基于氧化石墨烯及染料标记的核酸三色荧光探针检测汞离子

Detection of Mercury Ions Using Three-Color Fluorescent Probe Cooperated with Graphene Oxide and Dye-Labeled Nucleic Acids

摘要

利用氧化石墨烯（GO）、两种荧光染料标记的单链DNA及核酸染料SYBR Green Ⅰ（SG-Ⅰ），构建了能特异性识别Hg²⁺的三色荧光探针，建立了一种快速、高效、高灵敏定量检测水体中汞离子（Hg²⁺）的新方法。在这种探针中，两种染料Tetramethyl-6-carboxyrhodamine （TAMRA）和Cyanine-5 （Cy-5）分别标记在两条单链DNA的5'端，这两条单链DNA中有一部分碱基互补配对，未互补的碱基均为胸腺嘧啶（T碱基）。在没有Hg²⁺存在时，两种荧光染料标记的单链DNA被吸附在GO的表面，TAMRA和Cy-5与GO靠近，荧光被GO猝灭，它们的荧光信号都很弱；此时，SG-Ⅰ被吸附在GO的表面或游离在溶液中，荧光信号也很弱。在有Hg²⁺存在时，两种荧光染料标记的单链DNA通过T-Hg²⁺-T结构特异性结合形成双链DNA，从而脱离GO的表面，TAMRA和Cy-5远离GO，荧光信号恢复；与此同时，SG-Ⅰ与双链DNA结合，荧光强度显著增强。根据TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度增加的程度即可对Hg²⁺进行定量分析。在优化条件下，当Hg²⁺的浓度在1.0×10^-9~5.0×10^-8 mol/L范围内时，TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度之和与汞离子的浓度具有良好的线性关系，方法的检出限（LOD）为1.1×10^-10 mol/L，实际水样的加标回收率在96.00%~105.00%之间。该方法用于实际水样中Hg²⁺检测，获得了较为满意的结果。

Abstract

A three-color fluorescent probe that can specifically recognize mercury ion (Hg²⁺) was constructed using graphene oxide (GO), two fluorescent dyes labeled single-stranded DNA and nucleic acid dye SYBR Green Ⅰ(SG-Ⅰ). A rapid, efficient and highly sensitive method for the quantitative detection of Hg²⁺ in water was developed through the probe. In this probe, the dyes tetramethyl-6-carboxyrhodamine （TAMRA） and cyanine-5 (Cy-5) are labeled at the 5' end of two single-stranded DNA strands. Some of the bases in the two single-stranded DNA are complementary, and the uncomplementary bases are thymine. In the absence of Hg²⁺, dye-labeled single-stranded DNA was adsorbed on the surface of GO, and TAMRA and Cy-5 were close to GO. Their fluorescence was quenched by GO, and their fluorescence signals were weak. At this time, SG-Ⅰ was adsorbed on the surface of GO or dissociated in solution, and its fluorescence signal was weak. In the presence of Hg²⁺, different fluorescent dyes-labeled single-stranded DNA was specifically bound to form double-stranded DNA through the structure of T-Hg²⁺-T, which separated from the surface of GO, TAMRA and Cy-5 were far away from GO, and their fluorescence signals recovered. At the same time, the fluorescence intensity of SG-Ⅰ was significantly enhanced by binding with double-stranded DNA. Hg²⁺ could be quantitatively analyzed according to the increase degree of fluorescence intensity of TAMRA, Cy-5 and SG-Ⅰ. Under the optimized conditions, there was a good linear relationship between the sum of fluorescence intensity of TAMRA, Cy-5 and SG-Ⅰ and the concentration of Hg²⁺ in the range of 1.0×10^-9-5.0×10^-8 mol/L, and the detection limit (LOD) of the method was 1.1×10^-10 mol/L. The recoveries of water samples are 96.00%-105.00%. The method was applied to the detection of Hg²⁺ in actual water samples, and the satisfactory results were obtained.

Graphical abstract

关键词

汞离子 / 染料标记的核酸 / 三色荧光探针 / 同步荧光分析

Key words

mercury ion / dye-labeled nucleic acids / three-color fluorescent probe / synchronous fluorescence analysis

0　 引 言

汞是毒性最大的重金属之一，不能被生物降解，而且可在生物体中积累。据报道，即使微量的汞也会对人体的肾脏^[1]、肺^[2]、胃肠道^[3]和神经系统^[4~7]造成损害。汞在自然界最稳定的存在形式是二价汞离子（Hg²⁺），目前Hg²⁺造成的汞污染仍然是人们严重关切的问题。目前，测定Hg²⁺的方法主要包括原子荧光光谱^[8]、气相色谱^[9]、电感耦合等离子体质谱^[10，11]、原子吸收光谱^[12]和冷气相汞分析^[13]，或者几种方法联用^[14，15] 等。在这些分析方法中，原子荧光光谱、电感耦合等离子体质谱及冷气相汞分析需要昂贵的实验装置，气相色谱需要较复杂的前处理过程，原子吸收光谱灵敏度不高且重复性差，均不适合Hg²⁺的常规分析。分子荧光光谱法是利用荧光分子与目标物作用后，荧光信号发生显著变化来对目标物进行定性或者定量分析的方法，具有灵敏度高、检出限低、响应速度快、样品消耗少、信噪比高等优点^[16]，已广泛应用于有机小分子^[17~19]、有机大分子^[20]及无机离子^[21~23]等的分析与检测。

氧化石墨烯（GO）是一种亲水性物质，在水中有良好的分散性，由于其独特的物理和化学性质受到了广泛关注^[24]。GO具有大的比表面和丰富的表面官能团，可利用π-π堆积作用对单链DNA（ssDNA）产生较强的吸附。另外，GO是一种良好的荧光共振能量转移（FRET）受体，能对荧光染料的荧光产生猝灭作用，且具有较宽的荧光猝灭范围^[25]，已广泛应用于医学成像和生物传感器^[26]等领域。相对于传统的有机猝灭基团而言，GO对荧光的猝灭效果更好，基于GO作猝灭剂建立的检测方法荧光背景信号及检出限均更低^[27，28]。

近年来，随着核酸技术的发展，基于核酸荧光探针在检测金属离子，特别是在有毒重金属方面得到了广泛的应用^[29~31]。据报道，Hg²⁺能与胸腺嘧啶（T碱基）形成稳定的T-Hg²⁺-T结构^[32]，因此基于含T碱基的核酸荧光探针用于检测Hg²⁺的方法引起了国内外科研工作者的关注^[33~35]。这类方法选择性高，特异性强，共存离子对检测结果干扰小，检测结果准确可靠。但目前这些方法仍存在荧光信号单一，响应不灵敏等缺点。

本文基于GO、两种不同染料标记的富含T碱基的单链DNA，结合核酸染料SYBR Green Ⅰ(SG-Ⅰ)，构建了能特异性识别Hg²⁺的三色荧光探针，并建立了一种快速、高效、高灵敏地定量检测水体中Hg²⁺的方法。与已报道的方法相比，该方法主要有两个优点：一是该方法利用GO超高的荧光猝灭效率以及多色荧光同时响应，在降低荧光背景信号的同时，显著提高了输出的响应信号，提高了检测方法的灵敏度，降低方法的检出限；二是3种染料（TAMRA、Cy-5和核酸染料SG-Ⅰ）的斯托克斯（Stokes）位移相差很小，3种染料的荧光信号可以通过同步荧光扫描法一次扫描同时获得，既节约了检测时间，也可以避免散射光对检测的干扰。

1　 实验部分

1.1　仪器与试剂

体系荧光光谱由RF-5301PC型荧光光谱仪（Shimadzu公司）采集，溶液pH值由PHS-3C型pH计（INESA公司）测定。

Hg(NO₃)₂为优级纯，其余化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；核酸染料SG-Ⅰ购自上海瑞安生物技术有限公司；GO购自中科院成都有机化学研究所。TAMRA标记的含多个T碱基的单链DNA（PT）及Cy-5标记且与PT部分互补链（PC）均由上海生工生物技术有限公司合成，其核苷酸碱基序列如下：

PT：5´-TAMRA-(CH₂)₆-GTC TCG TTG GCT CCG TCG C-3´

PC：5´-Cy-5-(CH₂)₆-GCG TCG GTG CCT ACG TGA C-3´

自来水样取自湖北民族大学新校区工程实训中心实验室，天然矿泉水取自湖北省恩施市龙洞河，池塘水样取自湖北民族大学校园内池塘。自来水取样时，先放水5 min再进行取样，天然矿泉水和池塘水均使用聚四氟乙烯材质的简易采水器在水深20 cm处采集。采集完成后，水样带回实验室冷藏保存。

1.2　样品制备

将PT和PC用0.1 mol/L的Tris-HNO₃缓冲溶液（pH 8.0，含60 mmol/L NaNO₃）配制成浓度为2.0×10^-7 mol/L的储备液。核酸染料SG-Ⅰ浓缩液用Tris-HNO₃缓冲溶液稀释10 000倍得到SG-Ⅰ工作液，置于4 ℃条件下保存。Hg(NO₃)₂用HNO₃酸化的蒸馏水配制成不同浓度的溶液备用。分别取PT、PC储备液各50 μL置于离心管中，加入50 μL配制好的Hg(NO₃)₂溶液，混合均匀，在35 ℃恒温反应12 min。向离心管中加入10 μL 0.5 mg/mL GO和50 μL SG-Ⅰ工作液，再补充缓冲溶液至总体积为500 μL，混合均匀，在室温下孵育5 min后转移至石英比色皿中进行荧光检测。所有实验中，除注明外，PT和PC浓度均为2.0×10^-8 mol/L，SG-Ⅰ加入量为50 μL，Hg²⁺浓度为5.0×10^-8 mol/L。

1.3　实际水样的处理与检测

水样中的有机物及悬浮物易与汞结合，从而干扰汞的检测。因此，在检测之前需要对水样进行消解，以破坏有机物及悬浮物，使其释放出汞，便于汞的准确检测。具体步骤为：准确吸取20 mL预处理后的水样于消解罐中，加入约10 mL无汞蒸馏水，再依次加入1.5 mL浓H₂SO₄、1.5 mL HNO₃溶液（1+1）、2 mL KMnO₄溶液（50 g/L）、2 mL K₂S₂O₈溶液（50 g/L）。然后将消解罐置于沸水浴加热30 min，冷却至室温。在测定前，向消解液中缓慢加入盐酸羟胺溶液，边加边振荡，直至溶液透明，然后用0.45 μm滤膜过滤。将滤液转移至50 mL容量瓶中，用1%的硝酸溶液定容，摇匀待测。

水样预处理完成后，将待测溶液按1.2方法处理，采用同步荧光分析法进行检测。为了使3种染料同时获得较好的荧光信号，检测时将同步荧光分析的波长间隔（∆λ）设置为22 nm，激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。

2　 结果与讨论

2.1　检测原理

基于GO及染料标记的核酸三色荧光探针定量检测Hg²⁺的原理见图1。两种荧光染料TAMRA和Cy-5分别标记在含有多个T碱基错配且部分互补的ssDNA的5'端（PT及PC）。在没有Hg²⁺存在时，PT及PC通过π-π堆积作用被吸附在GO表面，TAMRA、Cy-5与GO靠近，其荧光通过FRET的方式被GO猝灭，荧光信号都很弱。此时，SG-Ⅰ被吸附在GO表面或游离在溶液中，荧光信号也很弱。当体系中存在Hg²⁺时，PT及PC通过T-Hg²⁺-T结构特异性结合形成双链DNA，从而脱离GO的表面，TAMRA和Cy-5远离GO，其荧光信号恢复；与此同时，SG-Ⅰ与双链DNA结合，其荧光信号显著增强。

在该体系中，3种染料的Stokes位移（最大激发波长和最大发射波长之间的间隔）分别为Δλ_SG-Ⅰ=23 nm，Δλ_TAMRA=23 nm，Δλ_Cy-5=21 nm，它们的Stokes位移很接近，但最大发射波长间隔距离较大（SG-Ⅰ、Cy-5及TAMRA的最大发射波长分别为525、580、672 nm），因此采用同步荧光分析法即可同时得到3种染料互不重叠的荧光信号。根据TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度增加的程度即可对Hg²⁺进行定量分析。

2.2　方法可行性分析

图2展示了不同浓度Hg²⁺对应的同步荧光光谱。结果表明，在没有Hg²⁺的情况下，3种染料所对应的荧光信号都很弱；在Hg²⁺存在的情况下，3种染料所对应的荧光信号都显著增强，且随着Hg²⁺浓度的增大，荧光强度也呈比例增加。上述实验结果表明，本文所设计的三色荧光探针用于检测Hg²⁺的方案是可行的。

2.3　GO浓度的选择

加入GO的目的是将未反应的PT和PC的荧光猝灭，GO的浓度会影响荧光猝灭的效果。因此，考察了不同浓度的GO对PT和PC的荧光猝灭情况，结果如图3所示。当体系中Hg²⁺浓度为5.0×10^-8 mol/L，PT和PC的浓度均为2.0×10^-8 mol/L，GO浓度在0~10 μg/mL时，TAMRA和Cy-5的荧光强度均随着GO浓度的增加而逐渐降低；当GO浓度大于10 μg/mL时，TAMRA和Cy-5的荧光强度都很弱，且荧光信号趋于稳定，说明此时TAMRA和Cy-5的荧光被完全猝灭。因此，本研究中GO浓度选择为10 μg/mL。

2.4　反应时间对检测结果的影响

PT、PC与Hg²⁺之间的反应需要一定的时间，反应时间过短可能会造成PT、PC与Hg²⁺之间结合不充分，反应时间过长可能会使DNA双链分解，也可能造成染料的荧光量子产率降低。考察了体系的反应时间对检测结果的影响。结果（图4）表明，3种染料的荧光强度在3~12 min范围内随着反应时间的增加而增强，当反应时间继续增加时，3种染料的荧光强度均略有下降。因此，本实验最适宜的反应时间为12 min。

2.5　反应温度对检测结果的影响

温度能够影响PT、PC与Hg²⁺的反应速率及双链DNA的存在形态。考察了体系的反应温度对检测结果的影响。结果（图5）表明，当温度低于35 ℃时，3种染料的荧光强度均随着温度的升高而升高；当温度高于35 ℃时，3种染料的荧光强度均出现快速下降。这主要是因为温度较低时，温度的升高可以加快化学反应速率，但当温度超过35 ℃时，双链DNA发生裂解，导致荧光信号显著降低。因此，本实验选择的反应温度为35 ℃。

2.6　pH值对检测结果的影响

缓冲溶液的pH值会对检测结果产生影响，主要表现在：一是对PT、PC与Hg²⁺之间的反应（形成双链DNA）产生影响；二是对3种染料的荧光量子产率产生影响；三是对Hg²⁺的水解产生影响（Hg(OH)₂的溶度积常数K_sp=3.0×10^-26，本实验中Hg²⁺检测的最大浓度为5.0×10^-8 mol/L，在pH>9.11时会产生沉淀）。考察了缓冲溶液的pH值对检测结果的影响。结果（图6）表明，缓冲溶液的pH值在7.1~8.0之间时，3种染料的荧光强度均随着pH值的增大而增大；当缓冲溶液的pH>8.0时，它们的荧光强度都随着pH值的增大而逐渐减小。因此，本实验选择缓冲溶液的pH值为8.0。在此条件下，PT、PC与Hg²⁺既可形成较稳定的双链DNA，又不会产生沉淀，检测效果最好。

2.7　离子强度对检测结果的影响

由于单链DNA分子本身带有负电荷，溶液中离子强度的增加可以中和DNA表面的负电荷，有利于双链的形成。通过加入NaNO₃改变体系的离子强度，结果（图7）表明，NaNO₃的浓度在0~60 mmol/L范围内时，随着NaNO₃浓度的增加，3种染料的荧光强度都在增强；当NaNO₃浓度继续增加时，3种染料的荧光强度趋于稳定。这主要是因为，在较低离子强度下，PT和PC表面都带有一定的负电荷，它们与Hg²⁺反应速度相对较慢；随着离子强度的增加，PT和PC表面的负电荷逐渐被中和，有利于双链的形成，因此它们与Hg²⁺的反应速率增加；而较高的离子强度使形成的DNA双链更稳定。因此，本实验选择的NaNO₃浓度为60 mmol/L。

2.8　工作曲线及检出限

在最优实验条件下，考察了3种染料的荧光强度与Hg²⁺浓度之间的关系。图8(a)为不同Hg²⁺浓度所对应的SG-Ⅰ、TAMRA与Cy-5的同步荧光光谱。结果表明，Hg²⁺浓度在一定范围内，三种荧光染料的荧光强度均随着Hg²⁺浓度的增加而增加。当Hg²⁺的浓度在1.0×10^-9~5.0×10^-8 mol/L范围内时，3种染料SG-Ⅰ、TAMRA与Cy-5的荧光强度（ΔF_i =F_i - F₀，F_i 为样品的荧光强度，F₀为空白对照的荧光强度）与Hg²⁺浓度（c）之间均具有良好的线性关系，见图8(b)(c)(d)，其拟合的回归方程分别为：

ΔF₁=16.43c+0.45（R²=0.995）

ΔF₂=17.72c+7.74（R²=0.990）

ΔF₃=19.55c+42.21（R²=0.998）

其检出限分别为3.0×10^-10、3.5×10^-10、2.7×10^-10 mol/L。另外，图8(e)显示，3种染料荧光强度总的变化值(ΔF)与Hg²⁺浓度之间同样具有良好的线性关系，其拟合的回归方程为ΔF=55.19c+37.39（R²=0.999），检出限为1.1×10^-10 mol/L。从上述结果可以看出，利用3种染料总的荧光强度对Hg²⁺进行定量检测，可以显著提高检测的灵敏度、降低方法的检出限。

2.9　方法的选择性

在优化的实验条件下，考察了水体中常见的金属离子（Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Co²⁺和Cd²⁺）对检测方法的影响。结果（图9）表明，在Hg²⁺浓度为5.0×10^-8 mol/L时，其他干扰离子浓度为1.0×10^-5 mol/L 时，Hg²⁺所对应的3种染料的荧光强度仍远大于干扰离子的荧光强度，且干扰离子对应的荧光强度趋近于空白溶液对应的荧光强度。这说明在相同实验条件下，水中常见的金属离子对Hg²⁺的检测几乎没有干扰，即本方法具有良好的选择性。

2.10　实际样品检测

为了检验本方法在实际样品检测中的应用效果，对实际水样中的Hg²⁺进行检测，并通过加标回收实验对方法的准确性进行评价。在自来水(T1~T4)、河水(R1~R4)和池塘水(P1~P4) 3种不同的水样中，分别添加不同浓度的Hg²⁺，消解后，再利用本方法对Hg²⁺的浓度进行测定，并计算加标回收率，结果如表1所示。自来水、河水和池塘水中Hg²⁺浓度分别为1.03、1.81、1.08 nmol/L，均低于国家规定的饮用水中汞含量的标准值0.001 mg/L（4.99 nmol/L）。所有样品检测结果的相对标准偏差（RSD）均在5%以内，表明该方法的重复性较好；所有样品的加标回收率都保持在96.00%~105.00%之间，说明利用该方法进行Hg²⁺检测得到的数据准确度高、可靠性强，能够实现对实际水样中Hg²⁺的准确检测。

3　 结 语

本实验基于GO及两种荧光染料分别标记的单链DNA，结合核酸染料SG-Ⅰ，构建了一种能特异性识别Hg²⁺的三色荧光探针，并利用该探针建立了一种快速、高效、高灵敏定量检测水体中汞离子（Hg²⁺）的新方法。该方法操作简单，灵敏度高，重复性及选择性好，准确度高，能应用于实际水样中Hg²⁺的定量检测。

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基金资助

国家自然科学基金(21465010)

恩施州科技计划项目(XYJ2020000002)

恩施州科技计划项目(D20210019)

恩施州科技计划项目(D20220028)

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目(PT012207)

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目(PT012213)

湖北民族大学研究生教育创新项目(MYG2022001)