闭鞘姜7个部位α-葡萄糖苷酶抑制活性及其乙醚提取物的GC-MS分析

α-Glucosidase Inhibitory Activities of Seven Parts from Costus speciosus and GC-MS Analyses of Their Ether Extracts

摘要

用乙醚和乙醇对闭鞘姜7个部位进行提取后，用pNPG（4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）法测试α-葡萄糖苷酶体外抑制活性，并通过气相色谱-质谱（GC-MS）联用方法分析测定其乙醚相中的化学成分。共检出化学成分125个，通过峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量，结果显示，闭鞘姜7个部位化学成分差异较大。活性测试结果表明：花瓣、花萼和须根的乙醚提取物的酶抑制率均超过70%，茎的乙醚提取物和根茎的乙醇提取物的酶抑制率在50%左右。因此，闭鞘姜不同部位挥发性成分差异较大，花瓣、花萼和须根的乙醚提取物具有相对较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可为闭鞘姜全株的资源利用提供参考。

Abstract

Seven different parts of fresh Costus speciosus were extracted by ultrasonic extraction with ether and alcohol respectively, and all the samples were tested α-glucosidase inhibitory effect in vitro by pNPG (4-nitrophenyl-beta-d-glucopyranoside) assay. The chemical components of ether extract were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). A total of 125 chemical constituents were detected by GC-MS whose relative contents were determined by peak area normalization method. Results showed that the chemical constituents in each extract significantly differed from others. The bioactivity results showed that the ether extracts of petal, calyxe, and fibrous root presented inhibition of α-glucosidase rate up to 70%, while the ether extract of stem and the alcohol extract of rhizome had the inhibition rate around 50%. In summary, the volatile components in different extracts showed difference, and the ether extracts of petal, calyxe and fibrous root showed relatively strong inhibitory activity of α-glucosidase in vitro, which can provide a reference for the utilization of the whole plant resource of Costus speciosus.

Graphical abstract

0　 引 言

闭鞘姜（Costus speciosus (Koenig) Smith，C. speciosus）为姜科（Zingiberaceae）闭鞘姜属(Costus)多年生草本植物，广泛分布于我国云南、广东、广西和台湾等地，在不丹、柬埔寨、印度等国亚热带地区及澳大利亚也有分布。闭鞘姜喜温暖荫湿，不耐寒，在散射光中生长最佳，常生长于海拔1 700 m以下的林缘、山谷等潮湿地^[1，2]。闭鞘姜株高叶长，花穗艳丽，作为观花观叶植物较为常见^[3]，在中国和印度医药体系中也有应用。闭鞘姜多以根茎入药，别名樟柳头、恩倒（意为“具有很强的安神通气效果的药”）、水蕉花等，性温味微涩，是傣族、壮族、佤族等少数民族的常用药，具有利水消肿、清热解毒、祛风止痛的功效^[2，4]。闭鞘姜嫩茎形似笋，是海南黎族的著名野菜，在狂风暴雨时长势尤旺，故又称为“雷公笋”。民间多将其腌制，或制成保鲜笋、清水罐头等食品^[5]。雷公笋含有丰富的甾类、萜类、黄酮类等化学成分，常食具有开胃消食、降压降糖、保肝护肝，增强免疫机能等功效^[1，5，6]。

20世纪70年代起，闭鞘姜根茎成为重要医药原料薯蓣皂苷元的来源之一。薯蓣皂素具有较好的抗氧化、抗癌和抗糖尿病活性，因此闭鞘姜也被称为“胰岛素植物”^[7]。目前，从闭鞘姜地下部分中分离鉴定的化合物主要为甾体（异螺甾烷醇类和呋甾烷醇类型的甾体皂苷或甙元）和萜类化合物，还有少量黄酮类、脂肪酸等^[2]。Eliza等^[8]和Revathy等^[9]先后通过糖尿病大鼠验证了闭鞘姜根茎的己烷提取物与乙醇提取物的降血糖作用，但闭鞘姜其余部位尚无相关研究。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶以延缓碳水化合物的吸收^[10]。为充分利用闭鞘姜资源，研究闭鞘姜不同部位的化学成分及药理活性，本研究将新鲜的闭鞘姜全株分为花瓣、花萼、叶、茎、须根、根茎及嫩茎7个部位，分别使用乙醚和乙醇进行提取，并采用GC-MS分析乙醚提取物，采用pNPG法测试所有部位提取物的α-葡萄糖苷酶体外抑制活性，希望为后续的食品开发和药理研究奠定基础。

1　 材料与方法

1.1　材料

1.1.1　仪器与试剂

仪器：PL-S80T型数显超声波清洗机(东莞康士洁超声波科技有限公司)、Agilent 7820A、5977E型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)、BGM-150E 型通风柜(广州华盈实验室家具设备公司)、旋转蒸发仪（上海爱朗仪器公司）、DLSB-10/30型低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司）、ELX-800型酶标仪（宝特公司）、万分之一电子秤（北京赛多利斯天平有限公司）、HP-5MS 5% 苯基甲基硅氧烷 (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 弹性石英毛细管柱。

试剂：金雀异黄酮（genistein，GS）、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，含量≥99.5%）、乙醚、无水乙醇、磷酸盐溶液（PBS）为国产AR级试剂。

1.1.2　实验样品

2021年9月，于海南省海口市龙华区中国热带农业科学院海口院区（19°59′ N，110°20′ E）采集闭鞘姜全株，经海南大学林学院刘寿柏博士鉴定其为姜科闭鞘姜属（Costus speciosus (Koenig) Smith），凭证标本（BQJ 20210916）存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.2　方法

1.2.1　样品的制备

将新鲜的闭鞘姜全株分为花瓣、花萼、叶、茎、须根、根茎及嫩茎7个部位，剪切成小块后精确称重，分别以3倍样品体积的乙醚冷浸超声提取3次，超声功率为480 W，每次超声30 min，室温静置5 min后过滤得乙醚提取液。分别合并3次提取液，自然挥发晾干后得7份乙醚提取物，编号为H1、E1、Y1、J1、X1、G1及S1，精确称其质量，计算提取率。提取物用乙醚稀释，作为GC-MS分析样品。再分别以3倍样品体积的乙醇同样操作，得乙醇提取液。分别合并3次提取液，减压浓缩后得7份乙醇提取物，编号为H2、E2、Y2、J2、X2、G2及S2，精确称其质量，计算提取率。

1.2.2　GC-MS 分析条件

1） 气相色谱条件。色谱柱：HP-5MS 5% 苯基甲基硅氧烷 (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温50 ℃，以5 ℃/min 升温至310 ℃，保持10 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He (99.999%)，柱前压43 kPa，载气流速1.0 mL/min；进样量1.0 μL，不分流进样，溶剂延迟时间4.0 min。

2） 质谱条件。电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，调谐方式为标准调谐，电子倍增电压1 718 kV，质量扫描范围m/z 40~550。

1.2.3　 α-葡萄糖苷酶体外抑制活性测试

参考相关文献，采用pNPG法测定14个样品对α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性^[11]。实验分为阳性对照组（金雀异黄酮）、空白对照组、阴性对照组、处理组及本底组。将待测样品用DMSO溶解至3.0 mg/mL（终浓度为200 μg/mL）待用，金雀异黄酮用DMSO溶解至1.5 mmol/L并倍半稀释4次。用磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 6.8）将底物pNPG配制成2.5 mmol/L溶液，将酶配制成0.2 U/mL溶液。取450 μL酶溶液和45 μL待测化合物混合溶于1 mL离心管中，再移取110 μL混合液至96孔板（平行4次），于37 ℃温育15 min，加入40 μL pNPG溶液，继续于37 ℃温育15 min，在酶标仪上于波长405 nm处检测吸光度OD值。与处理组相比，阴性对照用DMSO代替样品溶液，空白对照组用DMSO代替样品溶液、PBS溶液代替pNPG溶液，本底组用PBS溶液代替pNPG溶液。根据公式(1)计算待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率（%）：

\mathrm{抑制}\mathrm{率}=[\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{D}\mathrm{M}\mathrm{S}\mathrm{O}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{P}\mathrm{B}\mathrm{S}}-(\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{样品}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{本底}})]/(\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{D}\mathrm{M}\mathrm{S}\mathrm{O}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{P}\mathrm{B}\mathrm{S}})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(1)

1.2.4　统计分析

使用IBM SPSS Statistics软件（R26.0.0.0）处理数据，根据计算得到的抑制率及其标准误差，通过对金雀异黄酮测试浓度和对应抑制率进行概率分析，计算阳性药的半抑制浓度（IC₅₀）其标准误差。

2　 结 果

2.1　乙醚、乙醇提取率及提取物形态

闭鞘姜7个部位的乙醚、乙醇提取物的形态及提取率如表1所示。

2.2　GC-MS结果分析

H1、E1、Y1、J1、X1、G1及S1的总离子流色谱如图1所示。通过 DataAnalysis 化学工作站，按照 1.2.2 分析条件，结合 Nist2005和Wiley275质谱库对检测到的色谱峰进行检索，参考相关资料进行人工解析并利用峰面积归一化法对化学成分进行定性和定量分析。根据分析结果，共检测出化学成分125个，见表S1（附加材料）。

2.3　 α-葡萄糖苷酶抑制活性

金雀异黄酮测试结果如表2所示，使用IBM SPSS Statistics软件（R26.0.0.0）对测试浓度及其对应的抑制率进行概率分析，计算半抑制浓度IC₅₀=13.564±0.20 μmol/mL。

对表3中样品测试结果进行计算，得到抑制率及其标准误差。

3　 讨论与结论

本研究采用pNPG法对闭鞘姜全株花瓣、花萼、叶、茎、须根、根茎及嫩茎7个部位的乙醚、乙醇提取物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的体外研究。

1） 闭鞘姜主要含有甾类、萜类、脂肪酸及其酯类化合物。本研究利用GC-MS技术对新鲜闭鞘姜全株7个部位的乙醚提取物进行分析，共检测出化学成分125个（表S1），其化学成分及相对含量分别为37个（H1，占93.60%）、35个（E1，占82.85%）、26个（Y1，占78.76%）、34个（J1，占95.05%）、38个（X1，占91.99%）、35个（G1，占86.38%）、36个（S1，占89.09%）。考虑到样品处理过程中使用了塑料容器，推测1-甲基-4-(2-甲基环氧乙烷基)-7-氧杂双环[4.1.0]庚烷、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)等可能为塑料溶于乙醚生成的杂质。通过比对发现，除植物中常见甾类化合物如γ-谷甾醇、豆甾醇外，须根的乙醚提取物含有最高相对含量的甾类化合物，占23.03%，但薯蓣皂素只在根茎和茎中检测到，分别占3.74%和0.61%，由此推测在闭鞘姜中的薯蓣皂素主要富集于根茎，茎中次之。须根和根茎的乙醚提取物含有更丰富的萜类化合物，而在叶的乙醚提取物中未检测出。与常用药用部位根茎相比，闭鞘姜花瓣、茎同样含有丰富的甾类、萜类化合物，值得进行深入研究。本文分析结果与现有闭鞘姜根茎相关内容一致^[2]。

2） 闭鞘姜的花瓣、花萼、茎、须根、根茎和嫩茎均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。体外酶抑制测试结果（表3）显示，样品浓度为200 μg/mL时，闭鞘姜花萼乙醚提取物的酶抑制率约为98.12%，花瓣和须根的乙醚提取物的酶抑制率均高于70%，茎乙醚提取物的酶抑制率约为47.70%。同浓度下，根茎乙醇提取物的酶抑制率约为54.48%，嫩茎的乙醇提取物的酶抑制率约为34.82%，花萼的乙醇提取物的酶抑制率约为26.72%。酶抑制率接近或超过50%意味着很可能含有α-葡萄糖苷酶抑制活性较好的单体化合物。表3还显示，闭鞘姜叶的乙醚、乙醇提取物几乎不具α-葡萄糖苷酶抑制活性。但有报道^[12]称，产自斯里兰卡的闭鞘姜叶的甲醇提取物具有对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，IC₅₀为67.5 μg/mL。但该报道中未提及化学成分分析，推测是产地和提取方式的不同造成化学成分和活性的差异。

闭鞘姜嫩茎是广受大众喜爱的野菜，其除叶外的6个部位均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，值得对其药食两用价值进行深入研究。其乙醚提取物的GC-MS分析结果可为后续化学成分研究提供参考。

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