羟基含量对Ru（bpy）₃²⁺/CDs@H₂O₂体系检测多巴胺的影响

Effect of Hydroxyl Content on Dopamine Detection by Ru（bpy）₃²⁺/CDs@H₂O₂ System

摘要

以2B铅笔芯为原料，用电氧化法在水相中制备荧光碳点（CDs），再通过H₂O₂氧化得到CDs@H₂O₂，利用透射电子显微镜（TEM）、荧光光谱、Fourier变换红外光谱（FT-IR）与X射线光电子能谱（XPS）对CDs和CDs@H₂O₂进行表征。结果表明，相对于CDs，CDs@H₂O₂表面具有更丰富的羟基官能团。将CDs与CDs@H₂O₂分别用作Ru（bpy）₃²⁺阳极电化学发光（ECL）的共反应剂，Ru（bpy）₃²⁺/CDs@H₂O₂体系的ECL信号强度是Ru（bpy）₃²⁺/CDs体系的8.2倍，证实羟基是CDs作Ru（bpy）₃²⁺共反应剂的活性官能团。基于多巴胺（DA）对Ru（bpy）₃²⁺/CDs@H₂O₂体系ECL信号的猝灭作用，构建了关于DA的ECL猝灭传感器，检测的线性范围为1.6~56.0 μmol/L，检出限为0.23 μmol/L（S/N=3），且实现了对人血清中DA浓度的检测。

Abstract

Using 2B pencil lead as raw material, fluorescent carbon dots (CDs) was prepared in aqueous phase by electric oxidation method, and then CDs@H₂O₂ was obtained by H₂O₂ oxidation. CDs and CDs@H₂O₂ were characterized by electron transmission electron microscopy (TEM), fluorescence spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The results show that the surface of CDs@H₂O₂ has more hydroxyl functional groups than CDs. CDs and CDs@H₂O₂ were respectively used as co-reactant of Ru(bpy)₃²⁺ anode electrochemiluminescence (ECL). The ECL signal of Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂ system was 8.2 times that of Ru(bpy)₃²⁺/CDs system. It was confirmed that hydroxyl group was the active functional group of CDs as Ru(bpy)₃²⁺ coreactive agent. Based on the quenching effect of dopamine (DA) on ECL signal in Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂ system, the ECL quenching sensor for DA was constructed. The linear range of detection was 1.6-56.0 μmol/L, and the detection limit was 0.23 μmol/L (S/N=3). The detection of DA concentration in human serum was realized.

Graphical abstract

关键词

碳点 / 多巴胺 / 电致化学发光 / 共反应剂 / 联吡啶钌 / 血清

Key words

carbon dot / dopamine / electrochemiluminescence / coreactant / Ru(bpy)₃²⁺ / serum

0　 引 言

作为一类新兴的零维碳纳米材料，荧光碳点（carbon dots，CDs）具有尺寸小、化学稳定性高、水溶性好、毒性低的特点，且易于功能化，被广泛用于活细胞成像、生物标记等生物医学领域 ^[1，2]。电化学发光（electrochemiluminescence, ECL）结合了电化学和化学发光的优点，具有较高的灵敏度、选择性和重现性。其中，联吡啶钌（Ru(bpy)₃²⁺）/三丙胺（tripropylamine, TPrA）共反应体系具有良好的稳定性，已经被广泛地研究^[3，4]。然而，TPrA具有毒性且易挥发，在浓度较高时才能获得稳定的ECL信号，因此需要研发高效、低毒的共反应试剂，以满足Ru(bpy)₃²⁺为发光体的ECL体系在生物分析领域中的应用^[5，6]。Long等^[7]首次报道了CDs作Ru(bpy)₃²⁺阳极ECL体系的共反应剂，发现CDs中的苄基单元为活性位点。CDs能够成为Ru(bpy)₃²⁺ ECL体系的良好共反应剂，归因于CDs良好的溶解性、稳定性和快速的电子转移能力、适合的氧化还原势等特点^[8]。Qi等^[9]发现，与CDs具有类似结构和性能的石墨烯量子点（graphene quantum dots, GQDs）也可以用作Ru(bpy)₃²⁺的共反应剂。他们通过NaBH₄将GQDs上的羰基还原为羟基，得到还原性GQDs（R-GQDs），在用作Ru(bpy)₃²⁺共反应剂时表现出更高的活性，羟基是GQDs作共反应试剂的活性官能团，并以此设计了一种氯代苯酚的ECL猝灭传感器。为进一步提高Ru(bpy)₃²⁺/CDs体系的ECL信号强度，Carrara等^[10]通过将含丰富氨基的CDs与Ru(bpy)₃²⁺通过酰胺键键合，缩短了共反应剂CDs与发光体Ru(bpy)₃²⁺之间的距离，从而形成自增强ECL体系，以达到提高Ru(bpy)₃²⁺/CDs的ECL信号强度的目的。Liu等^[11]基于三（4,4-二羧基联吡啶）氯化钌（Ru(dcbpy)₃²⁺）与CDs之间的氢键作用，也得到了自增强的ECL体系。为进一步促进Ru(bpy)₃²⁺/CDs ECL体系在生物和环境检测方面的应用，提高其发光强度和发光效率，仍需大量的基础研究工作。

多巴胺（dopamine，DA）是生物体内重要的神经传递物质，是中枢神经系统中重要的儿茶酚胺类物质^[12]，人体内DA含量失常会引发神经肌肉失调、阿尔茨海默病、精神分裂症等疾病^[13，14]，建立简单、快速的DA分析方法对于疾病的预防、诊断及治疗具有重要意义。本文采用电氧化法与化学氧化法制备了羟基含量较低的CDs与羟基含量较高的CDs@H₂O₂，研究CDs表面的羟基含量对CDs作Ru(bpy)₃²⁺共反应剂活性的影响。并在此基础上，构建了一种关于DA的ECL猝灭传感器。

1　 实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：铅笔芯（2B）购自中国第一铅笔有限公司；联吡啶钌（Ru(bpy)₃²⁺）购自苏州纳凯科技有限公司；TPrA购自上海九鼎化学科技有限公司；DA、H₂O₂（30%）等试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验用水均为超纯水。

仪器：TU-1901型双光束紫外-可见光光度计（UV-Vis，北京普析通用仪器有限责任公司）；Avatar 360 型 Fourier 变换红外光谱仪（FT-IR，Thermo Nicolet公司）；RF-6000型荧光分光光度计（Shimadzu公司）；Escalab 250Xi型X射线光电子能谱（XPS，赛默飞世尔科技公司）；MPI-E Ⅱ型全光谱电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）等仪器设备。

1.2　CDs与CDs@H₂O₂的制备

以2B铅笔芯为工作电极，铂丝电极为对电极，50 mL 0.2 mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）为电解液，采用两电极体系制备CDs，施加电势为6 V，电氧化6 h后，收集反应液。以1 000 r/min转速离心30 min，将所得上清液置于透析袋（分子截留量1 000）中透析5 d，浓缩至5 mL，得到棕黄色液体，产率为3.3%，记为CDs。

取上述CDs 2 mL与0.2 mL 30% H₂O₂于10 mL圆底烧瓶中，在水浴锅中50 ℃搅拌反应30 min，所得溶液在透析袋（分子截留量1 000）中透析3 d，浓缩至2 mL后得到淡黄色溶液，产率为3.1%，记为CDs@H₂O₂。

1.3　电化学检测

循环伏安（CV）扫描及ECL实验均在电化学发光检测仪上进行，采用粒径为0.3 mm和0.05 mm的Al₂O₃粉末依次对玻碳电极（GCE，直径3.0 mm）进行抛光，再用超纯水和乙醇交替超声清洗，N₂吹干。将电极倒置，以GCE为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极构成三电极体系，在扫描速率为50 mV/s、电势扫描范围为+0.2~+1.5 V、光电倍增管高压为900 V，以0.2 mol/L pH 7.2 PBS（分别含有Ru(bpy)₃²⁺、Ru(bpy)₃²⁺/CDs或Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂）为电解液，记录电化学信号与电化学发光信号。

2　 结果与讨论

2.1　材料表征

2.1.1　TEM分析

利用透射电子显微镜（TEM）测试CDs与CDs@H₂O₂的粒径，其结果如图1所示。由图1可知，制备得到的CDs与CDs@H₂O₂都具有较好的分散性，粒径较均一。统计结果表明，CDs与CDs@H₂O₂的平均粒径分别为2.4±0.2 nm与2.5±0.5 nm，表明文中所制备的两种碳质纳米颗粒的粒径接近，CDs被H₂O₂氧化后，粒径变化不大。

2.1.2　FT-IR分析

对CDs与CDs@H₂O₂的结构进行表征，结果如图2所示。由图2可知，与CDs相比较，CDs@H₂O₂位于3 440 cm^-1处羟基（—OH）伸缩振动峰更明显，1 610、1 060 cm^-1处吸收峰分别归属为CDs与CDs@H₂O₂表面羰基（C=O）伸缩振动及醚键（C—O—C）伸缩振动，CDs@H₂O₂在1 720 cm^-1与1 160 cm^-1 处具有更加明显的有羧基（C=O）伸缩振动与（C—O）伸缩振动。由此可知，与CDs相比，CDs@H₂O₂表面具有更加丰富的含氧官能团，这归因于在CDs@H₂O₂的制备过程中采用H₂O₂作为氧化剂^[15]。

2.1.3　XPS分析

对CDs与CDs@H₂O₂的组成和结构进行分析，其结果如图3所示。由图3(a)可知，CDs与CDs@H₂O₂均主要由C和O两种元素组成，其中位于284.2 eV和534.5 eV的特征峰分别归属为C 1s与O 1s。通过对C 1s和O 1s的峰面积进行积分，采用相对灵敏度因子法得到各目标元素的百分含量^[16]，计算得出CDs与CDs@H₂O₂的O/C原子比分别为0.31与0.71。CDs与CDs@H₂O₂的高分辨率C 1s峰可以分解成3个峰（图3(b)(c)），分别对应于sp² 碳（C=C）和sp³碳（C—C）（284.8 eV）、醇碳（C—O）（286.2 eV）及羰基碳（C=O）（288.0 eV）。对CDs与CDs@H₂O₂不同含氧官能团的相对含量进行统计，结果见表1。与CDs相比较，CDs@H₂O₂中C—O含量增加了7.28%，C=O含量接近。由此可以得出，与CDs相比较，CDs@H₂O₂表面具有更丰富的含氧官能团，其中C—O的含量明显增加。

2.1.4　荧光分析

在300~420 nm范围内，以20 nm幅度改变激发波长，分别测试CDs与CDs@H₂O₂的水溶液在350~700 nm范围内的荧光变化。如图4所示，CDs与CDs@H₂O₂的荧光发射波长均随激发波长的改变而改变，荧光强度表现出激发光依赖性。CDs与CDs@H₂O₂最佳发射波长均位于452 nm。当激发波长为420 nm时，CDs的发射波长为524 nm，CDs@H₂O₂的发射波长为505 nm。由此可知，与CDs相比较，CDs@H₂O₂在长波长区域发射波长降低。这是由于随着CDs@H₂O₂表面羟基增加，荧光发射波长发生了蓝移^[17，18]。

2.2　电化学分析

图5为Ru(bpy)₃²⁺、Ru(bpy)₃²⁺/CDs及Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系的电化学行为。由图5(a)可知，在相同实验条件下，GCE在含2.0 μmol/L Ru(bpy)₃²⁺的0.2 mol/L PBS（pH 7.2）中，于1.08 V处出现可逆的氧化还原峰；加入30 ng/mL CDs后，Ru(bpy)₃²⁺/CDs在1.08 V处的还原峰减弱，氧化峰电流增加，说明CDs在Ru(bpy)₃²⁺的电化学氧化还原过程中起到了催化作用^[7]；在2.0 μmol/L Ru(bpy)₃²⁺中加入30 ng/mL CDs@H₂O₂后，Ru(bpy)₃²⁺的还原峰几乎消失，氧化峰电流值进一步增加，展现出更好的催化活性。

进一步考察了Ru(bpy)₃²⁺、Ru(bpy)₃²⁺/CDs与Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系的ECL信号。由图5(b)可知，Ru(bpy)₃²⁺在1.08 V处开始产生ECL信号，在1.18 V处达到最大值，产生的ECL信号较弱；加入CDs后，Ru(bpy)₃²⁺/CDs体系在1.05 V处开始出现ECL信号，在1.18 V处达到最大值，ECL信号强度最大值为71；加入CDs@H₂O₂后，Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系在1.00 V处开始出现ECL信号，在1.18 V处达到最大值，最大值为582，是Ru(bpy)₃²⁺/CDs体系的8.2倍。这说明，CDs作Ru(bpy)₃²⁺共反应剂时，CDs表面的羟基官能团为活性官能团^[19]。

为比较CDs@H₂O₂与TPrA对Ru(bpy)₃²⁺的ECL增强效果，向含2.0 μmol/L Ru(bpy)₃²⁺的PBS溶液中各加入30 ng/mL（约0.03 μmol/L）CDs @H₂O₂与2.0 μmol/L TPrA，分别测试Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂与Ru(bpy)₃²⁺/TPrA的ECL信号。由图5(c)可知，在具有相同ECL信号强度时，TPrA浓度是CDs@H₂O₂浓度的66.7倍。

为考察Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系的稳定性，在电势0.2~1.5 V范围内，GCE在含2.0 μmol/L Ru(bpy)₃²⁺与30 ng/mL CDs@H₂O₂的PBS中连续扫描20圈，Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系ECL信号的相对标准偏差（RSD）为1.66%，见图5(d)。

此外，还考察了Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系长期储存的稳定性，在储存7 d后，ECL信号强度仍保持为初始值的97.4%，这表明所制备的Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系具有良好的稳定性。将3批次的CDs@H₂O分别用于Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂ ECL体系的构建，在相同条件下，ECL信号值的相对标准偏差（RSD）为2.2%。上述结果表明，Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系具有良好的稳定性与重现性，这为其在分析检测中的应用奠定了良好的基础。

2.3　工作曲线

考察了DA对Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系ECL信号的猝灭作用，向含2.0 μmol/L Ru(bpy)₃²⁺与30 ng/mL CDs@H₂O₂的0.2 mol/L pH 7.2的PBS溶液中，加入不同浓度（1.0、1.6、3.8、4.8、7.0、17.0、56.0 μmol/L）的DA，结果如图6所示。由图6(a)可知，随着DA浓度的增加，体系Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂的ECL信号强度逐渐降低，DA对Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂的ECL信号猝灭程度逐渐增大。根据图6(b)，该猝灭过程符合Stern-Volmer方程^[20]，在1.6~56.0 μmol/L范围内，DA浓度与Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂ ECL的猝灭程度呈良好线性关系，猝灭常数K_SV=2.2×10⁵ (mol/L)^-1，线性回归方程为I₀/I = 0.22c + 0.01（I₀为体系起始ECL信号强度，I为加入一定浓度猝灭剂后体系的ECL信号强度，c(mol/L)为DA浓度），线性相关系数R=0.998，检出限为0.23 μmol/L（S/N=3）。与其他CDs用于检测DA的方法相比较（表2），本文中采用CDs@H₂O₂作Ru(bpy)₃²⁺共反应剂，对DA的检出限与文献[21]相当，优于文献[22~25]的检出限。

2.4　实际样品分析

将Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系用于人血清样品中DA含量的检测，以检验ECL猝灭传感器的实用性。将人血清样品分散于0.2 mol/L pH 7.2的PBS中，采用加样回收法测定样品中多巴胺的浓度，检测结果如表3所示。Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系的ECL猝灭传感器用于实际样品中DA检测的回收率为98.6%~103.4%，RSD均小于5%。检测结果令人满意，表明此传感器可以用于实际样品中DA含量的检测。

3　 结 语

本文以铅笔芯为原料制备CDs与CDs@H₂O₂，研究了羟基含量对CDs作Ru(bpy)₃²⁺共反应剂活性的影响。实验结果表明，与CDs相比较，羟基含量高的CDs@H₂O₂作Ru(bpy)₃²⁺共反应试剂对ECL信号具有更好的增敏作用。基于DA对该体系ECL信号的猝灭作用，构建了关于DA的ECL猝灭传感器，检测方法的线性范围为1.6~56.0 μmol/L，检出限为0.23 μmol/L（S/N=3）。将Ru(bpy)₃²⁺/CDs@H₂O₂体系用于人血清中DA的检测，回收率为98.6%~103.4%。

本文为提高CDs作Ru(bpy)₃²⁺共反应剂的活性提供了一种思路，可望促进Ru(bpy)₃²⁺/CDs在生物和环境分析领域的应用。

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基金资助

国家自然科学基金(22264014)

湖北省教育厅科学技术研究项目(B2021157)

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金(PT012106)

湖北民族大学高水平科研成果校内培育项目(PY22006)

湖北民族大学博士启动基金(MY2015B019)