茵陈原儿茶酸乙酯对非酒精性脂肪肝的作用及机制

Effect and Mechanism of Ethyl 3，4-Dihydroxybenzoate from Artemisia capillaris Thunb. Aerial Part on Non-Alcoholic Steatohepatitis

摘要

茵陈是一种清利湿热，利胆退黄的药食同源中药。本研究通过H₂O₂氧化应激细胞损伤模型从茵陈中筛选出一种具有显著抗氧化活性的成分原儿茶酸乙酯（EDHB），再通过棕榈酸/油酸（PA/OA）诱导的体外细胞模型模拟脂肪肝中脂滴形成，进一步验证了EDHB的体外抗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）作用。体内动物实验通过蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食喂养构建的NASH大鼠模型来评价。结果显示，茵陈中EDHB能有效改善NASH大鼠肝组织病理变化，减轻脂肪变性，降低肝脏转氨酶水平，抑制肝脏炎症因子的表达及转录，并通过激活肝脏核因子红细胞系2相关因子2（Nrf2），有效缓解NASH。

Abstract

Artemisia capillaris Thunb. aerial part is a kind of food homologous traditional Chinese medicine which can clear away dampness and heat, promote gallbladder and reduce jaundice. In this study, ethyl 3,4-dihydroxybenzoate (EDHB), a component with significant antioxidant activity, was screened from A. capillaris aerial part by H₂O₂ oxidative stress cell injury model, and then the formation of lipid droplets in fatty liver was simulated by palmitic acid/oleic acid （PA/OA） further verified the anti-non-alcoholic steatohepatitis (anti-NASH) effect of EDHB in vitro. Animal experiment, established by NASH rat model induced by Methionine choline deficiency (MCD) diet, was used to evaluate the effect of EDHB in vivo. Results showed that EDHB from Artemisia capillaris aerial part could effectively alleviate NASH by improving the pathological changes, reducing the steatosis, lowering the transaminase levels, as well as inhibiting the expression and transcription of inflammatory factors including nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) in liver tissue.

Graphical abstract

关键词

茵陈 / 原儿茶酸乙酯 / 氧化应激 / 炎症 / Nrf2 / 非酒精性脂肪肝

Key words

Artemisia capillaris Thunb. aerial parts / ethyl 3,4-dihydroxybenzoate / oxidative stress / inflammation / Nrf2 / non-alcoholic steatohepatitis

0　 引 言

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是除了酒精以及其他明确肝损害因素以外导致的肝内脂肪过度沉积的疾病，被公认为是全球最常见的代谢性肝病^[1]。NASH可从最开始单纯的脂肪变性发展到肝炎，最后演变为肝硬化和肝细胞癌，成年人的发病率约为25%^[2]。目前国内外NASH相关的晚期肝病及其死亡率大幅增加，且在年轻人中的死亡率占比也迅速增长。越来越多的证据表明，NASH是一种多系统疾病，不仅限于与肝脏相关的疾病，还会影响肝外器官和调节途径^[3]。NASH病程漫长，发病机制复杂，至今仍不明确。在NASH的形成发展过程中，脂质代谢紊乱引起脂质堆积，同时会加速活性氧（ROS）的过度堆积导致氧化应激^[4]，而氧化应激所诱导的线粒体功能障碍可能会造成氧化损伤，从而触发一系列级联信号，导致炎症、细胞死亡和纤维化^[5]。此外，氧化应激又被认为是肝脏脂肪病变发展为脂肪性肝炎的催化剂，在脂肪肝的形成和发展过程中起重要作用, 是脂肪肝受到二次打击的重要因素^[6]，因此抗氧化是治疗NASH的有效策略。目前临床上仅能使用一些保肝降脂类药物，尚无针对NASH的特效药物，因此寻找安全有效的抗NASH药物迫在眉睫^[7]。

茵陈（Artemisia capillaris Thunb. aerial parts，A. capillaris）为菊科植物滨蒿（Artemisia scoparia Waldst.et Kit.）或茵陈蒿（A capillaris Thunb.）的干燥地上部分，是一种能清利湿热、利胆退黄的药食同源中药^[8]。《本草经疏》中记载茵陈为“除湿散热结之要药也”，主风湿寒热，邪气热结，苦寒能燥湿除热，湿热去，则诸症自退矣^[9]。除药用外，民间也喜食茵陈。在甘肃天水和陇南地区，仍有以米粉作茵陈糕、团的习惯^[10]，蒸、炒、凉拌也是常见的烹饪方式^[11]。将茵陈与煎好的鲫鱼煲汤，可有效地疏肝、清肝热，是广东人常用的食疗汤水。用茵陈煮水洗浴也是常用的保健方式^[12]。食用茵陈时多选用幼苗，药用时则幼熟兼宜^[13]，民间有“三月茵陈四月蒿”的说法^[14,15]。现代药理学研究发现，茵陈及其复方药可用于治疗NASH^[16,17]，这可能与其含有具有保肝利胆作用的香豆素类、黄酮类、有机酸类和β-蒎烯类等药用成分有关^[18]。分子机制研究表明，茵陈提取物可通过激活p38 MAPK信号通路干预NASH活性^[19]。

本实验室已经从茵陈中分离、鉴定了多种化合物^[20]。本文利用H₂O₂氧化应激细胞损伤模型，从茵陈中筛选到一种具有显著抗氧化活性的化合物：原儿茶酸乙酯（ethyl 3, 4-dihydroxybenzoate, EDHB）。已有研究证明，原儿茶酸对非酒精性脂肪肝细胞模型具有保护作用^[21]，但是未见EDHB对NASH是否有抑制作用。本研究从细胞和动物层面探讨EDHB缓解NASH的药效及机制，为从茵陈中挖掘抗NASH潜在药物提供实验依据。

1　 材料与方法

1.1　材料、试剂及仪器

材料：茵陈购自江西省赣州市，经暨南大学葛岚岚博士鉴定为茵陈蒿（A. capillaris）的干燥地上部分，凭证标本保藏号20190805，保藏于深圳市人民医院龙华分院中心实验室。HepG2肝癌细胞和THLE-3人正常肝上皮细胞购自中国科学院细胞库。SPF级SD大鼠（雄性，6~8周龄，体重180~200 g）购自江苏华创信诺制药科技有限公司，生产许可证号SYXK（Yue）2020-0262；大鼠饲料（批号HC-MCD02，MCD，美迪森公司）；ODS填料（十八烷基硅烷键合硅胶,YMC公司）；Sephadex LH-20填料（GE公司）。

试剂：DMEM培养基（批号C3113-0500, VivaCell公司）；血清（批号10091148, Gibco公司）；胰酶（批号25200072, Gibco公司）；细胞油红O染色试剂盒（批号G1262, Solarbio公司）；二甲基亚砜（DMSO，批号67-68-5, BBI生命科学有限公司）；TRIzol总RNA抽提试剂（批号15596018, Invitrogen™公司）；无酶无菌水DNase/RNase-free ddH₂O（批号A220-01, GenStar公司）；cDNA试剂盒HiScript^®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesisi Kit（批号R211-01, Vazyme公司）；逆转录试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批号Q711-02, Vazyme公司）；谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（批号C010-2-1, 批号C009-2-1, 南京建成生物工程研究所有限公司）；CCK8试剂（批号K1018, Apexbio公司）；棕榈酸钠（批号S161420-5g, Aladdin公司）；油酸钠（批号S817542-25g, Macklin公司）；RIPA裂解液（批号P0013E, Beyotime公司）；Chemllumlnescent HRP Substrate化学发光试剂盒（批号P90720, Millipore公司）；GAPDH抗体（批号AC002, Abclonal）；iNOS抗体（80373, Proteintech）；鼠抗IgG（批号7076S, Cell Signaling Technology公司）；兔抗IgG（批号7074S, Cell Signaling Technology公司）；色谱级甲醇（批号MTA500, Sigma-Aldrich公司），其他化学纯试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司，实验用水为超纯水。

仪器：Cobas z480型荧光定量PCR仪（上海罗氏制药公司）；3-18KS型高速冷冻离心机（上海希格玛高技术有限公司）；Multiskan™ FC型全自动酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；ECLIPSE Ts2R型荧光显微镜（尼康公司）；Scientz-24型高通量组织研磨器（宁波新芝生物公司）；ZOLLO-UP-250型手持式超声破碎仪（上海左乐仪器有限公司）；Tanon-5200型曝光显影仪（上海天能科技有限公司）；Bruker DPX-400型核磁共振仪（布鲁克公司），TMS为内标；Bruker microTOF-QⅡ型液相色谱质谱联用仪（布鲁克公司）；半制备高效液相色谱仪（泵LC-20A，检测器SPD-20A，广州睿柏仪器科技有限公司）；Essentia LC-16型分析高效液相色谱仪（岛津公司），Cosmosil型反相制备柱（5C₁₈-MS-Ⅱ，5 μm，250 mm×20 mm，Cosmosil公司）；YMC-Pack ODS C18 型分析柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm，YMC公司)。

1.2　方法

1.2.1　原儿茶酸乙酯的制备

室温晾干的茵陈（约7.0 kg）粉碎，用80%乙醇冷浸提取4次，合并提取液，55 ℃下减压浓缩得1.4 kg浸膏；将浸膏混悬于水（5 L）中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液减压浓缩后，得到石油醚部位94 g、乙酸乙酯部位114 g、正丁醇部位401 g和水部位667 g。取上述乙酸乙酯部位114 g，用少量甲醇溶解。ODS填料装柱，湿法上样，甲醇-水（体积比5∶95~100∶0）梯度洗脱，经薄层色谱跟踪合并，合并相同流分后获得10个主流分（Fr. A~Fr. J）。取流分Fr. B（4.0 g），用少量甲醇溶解，进一步Sephadex LH-20柱层析，用95%乙醇洗脱，随后采用薄层（TLC）分析，合并相同流分后获得8个次级流分（Fr. B-1~Fr. B-8）。取次级流分Fr.B-3，用甲醇溶解过滤，高效液相色谱仪（HPLC）分离（Cosmosil 5C₁₈-MS-Ⅱ制备柱，流速8 mL/min，波长254 nm），流动相为甲醇-水（体积比41∶59），在保留时间为23.1 min左右得到化合物EDHB。经HPLC分析，纯度大于98%。

1.2.2　CCK8法检测细胞活力

HepG2和THLE-3细胞（5×10³/孔）接种于96孔板，37 ℃、5% CO₂常规培养24 h后，加入不同浓度的EDHB（0、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400 μmol/L）继续培养24 h，吸取孔内培养液并加入10% CCK8培养2 h，450 nm处测定光密度OD。记录结果并计算细胞活力，细胞活力=（OD_实验组-OD_空白组）/（OD_对照组-OD_空白组）×100%，实验重复3次，取平均值。

1.2.3　H₂O₂诱导的氧化损伤模型

HepG2细胞（5×10³/孔）接种于96孔板，37 ℃、5% CO₂常规培养24 h后，用不同浓度的H₂O₂（0、400、600、800、1 200、1 500 μmol/L）处理24 h，采用CCK8法计算细胞活力。THLE-3细胞（5×10³/孔）接种于96孔板，37 ℃、5% CO₂常规培养24 h后，用不同浓度的H₂O₂（0、25、50、100、200、300 μmol/L）处理24 h，采用CCK8法计算细胞活力。

HepG2和THLE-3细胞（5×10³/孔）接种于96孔板，37 ℃、5% CO₂常规培养21 h，加入不同浓度的EDHB（150、200、250 μmol/L）预处理3 h，再加入H₂O₂（HepG2细胞中1 200 μmol/L；THLE-3细胞中100 μmol/L）共同孵育培养24 h，采用CCK8法计算细胞活力。

1.2.4　PA/OA诱导的体外脂肪肝细胞模型

称取23 mg棕榈酸（PA）加入540 μL NaOH（0.1 mmol/L）中加热至90 ℃以上，振荡5~10 min，趁热加入5% 牛血清白蛋白（BSA）至终体积为5.4 mL。称取50 mg油酸（OA）加入1 080 μL NaOH中加热至90 ℃以上，振荡5~10 min，趁热加入5% BSA至终体积为10.8 mL。按照PA、OA、培养基体积比为1∶2∶45的比例配制混合溶剂PA/OA。THLE-3细胞（1×10⁴/孔）接种于24孔板，培养21 h，加入不同浓度的EDHB（150、200、250 μmol/L）预处理3 h，加入培养基配制的PA/OA（其中PA/OA占1/4，125 μL）共同孵育24 h，用甲醛-钙固定，蒸馏水清洗，60%异丙醇浸洗，油红染色，在显微镜下观察细胞形态。

1.2.5　动物实验

1) 动物造模及分组方法。30只雄性SD大鼠随机分为5组，每组6只。对照组（Control）：MCS（Methionine and Choline Sufficient L-Amino Acid Diet）饮食。模型组（Model）：MCD（Methionine choline deficiency）饮食。PPC组：多烯磷脂酰胆碱胶囊（Polyene Phosphatidylcholine Capsules， PPC，120 mg·kg^-1·d^-1）给药+ MCD饮食。EDHB-L组：EDHB低剂量（25 mg·kg^-1·d^-1）给药 + MCD饮食。EDHB-H组：EDHB高剂量（50 mg·kg^-1·d^-1）给药+MCD饮食。大鼠先正常饮食2~3 d适应后，逐步添加MCD饲料喂养。全部MCD饲料喂养后开始造模并给药，Control组和Model组灌胃等体积生理盐水，PPC组灌胃给药，EDHB-L和EDHB-H组腹腔注射。整个实验周期为4周（28 d），实验结束后麻醉大鼠并解剖取材。该动物实验得到深圳市人民医院动物伦理委员会的审查和批准（伦理批准号LL-KT-2021797），并严格按照动物实验相关法律法规执行。

2) 肝脏组织病理学检查。取各组大鼠肝脏组织（厚度4~6 μm的切片）在10%中性缓冲液福尔马林中固定24 h。脱水，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，苏木素-伊红（HE）染色。制作好的组织病理学切片在光学显微镜下以盲法观察并记录。

3) 肝脏组织转氨酶水平检测。取各组大鼠肝脏组织（20~30 mg），按1∶9的比例加入生理盐水研磨匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液进行检测。肝脏组织转氨酶水平测定严格按照AST和ALT试剂盒操作。

4) 肝脏组织RNA水平检测。取各组大鼠肝脏组织（50~100 mg）加入1 mL Trizol试剂并迅速转移至离心管中匀浆，12 000 r/min离心5 min，取上清加入200 μL氯仿，震荡15 s，室温放置10 min。4 ℃、12 000 r/min冷冻离心15 min，取上清转移至新离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min，4 ℃、12 000 r/min冷冻离心10 min，弃去上清，取胶状白色沉淀中加入1 mL、4 ℃预冷的75%乙醇，温和震荡，7 500 r/min离心5 min，弃上清后置于超净台开盖静置5 min，加入100~200 μL DEPC水溶解后得到RNA样品。取总RNA逆转录得到cDNA（反应条件：25 ℃循环5 min，50 ℃循环15 min，85 ℃循环2 min）。采用RT-PCR方法检测各组白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），核因子红细胞系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和醌氧化还原酶NAD(P)H（quinone oxidoreductase 1, Nqo1）的mRNA水平。引物设计见表1。

5) 肝脏组织蛋白水平检测。采用Western blot法检测肝脏组织iNOS的蛋白表达。取各组肝组织（20~40 mg），按体积比1∶9加入RIPA裂解液，置于超声破碎仪至裂解完全，收集全组织裂解物置于SDS裂解缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝）中，95 ℃煮沸15 min。通过10% SDS-PAGE进行蛋白凝胶分离并转移至PVDF膜（0.45 μm），5%的脱脂奶粉封闭30 min后，一抗孵育1 h，TBST洗涤3次，二抗孵育1 h，TBST洗涤3次后曝光显影。

1.3　数据统计

细胞实验结果表示为“平均值±标准偏差”（mean±SD），动物实验结果表示为平均值±标准误差（mean±SE），并使用双样本t检验对数据进行比较。P<0.05、P<0.01、P<0.001表示组间比较具有统计学差异。

2　 结果与讨论

2.1　茵陈化学成分体外活性筛选

利用H₂O₂氧化应激细胞损伤模型，将实验室前期从茵陈中分离到的化合物进行了活性筛选，结果如图1所示。5个化合物分别为：4-羟基苯甲醛、3,4,α-三羟基苯丙酸甲酯、 (+)-北美鹅掌楸脂素C、EDHB和迷迭香酸。其中，EDHB组的细胞存活率最高，表明其抗氧化活性最高（P<0.01）。因此，选择EDHB进行下一步的体内外抗NASH实验。

2.2　茵陈EDHB对H₂O₂诱导细胞氧化损伤的保护作用

进一步考察了茵陈EDHB对H₂O₂诱导细胞氧化损伤的保护作用。首先检测了EDHB对HepG2肝癌细胞和THLE-3人正常肝上皮细胞的毒性。如图2A、B所示，在250 μmol/L浓度以下，EDHB几乎不会对HepG2和THLE-3细胞造成损伤。该实验的目的是确定EDHB在后续细胞实验中的合适浓度，以排除细胞毒性干扰。根据图2C、D的结果，H₂O₂对HepG2和THLE-3细胞的IC₅₀值分别为800 μmol/L和100 μmol/L。图2E、F显示，在150、200和250 μmol/L浓度下，EDHB能够显著逆转HepG2和THLE-3细胞H₂O₂处理造成的氧化损伤，且呈剂量依赖效应。因此，EDHB对H₂O₂诱导细胞氧化损伤具有保护作用。

2.3　茵陈EDHB的体外抗NASH活性

由于氧化损伤在NASH进展中扮演着重要角色，进一步探究了EDHB的体外抗NASH活性。PA/OA诱导的体外脂肪肝细胞模型成功构建后，THLE-3细胞经油红O染色，结果如图2G所示，PA/OA模型组肝细胞内可见红色的脂滴，颜色深，数量多、体积大，EDHB不同浓度处理组脂滴数量较模型组减少、体积较模型组缩小。因此，茵陈EDHB可有效减少脂滴的形成和数量，具有较好的体外抗NASH活性。

2.4　茵陈EDHB体内抗NASH活性

2.4.1　EDHB对大鼠体重及肝组织病理的影响

采用MCD饲料喂养建立NASH大鼠模型，能复制与人类NASH接近的肝脏病理状态^[22]。本研究中，与Control组大鼠相比，MCD饮食喂养的Model组大鼠体重明显下降，并出现毛发紊乱、精神萎靡等一般表征的改变，2周左右即可建立稳定非酒精性脂肪肝大鼠模型。整个实验过程周期为4周，实验结束后，麻醉大鼠解剖取材。各组肝脏的形态如图3A所示，Control组肝脏表面光滑、红润，质软，Model组大鼠肝脏色浅呈淡红色，表面有油腻感，略硬。PPC及EDHB给药组大鼠肝脏表面色泽红润，质软且油腻感减少。HE染色结果显示，Model组肝细胞内可见大量脂滴空泡，部分肝细胞内可见气球样变，PPC及EDHB干预组肝细胞内脂滴空泡明显减少，其中EDHB-H组较EDHB-L组改善明显，见图3B。与Control组相比，其余各组大鼠食欲不振，对比Control组体重明显增加，其余各组体重都有所减轻，见图3C。以上结果说明茵陈EDHB能有效改善NASH大鼠肝组织病理状态，减轻脂肪变性，但不能改善因为MCD饮食造成的体重降低。

2.4.2　EDHB对转氨酶水平的影响

AST和ALT是肝功能的重要指标，肝脏细胞受到破坏会引起转氨酶升高。其中，ALT主要集中在胞浆内，可直接反映肝细胞的受损程度；AST主要存储于线粒体中，若出现严重肝坏死或破坏，AST在血清中的浓度会增加^[23]。与Control组比较，Model组大鼠肝脏组织中AST和ALT含量均大幅度升高，说明NASH大鼠肝脏组织发生了损伤。与Model组比较，PPC及EDHB干预给药后AST及ALT均有显著性降低，见图3E、F（P<0.001）。结果表明，茵陈EDHB能有效降低NASH大鼠肝脏组织转氨酶水平，对肝脏有保护作用。

2.4.3　EDHB对氧化应激相关指标的影响

Nrf2是氧化应激高敏感性转录因子，可以调控90%以上的抗氧化基因^[24]。研究显示，NASH大鼠肝脏中Nrf2被激活，从而转录大量下游抗氧化蛋白（如Nqo1与HO-1等）^[25]；Nrf2也能通过干扰NF-κB p65转录抑制促炎介质如iNOS与IL-6的产生^[26]，保护这些细胞免于氧化损伤。因此，本文检测了各组大鼠肝组织中IL-6、iNOS、Nrf2和Nqo1的mRNA表达。

如图4A、B所示，与Control组比较， Model组大鼠肝脏组织中IL-6和iNOS的 mRNA表达显著升高（P<0.01，P<0.01），说明NASH大鼠发生了炎症，PPC及EDHB干预给药后IL-6和iNOS的mRNA表达显著性降低（P<0.01，P<0.05），表明茵陈EDHB能有效抑制NASH大鼠肝脏组织炎症因子mRNA水平。如图4C，D所示，与Control组比较，Model组大鼠肝脏组织中Nrf2和Nqo1的 mRNA表达显著升高（P<0.001，P<0.05），提示MCD饲料喂养后，机体启动自我保护，大鼠肝组织中的Nrf2被一定程度地激活，其mRNA及下游Nqo1 mRNA水平上调，这与前人的研究结果一致^[27,28]。与Model组比较，PPC组Nrf2和Nqo1下调，是因为PPC组不是通过Nrf2通路发挥抗炎效果，并不需要激活Nrf2通路。与Model组比较，EDHB干预给药后，Nrf2和Nqo1的mRNA表达进一步显著性升高（P<0.05，P<0.05），说明茵陈EDHB可能通过调节Nrf2改善大鼠肝炎活性。

2.4.4　EDHB对iNOS蛋白相对表达的影响

如图4E、F所示，与Control组比较，Model组大鼠肝脏组织中iNOS的蛋白表达水平显著上调，与Model组比较，PPC及EDHB干预给药后iNOS的蛋白表达显著下调，且EDHB高剂量组较低剂量组改善明显。结果表明，茵陈EDHB能够有效降低NASH大鼠肝组织iNOS的蛋白表达水平。

3　 讨论与结论

目前临床上主要通过调整不健康的生活方式和调节代谢综合征来保护肝脏和降低转氨酶水平，尚无针对NASH的特效药物。NASH发病机制存在很大争议，比较经典的机制是“二次打击”学说——氧化应激^[1]。在该学说中，肝脏脂肪病变造成的氧化损伤是对肝脏的第一次打击，肝脏毒素以及肝损伤后的炎症反应是第二次打击^[6] 。氧化应激是指体内氧化系统和抗氧化系统之间的平衡被打破，过度的氧化应激会导致NASH^[29]。

本研究利用H₂O₂氧化应激细胞损伤模型，从茵陈中筛选出一种具有显著抗氧化活性的成分EDHB，接着通过PA/OA诱导的体外脂肪肝细胞模型模拟脂肪肝中脂滴形成，进一步验证了EDHB的体外抗NASH作用。采用MCD饲料喂养建立NASH大鼠模型，考察了茵陈EDHB对NASH的抑制作用。结果显示，茵陈EDHB能有效改善NASH大鼠肝组织病理状况，减轻脂肪变性，降低肝脏的AST和ALT水平，抑制肝脏炎症因子（IL-6和iNOS）表达，并激活肝脏Nrf2，促进下游Nqo1表达，从而有效缓解NASH。本文研究表明，茵陈EDHB具有良好的应用前景和开发价值，但其具体的作用靶点、成药性等尚未完全阐明，还有待进一步研究。

参考文献

[1] 张海博， 王宇. 非酒精性脂肪肝的现代研究进展［J］. 海南医学， 2017， 28（10）： 1651-1653. DOI： 10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.034 .

[2] ZHANG H B， WANG Y. Research progress of non-alcoholic fatty liver disease［J］. Hainan Medical Journal， 2017， 28（10）： 1651-1653. DOI： 10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.034（Ch ）.

[3] ESLAM M， VALENTI L， ROMEO S. Genetics and epigenetics of NAFLD and NASH： Clinical impact［J］. Journal of Hepatology， 2018， 68（2）： 268-279. DOI： 10.1016/j.jhep.2017.09.003 .

[4] BYRNE C D， TARGHER G. NAFLD： A multisystem disease［J］. Journal of Hepatology， 2015， 62（S1）： S47-S64. DOI： 10.1016/j.jhep.2014.12.012 .

[5] CHEN Z， TIAN R F， SHE Z G， et al. Role of oxidative stress in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease［J］. Free Radical Biology and Medicine， 2020， 152： 116-141. DOI： 10.1016/j.freeradbiomed.2020.02.025 .

[6] BESSONE F， RAZORI M V， ROMA M G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression［J］. Cellular and Molecular Life Sciences， 2019， 76（1）： 99-128. DOI： 10.1007/s00018-018-2947-0 .

[7] FERRO D， BARATTA F， PASTORI D， et al. New insights into the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease： Gut-derived lipopolysaccharides and oxidative stress［J］. Nutrients， 2020， 12（9）： 2762. DOI： 10.3390/nu12092762 .

[8] 李艳， 祝维泽， 李后开. 中药复方和活性化合物调节肠道菌群治疗非酒精性脂肪肝的研究进展［J］. 药学学报， 2022， 57（12）： 3451-3464. DOI： 10.16438/j.0513-4870.2022-0605 .

[9] LI Y， ZHU W Z， LI H K. Research progress of traditional Chinese medicine formulas and active compounds in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease by regulating gut microbiota ［J］. Acta Pharmaceutica Sinica， 2022， 57（12）： 3451-3464. DOI： 10.16438/j.0513-4870.2022-0605（Ch ）.

[10] 刘玉萍， 邱小玉， 刘烨， 等. 茵陈的药理作用研究进展［J］. 中草药， 2019， 50（9）： 2235-2241. DOI： 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.09.033 .

[11] LIU Y P， QIU X Y， LIU Y， et al. Research progress on pharmacological effect of Artemisiae Scopariae Herba ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2019， 50（9）： 2235-2241. DOI： 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.09.033（Ch ）.

[12] 于虹. 茵陈治黄辨析［J］. 天津中医学院学报， 2003， 22（1）： 21-23. DOI： 10.3969/j.issn.1673-9043.2003.01.010 .

[13] YU H. Discussion on treating jaundice by Yinchen （Herba Artemisiae Scopariae）［J］. Journal of Tianjin College of Traditional Chinese Medicine， 2003， 22（1）： 21-23. DOI： 10.3969/j.issn.1673-9043.2003.01.010（Ch ）.

[14] 孟玉珂. 小陇山林区茵陈菜开发前景［J］. 现代园艺， 2018（2）： 19. DOI： 10.14051/j.cnki.xdyy.2018.02.010 .

[15] MENG Y K. Development prospect of Artemisia capillaris in Xiaolongshan forest area［J］. Contemporary Horticulture， 2018（2）： 19. DOI： 10.14051/j.cnki.xdyy.2018.02.010（Ch ）.

[16] 陈西仓， 石丽春， 马震亚. 天水常见野菜及食用与药用［J］. 特种经济动植物， 2015， 18（12）： 37-38.

[17] CHEN X C， SHI L C， MA Z Y. Common wild vegetables in Tianshui and their edible and medicinal use［J］. Special Economic Animals and Plants， 2015， 18（12）： 37-38. DOI： 10.3969/j.issn.1001-4713.2015.12.025（Ch ）.

[18] 曾立昆. 茵陈蒿的趣闻与食疗［J］. 药膳食疗， 2003（8）：43. DOI：CNKI： SUN： YSSL.0.2003-08-029 .

[19] ZENG L K. Interesting stories and dietary therapy of Artemisia capillaris thunb. ［J］. Dietotherapy and Herbal Medicinal Diet， 2003（8）： 43. DOI：CNKI： SUN： YSSL.0.2003-08-029（Ch ）.

[20] 杜毅， 孟凡红， 李敬华. 茵陈采收季节与有效成分及药理的关系［J］. 光明中医， 2012， 27（11）： 2345-2346. DOI： 10.3969/j.issn.1003-8914.2012.11.104 .

[21] DU Y， MENG F H， LI J H. Exploring the relationship between harvest stage of Artemisia capillaries Thunb.， and its active principle as well as pharmacology［J］. Guangming Journal of Chinese Medicine， 2012， 27（11）： 2345-2346. DOI： 10.3969/j.issn.1003-8914.2012.11.104（Ch ）.

[22] 周玲. 排毒降脂有茵陈［J］. 东方药膳， 2008（2）： 44. DOI： CNKI： SUN： YSSL.0.2008-02-029 .

[23] ZHOU L. Detoxification， lipid lowering and wormwood［J］. Oriental Medicated Diet， 2008（2）： 44. DOI： CNKI： SUN： YSSL.0.2008-02-029（Ch ）.

[24] 马献军. 白蒿（茵陈）的食疗作用［J］. 家庭中医药， 2015， 22（4）： 69-70. DOI：CNKI： SUN： JTZY.0.2015-04-037 .

[25] MA X J. Dietary effect of Artemisia Scoparia （Artemisia capillaris）［J］. Family & Traditional Chinese Medicine， 2015， 22（4）： 69-70. DOI：CNKI： SUN： JTZY.0.2015-04-037（Ch ）.

[26] 曹锦花. 茵陈的化学成分和药理作用研究进展［J］. 沈阳药科大学学报， 2013， 30（6）： 489-494. DOI： 10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2013.06.008 .

[27] CAO J H. Advanced study on chemical constituents and pharmaceutical activities of Artemisiae Scopariae Herba ［J］. Journal of Shenyang Pharmaceutical University， 2013， 30（6）： 489-494. DOI： 10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2013.06.008（Ch ）.

[28] 谭艳， 周聪， 黄柔， 等. 茵陈蒿汤对MKR鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的作用［J］. 中国实验方剂学杂志， 2021， 27（21）： 105-113. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212195 .

[29] TAN Y， ZHOU C， HUANG R， et al. Effect of Yinchenhao Tang on type 2 diabetes mellitus complicated with non-alcoholic fatty liver disease in MKR mice［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2021， 27（21）： 105-113. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212195（Ch ）.

[30] 黄丽平， 许远航， 邓敏贞， 等. 茵陈的化学成分、药理作用机制与临床应用研究进展［J］. 天然产物研究与开发， 2021， 33（4）： 676-690. DOI： 10.16333/j.1001-6880.2021.4.018 .

[31] HUANG L P， XU Y H， DENG M Z， et al. Research progress on chemical constituents， pharmacological mechanism and clinical application of Artemisiae Scopariae Herba ［J］. Natural Product Research and Development， 2021， 33（4）： 676-690. DOI： 10.16333/j.1001-6880.2021.4.018（Ch ）.

[32] 贾宁， 邵珊珊， 陈文斌， 等. 茵陈对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂质沉积及p38 MAPK、p62/LC3表达的影响［J］. 现代中西医结合杂志， 2021， 30（3）： 229-235. DOI： 10.3969/j.issn.1008-8849.2021.03.001 .

[33] JIA N， SHAO S S， CHEN W B， et al. Effect of Artemisia capillaris Thunb. on hepatic steatosis and the expression of hepatic p38 MAPK and p62/LC3 in NAFLD mice ［J］. Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， 2021， 30（3）： 229-235. DOI： 10.3969/j.issn.1008-8849.2021.03.001（Ch ）.

[34] GE L L， XIE Q J， WEI X F， et al. Five undescribed plant-derived bisphenols from Artemisia capillaris aerial parts： Structure elucidation， anti-hepatoma activities and plausible biogenetic pathway［J］. Arabian Journal of Chemistry， 2023， 16（4）： 104580. DOI： 10.1016/j.arabjc.2023.104580 .

[35] 陈益耀， 陈轶， 何周桃， 等. 原儿茶酸、白杨素对非酒精性脂肪肝细胞模型的抗氧化作用［J］. 中西医结合肝病杂志， 2018， 28（5）： 294-296. DOI： 10.3969/j.issn.1005-0264.2018.05.005 .

[36] CHEN Y Y， CHEN Y， HE Z T， et al. The Anti-antioxidant role of protocatechuic acid and chrysin on non-alcoholic fatty liver cells［J］. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine on Liver Diseases， 2018， 28（5）： 294-296. DOI： 10.3969/j.issn.1005-0264.2018.05.005（Ch ）.

[37] XIAO L Y， LIANG S， GE L L， et al. Si-Wei-Qing-Gan-Tang improves non-alcoholic steatohepatitis by modulating the nuclear factor-κB signal pathway and autophagy in methionine and choline deficient diet-fed rats［J］. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 530. DOI： 10.3389/fphar.2020.00530 .

[38] 陈阿红， 周小安， 花睿. 肝功能四项检验在肝硬化诊断中的应用价值［J］. 医疗装备， 2022， 35（22）： 48-50. DOI：10.3969/j.issn.1002-2376.2022.22.016 .

[39] CHEN A H， ZHOU X A， HUA R. Application value of four tests of liver function in diagnosis of liver cirrhosis［J］. Medical Equipment， 2022， 35（22）： 48-50. DOI： 10.3969/j.issn.1002-2376.2022.22.016（Ch ）.

[40] GHANIM B Y， AHMAD M I， ABDALLAH Q M， et al. Modulation of NRF2/ARE pathway- and cell death-related genes during drug-induced liver injury［J］. Human & Experimental Toxicology， 2021， 40（12）： 2223-2236. DOI： 10.1177/09603271211027947 .

[41] 李慧， 杨林. Nrf2抗氧化的分子调控机制［J］. 生物信息学， 2018， 16（1）： 1-6. DOI： 10.3969/j.issn.1672-5565.201708001 .

[42] LI H， YANG L. Molecular regulatory mechanism of Nrf2 antioxidant［J］. Chinese Journal of Bioinformatics， 2018， 16（1）： 1-6. DOI： 10.3969/j.issn.1672-5565.201708001（Ch ）.

[43] LI Y Z， SHI B K， DONG F M， et al. Effects of inflammatory responses， apoptosis， and STAT3/NF-κB- and Nrf2-mediated oxidative stress on benign prostatic hyperplasia induced by a high-fat diet［J］. Aging， 2019， 11（15）： 5570-5578. DOI： 10.18632/aging.102138 .

[44] SHARMA R S， HARRISON D J， KISIELEWSKI D， et al. Experimental nonalcoholic steatohepatitis and liver fibrosis are ameliorated by pharmacologic activation of Nrf2 （NF-E2 p45-related factor 2） ［J］. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology， 2018， 5（3）： 367-398. DOI： 10.1016/j.jcmgh.2017.11.016 .

[45] LI B， WANG L， LU Q， et al. Liver injury attenuation by curcumin in a rat NASH model： An Nrf2 activation-mediated effect？［J］. Irish Journal of Medical Science， 2016， 185（1）： 93-100. DOI： 10.1007/s11845-014-1226-9 .

[46] 廖月， 何毅怀， 罗亚文. 氧化应激在急性肝损伤中的作用［J］. 临床肝胆病杂志， 2022， 38（10）： 2402-2407. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.10.039 .

[47] LIAO Y， HE Y H， LUO Y W. Role of oxidative stress in acute liver injury［J］. Journal of Clinical Hepatology， 2022， 38（10）： 2402-2407 （Ch）. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.10.039 .

基金资助

国家自然科学基金(81903760)

深圳市基础研究面上项目(JCYJ20190806151816859)