.5×10^-22 mol，约为508个分子。

图4(b)为浓度1~10 nmol/L杂交样品的荧光强度与浓度的线性关系图，相关系数为0.999 6，表明线性关系良好。

2.3　特异性

为了研究LNA/MB-221探针对检测miR-221-3p的特异性，对在大多数细胞中高表达的miR-21以及miR-205的干扰能力进行了考察。在相同实验条件下，将1 µmol/L LNA/MB-221探针分别与等摩尔量的miR-221-3p、miR-21和miR-205进行杂交，随后以800 psi压力持续将样品注入毛细管中，检测其荧光信号，结果如图5所示。探针浓度为1 µmol/L，远大于10 nmol/L，因此，探针本身有微弱的背景信号；miR-21和miR-205与探针的杂交样品呈现一定的荧光强度变化；而miR-221-3p与探针杂交样品荧光强度显著。结果表明，该方法对miRNA-221-3p的检测具有较高的特异性。

2.4　细胞中miR-221-3p的检测

将该方法用于HFL-1细胞和A549细胞总miRNA样品中miR-221-3p的相对表达量分析，以评价该方法在实际样品中检测miRNA的可行性。图6(a)为HFL-1细胞和A549细胞中miR-221-3p的荧光信号峰，HFL-1细胞的检测信号较A549细胞高，与文献报道的miR-221-3p在衰老的HFL-1细胞中显著上调的结果^[26]一致。采用RT-qPCR法测定了miR-221-3p的相对表达量，以验证本文结果。图6(b)为RT-qPCR法测定HFL-1细胞和A549细胞中miR-221-3p的相对表达量。结果表明，HFL-1细胞中miR-221-3p的表达量较A549细胞中高，与本文无扩增检测得到的结论相似。这表明了本研究中所使用的无扩增的荧光方法检测结果具有一定的准确性。

3　 结 语

本研究以内径为1.06 µm的毛细管耦联可视化实时成像的LIF检测器构建了窄内径毛细管-LIF检测系统，用于分子信标探针标记的miRNA无扩增检测。以miR-221-3p为靶标设计锁核酸修饰的分子信标探针LNA/MB-221，对LNA/MB-221探针缓冲体系中MgCl₂溶液浓度和杂交温度进行了优化。当MgCl₂溶液浓度大于3.0 mmol/L时，探针的背景干扰较小；杂交温度为65 ℃时，探针与靶标杂交样品的荧光信号最高。LNA/MB-221探针与miR-221-3p的杂交样品在低浓度范围内（1~10 nmol/L）具有良好的线性相关性，浓度检出限为1 nmol/L，且样品仅消耗850 fL，其物质的量检出限为8.5×10^-22 mol，约为508个分子。此外，采用该方法对HFL-1和A549细胞中miR-221-3p实现了无扩增检测，与RT-qPCR检测结果一致。无扩增的检测方法有望为基于miRNA的复杂人类疾病监测和检测提供新的思路。

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基金资助

北京高校卓越青年科学家计划项目(BJJWZYJH01201910005017)

国家自然科学基金(22127805)