水液相下羟基负离子催化半胱氨酸旋光异构的机理

Optical Isomerism Mechanism of Cystenie Catalyzed by Hydroxyl Anion in Water-Liquid Phase Environment

摘要

采用密度泛函理论M06-2X和MN15方法，结合自洽反应场理论的SMD模型方法，研究了水液相下羟基负离子（OH^-）催化半胱氨酸（Cys）分子的旋光异构反应机理。研究发现，两性Cys分子的消旋反应可以通过OH^-直接抽取α-H质子和Cys碳负离子抽取水分子（H₂O）质子实现，也可以在两性Cys向中性异构后，通过OH^-抽取中性Cys的α-H质子和Cys碳负离子抽取H₂O质子实现。势能面计算表明：第1种情况下Cys消旋反应的活化能垒是45.8 kJ/mol，第2种情况下Cys消旋反应的活化能垒是51.6 kJ/mol，均比水液相下Cys消旋反应的活化能垒104.0 kJ/mol低很多。结果表明，水液相下OH^-对Cys的旋光异构具有很好的催化作用。

Abstract

The optical isomerism reaction mechanism of cysteine (Cys) molecule catalyzed by hydroxyl anion(OH^-) in water-liquid phase environment was studied by means of M06-2X and MN15 methods based on density functional theory and SMD model method of self consistent reaction field theory. The study shows that the racemization reaction of amphoteric Cys molecule can be achieved through the process of OH^- directly extracting α-H proton and Cys carbanion extracting the proton from water molecule(H₂O), it can also be achieved through the process of OH^- extracting α-H proton from amphoteric Cys and Cys carbanion extracting the proton from water molecule(H₂O) after amphoteric Cys isomerizes to neutral. Investigation on the potential energy surface shows that the activation energy barrier of Cys racemization reaction in the first case is 45.8 kJ/mol, the activation energy barrier of Cys racemization reaction in the second case is 51.6 kJ/mol, both of barriers are much lower than the 104.0 kJ/mol activation barrier of Cys racemization reaction in water-liquid phase environment. The results show that OH^- has a good catalytic effect on the reaction of Cys optical isomerism in water-liquid phase environment.

Graphical abstract

关键词

半胱氨酸 / 羟基负离子 / 密度泛函理论 / 过渡态 / 自洽反应场理论 / 活化能

Key words

cysteine / hydroxyl anion / density functional theory / transient state / self consistent response field theory / activation energy

0　 引 言

半胱氨酸（cysteine，Cys）是组成蛋白质的重要氨基酸，按旋光性分为左旋和右旋半胱氨酸（L-Cys和D-Cys），按构型分为S型和R型半胱氨酸（S-Cys和R-Cys）。L-Cys在生命体内具有生物活性，可用作增香和保鲜功能的添加剂^[1，2]。D-Cys可作为手性药物中间体^[3]，用于生产有消炎、抗皱、祛斑、润肤和美白等功效化妆品的原料^[4]。Cys偶联蛋白改性还可提高莱赛尔纤维的接枝率，改善莱赛尔纤维的力学性能^[5]。不同旋光性药物分子的代谢过程、生物活性及毒性等方面有较大的不同，通常是某一旋光性有效，而其对映体则可能有较强的毒副作用^[6]。具有手性的药物分子优构体在生命体内是否发生旋光异构对其临床使用极其重要，同时，药物分子旋光异构的机理研究对指导实验、实践也有重要意义。

人们对L-Cys和D-Cys的旋光异构进行了理论研究。文献[7]研究发现，水汽环境下Cys旋光异构能垒是95.3 kJ/mol，水汽环境下的Cys可以缓慢地消旋。文献[8]研究发现，水液相下Cys直接旋光异构能垒是104.0 kJ/mol，水液相下的Cys也可以缓慢地消旋。

实验研究^[9]发现，水液相下丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和谷氨酸等氨基酸的旋光异构缓慢，而碱性环境下这些手性氨基酸的消旋速度显著增加，说明羟基负离子（OH^-）离子对氨基酸的旋光异构有催化作用。生命体内的水环境中有OH^-存在^[10]，因此有必要从理论上研究OH^-在液相的化学反应^[11]。为揭示水液相下OH^-对Cys分子旋光异构的催化机理，从理论上对文献[9]的研究结果给予解释，指导人们科学地使用Cys，本工作对标题反应进行了研究。

1　 计算方法

采用对主族体系结构预测表现较好的M06-2X泛函^[12~14]方法，在三重分裂弥散基组6-311+G(d,p)水平全优化单重态（计算表明本研究体系单重态稳定）势能面上的驻点。对过渡态^[15]进行IRC（内禀反应坐标）计算^[16]，确认过渡态的可靠性。为获得精确的反应过程势能面，采用高精度描述体系色散作用的泛函MN15^[17]方法，在高角动量劈裂价键基组6-311++G(2df,pd)水平计算单点能。水溶剂效应采用SMD模型^[18]方法处理。采用自然键轨道（NBO）和分子中的原子(AIM)理论，计算主要物种的自然布居分析（NPA）电荷、键临界点（BCP）和环临界点（RCP）电荷密度ρ及电荷密度的拉普拉斯值{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho。

在反应通道a，反应物R-Cys与OH^-·H₂O氢键作用形成的络合物记作R-Cys·(OH^-·H₂O)^a，无手性过渡态记作T·(OH·H₂O)^a，其他驻点物种的表示方法与此相似。文中驻点结构及其NPA电荷和单点能计算采用Gaussian16^[19]程序，ρ及{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho的计算采用AIM 2000程序^[20]。

2　 结果与讨论

水液相下，氨基酸两性分子构象最稳定^[14，21]。对水液相下两性Cys的构象作全势能面扫描得到其最稳定结构，见图1。对图1进行分析可知，两性R-Cys向S-Cys的异构反应可以通过OH^-抽取α-H质子形成Cys碳负离子，而后Cys碳负离子在纸面内抽取H₂O的质子过程实现；也可以是两性Cys向中性异构后，通过OH^-抽取中性Cys的α-H质子和Cys碳负离子抽取H₂O的质子过程实现。两个过程分别命名为a通道和b通道。由于水液相下OH^-很少单独存在，多数是其与H₂O、(H₂O)₂和(H₂O)₃等氢键作用形成羟基负离子水分子簇，所以实际情况多是羟基负离子水分子簇与Cys氢键作用。计算表明，OH^-·(H₂O)₂和OH^-·(H₂O)₃等与Cys氢键作用形成的反应物络合物的异构能垒高于OH^-·H₂O与Cys氢键作用形成的反应物络合物的异构能垒（原因是前两种情形对应的过渡态结构共面性差，不稳定），故本文只对OH^-·H₂O与Cys氢键作用形成的反应物络合物的异构进行讨论。

2.1　Cys分子在a通道的旋光异构

R-Cys在a通道的旋光异构反应历程见图2，反应的势能面见图3。

第1基元反应。首先，OH^-·H₂O与R-Cys的α-氢H12及羰基氧O10氢键作用形成离子诱导的反应物偶极络合物R-Cys·(OH^-·H₂O)^a，然后经过渡态T1·(OH^-·H₂O)^a，O15—H16^-抽取H12，得到第1中间体碳负离子I1·(H₂O)₂^-a。抽取H12的工作是由OH^-完成的，H₂O只是起了稳定OH^-空间位置的作用，后文相似之处不再赘述。NPA电荷计算表明，从R-Cys·(OH^-·H₂O)^a到T1·(OH^-·H₂O)^a再到I1·(H₂O)₂^-a，H12的电量从0.270 e（1 e=1.602×10^-19 C）变为0.430 e，再变为0.497 e，此过程迁移的是H质子。从R-Cys·(OH^-·H₂O)^a到T1·(OH^-·H₂O)^a，C1—H12从0.109 2 nm拉伸至0.141 2 nm，BCP电荷密度ρ从0.282 1 a.u.减小至0.127 9 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho从-0.975 6变为-0.128 3，共价键减弱；八元环C1—H12—O15—H19—O17—H18—O10—C8的RCP电荷密度从0增加至0.006 5 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho从0变为0.025 8，过渡态成环；骨架二面角N5—C1—C3—C8从122.3°增加至125.0°。此过程只有1个共价键拉伸，骨架形变微小，且过渡态成环较稳定，T1·(OH^-·H₂O)^a产生的内禀能垒为45.8 kJ/mol。最后，通过分子的碰撞过程I1·(H₂O)₂^-a解离成I1^-a和(H₂O)₂。NPA电荷计算表明，I1·(H₂O)₂^-a的(H₂O)₂的电量和约为0.000 e，I1^-a的电量和约为-1.000 e，α-碳C1的电量是-0.336 e，说明I1·(H₂O)₂^-a是碳负离子，亦即I1^-a是碳负离子。接下来是I1^-a的对称异构过程。

第2基元反应。I1^-a经S12—C3键内旋转的过渡态T2^-a，巯基S12—H13绕S12—C3键后视逆时针旋转，异构成碳负离子I2^-a。从I1^-a到T2^-a，非骨架二面角H13—S12—C3—H2从-64.2°变为15.8°，同时，S12—H13拉伸0.003 4 nm，化学键的微拉伸和内旋转所致的非骨架形变需能量很少，T2^-a产生的内禀能垒为13.1 kJ/mol。

第3基元反应。I2^-a经C3—C1键内旋转的过渡态 T3^-a，R-基（巯基S12—H13和亚甲基H2—C3—H4集团）绕C3—C1键左视顺时针旋转，同时骨架二面角N5—C1—C3—C8对称形变，异构成碳负离子I3^-a。从I2^-a到T3^-a，二面角S12—C3—C1—N5从59°变为-1.6°，二面角N5—C1—C3—C8从-140.3°增加至-161.1°，骨架的形变使T3^-a产生了38.6 kJ/mol的内禀能垒。

第4基元反应。I3^-a 经S12—C3键内旋转的过渡态T4^-a， 巯基S12—H13绕S12—C3键正视逆时针旋转，异构成碳负离子I4^-a。从I3^-a到T4^-a，二面角H13—S12—C3—H4从-94.7°变为-15.8°，化学键内旋转需能量很少，T4^-a 产生的内禀能垒只有11.1 kJ/mol。结构分析表明，至此，I1^-a实现对映异构。

第5基元反应。首先，(H₂O)₂在纸面外（后视图）与I4^-a的C1及O10氢键作用形成中间体络合物I4^-·(H₂O)₂^a。然后，I4^-·(H₂O)₂^a经过渡态T5·(OH^-·H₂O)^a，I4^-a的C1抽取水分子H14—O15—H16的H14，得到产物S-Cys·(OH^-·H₂O)^a，至此，R-Cys·(OH^-·H₂O)^a实现旋光异构。NPA电荷计算表明，此过程迁移的H14是质子。从I4^-·(H₂O)₂^a到T5·(OH^-·H₂O)^a，O15—H14键长从0.101 2 nm拉伸至0.120 9 nm，其BCP电荷密度从0.302 3 a.u.减小至0.172 4 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho始终为负值，共价键减弱；八元环C1—H14—O15—H19—O17—H18—O10—C8的RCP电荷密度从0.005 6 a.u.增加至0.006 5 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho始终为正值，八元环强成键作用增强，过渡态成环。此基元反应仅O15—H14共价键小幅拉伸，且中间体反应物的α-碳为sp²杂化，体系不稳定，处于势能面较高的位置，T5·(OH^-·H₂O)^a产生的内禀能垒只有7.6 kJ/mol。最后，S-Cys·(OH^-·H₂O)^a通过分子碰撞过程解离成S-Cys和OH^-·H₂O，得到R-Cys在a通道的手性对映体产物S-Cys。

从图3可看出，水溶剂环境OH^-作用下，Cys在a通道旋光异构的决速步是第一基元反应，决速步自由能垒是45.8 kJ/mol。该能垒远低于温和反应能垒83.6 kJ/mol^[22]，说明OH^-存在时Cys容易旋光异构。结合图3和图2可以看出，水溶剂环境OH^-作用下，Cys的旋光异构反应驻点的能量和结构关于T3^-a对称。

2.2　Cys分子在b通道的旋光异构

R-Cys在b通道的旋光异构反应历程见图4，反应的势能面见图5。

第1基元反应。R-Cys经过渡态R-T1^b，H11质子从N6迁移到O9，异构成R-I1^b。从R-Cys到R-T1^b，N6—H11从0.102 4 nm拉伸至0.129 8 nm，BCP电荷密度及其拉普拉斯值计算表明，N6—H11的共价键少许减弱；RCP电荷密度及其拉普拉斯值的计算表明，R-T1^b 的N5—H11—O9—C8—C1成五元环，存在较强的强成键作用。一个N—H共价键的少许拉伸，再加上过渡态成环，使得R-T1^b产生的能垒只有17.8 kJ/mol。考虑到水液相下有水分子及水簇存在，计算了H₂O和(H₂O)₂做氢迁移媒介时此基元反应的驻点和势能面，势能面见图5，反应历程见图S1（附加材料），得到H₂O和(H₂O)₂做氢迁移媒介时该基元反应的能垒分别升高至40.4、55.6 kJ/mol。H₂O和(H₂O)₂做氢迁移媒介时该基元反应的能垒升高的原因是过渡态的七元环和九元环共面性差，强成键作用消失，过渡态不稳定。

第2基元反应。R-I1^b 经O9—C8键内旋转的过渡态R-T2m^b （或R-T2n^b），羧基O9—H11绕O9—C8键俯视逆（或顺）时针旋转，异构成R-I2^b，羧基从反式结构变成顺式结构。从R-I1^b到R-T2m^b，O9—C8键俯视逆时针旋转91.3°，此化学键的内旋转需克服来自N5对H11的库仑作用，R-T2m^b产生的内禀能垒是51.9 kJ/mol。相似地，R-T2n^b产生了51.6 kJ/mol的内禀能垒。

第3基元反应。根据OH^-·H₂O与R-I2的作用方式不同，分为b1和b2两个路径，计算表明这两个分路径的中间体产物相同，记作I3^-b。

1） b1路径。首先，OH^-·H₂O与R-I2的H12和N5氢键作用形成中间体R-I2·(OH^-·H₂O)^b1 。然后，R-I2·(OH^-·H₂O)^b1 经过渡态T3·(OH^-·H₂O)^b1 ，O15—H16抽取H12，得到中间体碳负离子I3·(H₂O)₂^-b1 。NPA电荷计算表明此过程迁移的是H质子。从R-I2·(OH^-·H₂O)^b1到T3·(OH^-·H₂O)^b1，C1—H12从0.109 6 nm拉伸至0.135 5 nm，BCP电荷密度从0.277 9 a.u.减小至0.145 5 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho始终为负值，C1—H12的共价键减弱；七元环C1—H12—O15—H19—O17—H18—N5的RCP电荷密度从0 a.u.增加至0.008 1 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho从0变为0.035 5，过渡态成环；骨架二面角N5—C1—C3—C8从127.1°增加至136.3°。1个共价键拉伸，骨架形变较小，且过渡态成环较稳定，T3·(OH^-·H₂O)^b1产生的内禀能垒为46.1 kJ/mol。最后，通过分子的碰撞过程I3·(H₂O)₂^-b1解离成I3^-b和(H₂O)₂。NPA电荷计算表明，I3^-b是碳负离子，后文相似之处不再赘述。

2）b2路径。首先，OH^-·H₂O与R-I2的H12和O10氢键作用形成中间体R-I2·(OH^-·H₂O)^b2。然后，R-I2·(OH^-·H₂O)^b2经过渡态T3·(OH^-·H₂O)^b2，O15—H16抽取H12，得到I3^-·(H₂O)₂^b2。此过程与a通道的第1基元反应相似，T3·(OH^-·H₂O)^b2产生的内禀能垒是43.0 kJ/mol。最后，通过碰撞过程I3^-·(H₂O)₂^b2解离成I3^-b和(H₂O)₂。I3^-b1与I3^-b2相同，均用I3^-b表示，后文类似处相同处理。T3·(OH^-·H₂O)^b2产生的能垒略小于T1·(OH^-·H₂O)^a产生的能垒，原因是R-I2·(OH^-·H₂O)^b2比R-Cys·(OH^-·H₂O)^a的C1—H12长（前者是0.109 6 nm后者是0.109 2 nm），红外振动频率小（前者是3 090.8 cm^-1后者是3 128.7 cm^-1），活化程度稍高。

接下来是I3^-b的对称异构过程。

第4基元反应。I3^-b 经S12—C3键内旋转的过渡态T4^-b，巯基S12—H13绕S12—C3键后视逆时针旋转，异构成I4^-b。从I3^-b到T4^-b ，二面角H13—S12—C3—H2从-66.4°变为23.6°，化学键的内旋转所致的非骨架形变所需能量很少，T4^-b产生的内禀能垒为15.5 kJ/mol。

第5基元反应。I4^-b经C3-C1键内旋转的过渡态T5^-b ，R-基绕C3—C1键左视顺时针旋转，异构成I5^-b 。从I4^-b到T5^-b，只是C3—C1内旋转76.6°，T5^-b产生的内禀能垒只有26.1 kJ/mol。T5^-b比T3^-a产生的内禀能垒小很多，原因是I2^-a到T3^-a过程多了骨架N5—C1—C3—C8的形变。

第6基元反应。I5^-b 经S12—C3键内旋转的过渡态T6^-b ，巯基S12—H13绕S12—C3键正视逆时针旋转，异构成I6^-b。从I5^-b到T6^-b，S12—C3键正视逆时针旋转70.8°，T6^-b产生的内禀能垒为15.4 kJ/mol。结构分析表明，至此I3^-b实现对映异构。

第7基元反应。根据(H₂O)₂与I6^-b的作用方式不同，分为b1和b2两个路径，计算表明这两个分路径的中间体产物相同，记作S-I7^b。

1） b1路径。首先，(H₂O)₂与I6^-b的C1和N5氢键作用形成中间体I6^-·(H₂O)₂^b1。接着I6^-·(H₂O)₂^b1经过渡态T7·(OH^-·H₂O)^b1，C1抽取水分子H14—O15—H16的H14质子，得到S-型中间体S-I7·(OH^-·H₂O)^b1，R-Cys在b通道b1路径实现旋光异构。从I6^-·(H₂O)₂^b1到T7·(OH^-·H₂O)^b1，O15—H14从0.098 1 nm拉伸至0.128 1 nm，BCP电荷密度从0.337 3 a.u.减小至0.144 3 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho从-2.360 4变为-0.05 30，共价键变弱；七元环N5—C1—H14—O15—H19—O17—H18的RCP电荷密度从0.005 3 a.u.增加至0.008 2 a.u.，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho从0.022 4变为0.035 3，七元环的强成键作用增强，过渡态较稳定，T7·(OH^-·H₂O)^b1产生了34.8 kJ/mol的内禀能垒。最后，S-I7·(OH^-·H₂O)^b1通过碰撞过程解离成S-I7^b1和OH^-·H₂O。

2） b2路径。与b1路径相似，首先，(H₂O)₂与I6^-b的C1和O10氢键作用形成中间体I6^-·(H₂O)₂^b2。接着，I6^-·(H₂O)₂^b2经过渡态T7·(OH^-·H₂O)^b2，C1抽取水分子H14—O15—H16的H14质子，得到S-型中间体S-I7·(OH^-·H₂O)^b2，至此,R-Cys在b通道b2路径实现旋光异构。从I6^-·(H₂O)₂^b2到T7·(OH^-·H₂O)^b2，O15—H14从0.097 9 nm拉伸至0.128 2 nm，BCP电荷密度减小，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho始终为负，共价键变弱；八元环C1—C8—O10—H18—O17—H19—O15—H14的RCP电荷密度增加，{\nabla }^{\mathrm{2}}\rho始终为正，八元环结构的强成键作用增强，过渡态较稳定，T7·(OH^-·H₂O)^b2产生了32.3 kJ/mol的内禀能垒。最后，S-I7·(OH^-·H₂O)^b2通过碰撞过程解离成S-I7^b和OH^-·H₂O。

第8基元反应是第2基元反应的逆过程。S-I7^b经O9—C8键内旋转的过渡态S-T8m^b（或S-T8n^b），羧基O9—H11绕O9—C8键俯视逆（或顺）时针旋转，异构成S-I8^b，羧基从顺式结构变成反式结构。从S-I7^b到S-T8m^b过程，O9—C8键俯视逆时针旋转89.2°，S-T8m^b产生的内禀能垒为39.2 kJ/mol。相似地，S-T8n^b产生了38.9 kJ/mol的内禀能垒。该基元反应比第2基元反应正反应的能垒小，原因是从S-I7^b到S-T8m^b或S-T8n^b，N5对H11有库仑引力作用。

第9基元反应是第1基元反应的逆过程。S-I8^b经过渡态S-T9^b，H11质子从O9迁移到N6，异构成S-Cys，R-Cys实现手性对映体转变。从S-I8^b到S-T9^b，O9—H11从0.098 3 nm拉伸至0.121 3 nm，BCP电荷密度及其拉普拉斯值的计算表明，O9—H11的共价键强度少许减弱；RCP电荷密度及其拉普拉斯值的计算表明，S-T9^b的N5—H11—O9—C8—C1成环，存在较强的强成键作用，S-T9^b产生的能垒只有9.5 kJ/mol。该基元反应的能垒小于第1基元反应的正反应，原因是N5对H11有较强的库仑引力作用。考虑到水液相下有水分子及水簇存在，计算了H₂O和(H₂O)₂做氢迁移媒介时此基元反应的驻点和势能面，势能面见图5，反应历程见图S1，得到H₂O和(H₂O)₂做氢迁移媒介时该基元反应的能垒分别升高至247、29.3 kJ/mol。H₂O和(H₂O)₂做氢迁移媒介时该基元反应的能垒升高的原因是此时过渡态的七元环和九元环共面性差，强成键作用消失，过渡态不稳定。

从图5可以看出，水溶剂环境OH^-作用下，Cys在b通道旋光异构反应的决速步是第一基元反应，决速步能垒在51.6~51.9 kJ/mol之间；结合图4可知该能垒来自羧羟基旋转的过渡态。该能垒远低于温和反应能垒83.6 kJ/mol^[22]，说明OH^-存在时Cys容易旋光异构。从图5和图4还可以看出，在水溶剂环境OH^-作用下，Cys的旋光异构反应驻点的能量和结构关于T5^-b对称。文献[8]的研究结果表明，水液相环境下Cys旋光异构的决速步能垒来自于水分子簇做媒介的质子从α-C向氨基N迁移的过渡态，因此，OH^-的作用改变了Cys旋光异构的决速步骤。结合图3和图5可知，在水溶剂环境OH^-作用下，Cys在a通道和b通道消旋反应的活化能垒均比水液相下Cys消旋反应的活化能垒104.0 kJ/mol^[8]显著降低，说明OH^-对Cys的旋光异构具有很好的催化作用，从理论上对文献[9]的实验研究结果给予了说明。比较而言，水溶剂环境OH^-作用下的Cys消旋反应在a通道更具优势。

3　 结 语

在SMD/MN15/6-311++G(3df,2pd)//SMD/M06-2X/6-311+G(d,p)双水平研究了水液相下OH^-催化的两性Cys分子旋光异构，得到如下结果：

1) 两性R-Cys的旋光异构可以在OH^-直接抽取α-H质子和两性Cys向中性异构后，OH^-再抽取α-H质子的a通道和b通道实现；

2) Cys消旋反应的a通道具有优势，活化能垒为45.8 kJ/mol，来自于OH^-抽取α-H质子的过渡态；b通道略具劣势，活化能垒为51.6 kJ/mol，来自于羧羟基旋转的过渡态；

3) 水液相下OH^-催化Cys旋光异构的能垒远低于水液相下Cys消旋反应的能垒104.0 kJ/mol。

本文研究表明，水液相下OH^-对Cys的旋光异构具有很好的催化作用，碱性环境并不利于生命体健康。

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基金资助

吉林省社会科学基金(2020W11)

吉林省自然科学基金(20160101308JC)