泥鳅皮冻干粉对CCl₄诱导小鼠肝损伤的保护作用

Protective Effect of Lyophilized Powder of Loach Skin on CCl₄-Induced Liver Injury in Mice

摘要

通过腹腔注射CCl₄诱导建立小鼠肝损伤模型，研究了口服泥鳅皮冻干粉（LPLS）对肝损伤小鼠血清中肝功能标志物、肝组织中氧化应激标志物水平、肝组织的病理学、肝细胞凋亡水平、肝组织中抗氧化应激和细胞凋亡相关信号通路主要参与者mRNA与蛋白表达变化的影响。研究发现，口服LPLS能以剂量依赖的方式，显著改善CCl₄引起的小鼠肝组织病理性变化和肝细胞凋亡程度，显著降低肝损伤小鼠血清中天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的活性，降低肝组织中丙二醛（MDA）含量，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性和还原型谷胱甘肽（GSH）含量；在mRNA和蛋白水平分别上调其核红细胞2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1 （HO-1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2），下调其kelch样ECH相关蛋白1 （Keap-1） 和Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达。因此，LPLS可通过调节氧化应激、肝细胞凋亡发挥肝脏保护作用。

Abstract

Mouse liver injury model was induced by intraperitoneal injection of CCl₄. The effects of oral administration of lyophilized powder of loach skin (LPLS) on the liver function biomarkers in serum, oxidative stress biomarkers in tissue, histopathology changes, the hepatocyte apoptosis level, and the mRNA and protein expression of main factors involving in anti-oxidative stress or apoptosis pathways in liver tissue were studied. This study revealed that LPLS intake significantly improved the histopathologic modification and hepatocyte apoptosis caused by CCl₄ in a dose-dependent manner, also significantly reduced the levels of alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST), decreased the level of malondialdehyde (MDA), as well as increased the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of glutathione (GSH) in liver. Furthermore, LPLS upregulated the expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), heme oxygenase-1 (HO-1), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and downregulated the expression of kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap-1) and Bcl-2-associated X (Bax) on both mRNA and protein level. In short, LPLS can protect the liver by regulating both of oxidative stress and hepatocyte apoptosis in vivo.

Graphical abstract

关键词

泥鳅 / 冻干粉 / 肝损伤 / 氧化应激 / 凋亡

Key words

Misgurnus anguillicaudatus / lyophilized powder / liver injury / oxidative stress / apoptosis

0　 引 言

肝损伤的发病率相对较高，可由多种化学物质引起^[1]。肝脏是重要的解毒器官，能将有毒化学物质转化为代谢物如活性氧（ROS），而过量ROS导致的氧化应激是化学性肝损伤的主要诱因^[2]。CCl₄具有肝毒性，常被用于实验动物化学性肝损伤模型的构建^[3]。CCl₄在肝脏中可转化为三氯甲基自由基（CCl₃^·），通过链式反应激活其他自由基的产生。过量ROS的持续暴露破坏肝细胞氧化/抗氧化平衡，攻击细胞内蛋白质、脂质和DNA成分，导致脂质过氧化、线粒体损伤和肝细胞凋亡等 ^[4，5]。核红细胞2相关因子2（Nrf2）是机体内一种重要的平衡氧化还原的转录因子，高表达于肝脏和肾脏^[6]。在正常生理条件下，Nrf2受到kelch样ECH相关蛋白1（Keap-1）介导的泛素化途径节制，滞留在胞质内并降解；ROS、亲电自由基可促进Nrf2逃脱Keap-1的束缚，进入细胞核，增强血红素加氧酶1（HO-1）的转录^[7]。HO-1是一种抗氧化酶，可以调节氧化应激，与Nrf2共同减轻脂肪性肝病^[8]，对肝炎和肝纤维化具有重要的保护作用^[9]。氧化应激还可破坏B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白介导的正常细胞凋亡自稳机制^[10，11]。Bcl-2家族成员中Bcl-2和Bcl-2相关X蛋白（Bax）分别具有抗凋亡和促凋亡作用^[12]。Bax是决定细胞凋亡命运的关键因素^[13]。严重的氧化应激条件下，被激活的Bax不可逆增强线粒体膜通透性，促进膜间隙细胞色素c持续释放；被释放的细胞色素c进一步导致内源性细胞凋亡持续激活，加剧破坏电子传递链，加速ROS积累和细胞凋亡^[12，13]。

一些植物提取物，包括蓝莓、甘草、葛根和大黄，对CCl₄诱导的肝脏损伤有保护作用。这些植物提取物主要具有抗氧化和抗凋亡活性，修复受损DNA，调节脂质代谢^[1]。还有少量的报道研究了动物提取物具有保护肝脏的作用，比如日本河蚬（Corbicula japonica）和泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus） ^[14，15]。泥鳅具有独特的风味和丰富的营养，常被作为术后虚弱患者的膳食补充剂，助其恢复身体功能^[16]。从泥鳅不同部位提取和纯化的物质已被证明具有多种生理活性，如木瓜蛋白酶消化制备的泥鳅肽具有体外抗氧化活性，在小鼠实验中证明具有抗疲劳作用^[17，18]；菠萝蛋白酶消化泥鳅肉得到的水解物对自发性高血压大鼠有明显的降压作用^[19]；泥鳅多糖能够降低链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖水平^[20]；泥鳅黏液中的多糖可促进T淋巴细胞增殖，提高腹腔巨噬细胞活性，并分别促进辅助性T细胞1（Th1）和辅助性T细胞2（Th2）细胞表达白介素-2（IL-2）和白介素-4（IL-4）^[21]。目前关于泥鳅黏液护肝作用及机制的研究报道较多，而泥鳅皮作为分泌泥鳅黏液的部位^[22]，其护肝作用及机制也受到广泛关注。

本文设计了一系列实验，希望揭示泥鳅皮冻干粉（lyophilized powder of loach skin, LPLS）对CCl₄诱导的小鼠肝损伤的保护作用，考察LPLS通过调控Nrf2/HO-1和Bcl-2/Bax信号通路发挥其肝脏保护作用的机制。

1　 材料与方法

1.1　LPLS的制备

市售活泥鳅经湖北省农业科学院畜牧兽医研究所肖红卫副研究员鉴定，属于鳅科泥鳅属真泥鳅种（Misgurnus anguillicaudatus）。泥鳅在清水中静养5 d后，置于-20 ℃冷冻24 h，切成3~4 cm小段，置于-80 ℃预冻24 h，放入真空冷冻干燥机中除水48 h，再置于-20 ℃冷冻12 h，用镊子取皮置于高速微型粉碎机中粉碎，过20目筛，即得到灰白色LPLS冻干粉。LPLS冻干粉质地轻，可借助超声振荡较快溶于温水。

1.2　实验动物

从华中农业大学实验动物中心购买32只6~8周龄，体重在35±4.5 g的雄性昆明种（KM）小鼠（许可证号：SCXK（鄂）2020—0019），饲养于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所SPF级动物房。本研究所涉及的动物处置方案获湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验动物管理小组审查同意，符合动物伦理学标准，动物实验伦理审查批件编号SYXK-2020-128。

1.3　主要仪器与试剂

FE 177型高速微型粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Bayer 2400型全自动生化分析仪（Siemens公司）； TCS SP8型激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司）；CFX 96型荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）；G:BOX F3型智能化学发光成像系统（Syngene公司）。

花生油（1865171）购自山东鲁花集团有限公司；CCl₄（C805332）购自上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、二甲苯、4%多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；氧化应激标志物测定试剂盒：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）购自南京建成生物工程研究所；苏木精-伊红（H&E）染液套装，荧光染料DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC），总RNA提取试剂盒、cDNA合成预混液、荧光定量PCR试剂盒，RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，兔抗鼠Nrf2、Keap-1、Bcl-2、Bax、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔抗鼠一抗、辣根过氧化氢酶（HRP）标记的羊抗兔二抗、特超敏增强型化学发光（ECL）试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；兔抗鼠HO-1一抗购自Cell Signaling Technology公司。

1.4　方法

1.4.1　动物实验设计

小鼠在新环境适应一周后，随机分成CCl₄组、Control组、CCl₄+LPLS60（LPLS 60 mg/kg）组、CCl₄+LPLS150（LPLS 150 mg/kg）组，每组8只。LPLS的使用剂量参考商萌萌等^[22]关于泥鳅不同部位冻干粉对小鼠四氯化碳化学性肝损伤保护作用的研究。LPLS各组小鼠按上述剂量每日灌胃LPLS 1次，共持续28 d。灌胃1 h后,CCl₄组、CCl₄+LPLS60组和CCl₄+LPLS150组各小鼠按照2 mL/kg剂量腹腔注射体积分数10%的CCl₄花生油溶液^[23]，每周3次，共12次；作为对照，Control组小鼠按上述方法注射花生油。小鼠于末次灌胃且禁食24 h，眼眶取血后处死，称量小鼠体重、肝脏质量，计算小鼠的肝脏指数：

肝脏指数=（肝脏质量/体重）×100%

1.4.2　肝功能标志物测定

采集的小鼠血液4 ℃静置过夜后，在4 ℃下1 200 r/min离心15 min。吸取300 μL血清，使用生化分析仪测定小鼠血清中天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的含量。

1.4.3　氧化应激标志物检测

称取小鼠肝右叶50 mg，加入450 μL生理盐水，匀浆、离心后，按相应试剂盒说明书分别测定小鼠肝组织中的MDA、GSH水平和SOD活性。

1.4.4　肝组织病理学检查

用4%多聚甲醛固定0.2 g肝组织，按常规程序经脱水、二甲苯清洗等处理，包埋在石蜡中，切成4 μm厚度的薄片，脱蜡，进行H&E染色，使用光学显微镜在低倍镜下将肝中央静脉结构调至视野中央，在200倍显微放大倍数下观察肝脏组织病理变化。

1.4.5　荧光TUNEL染色

按TUNEL试剂盒说明书操作，荧光染色小鼠肝组织的石蜡切片，使用激光共聚焦扫描显微镜观察。通过荧光染料DAPI标记，细胞核呈蓝色；TUNEL检测试剂盒用荧光染料FITC标记，阳性凋亡细胞呈绿色。

1.4.6　荧光定量PCR检测

按试剂盒说明书分别从小鼠肝右叶提取总RNA、逆转录，进行荧光定量PCR（qPCR）检测。本研究所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，其序列信息如表1所示。以GAPDH基因为内参，使用2^-ΔΔct 相对定量法对目标基因表达量进行分析。

1.4.7　蛋白免疫印迹（WB）实验

按说明书，使用RIPA裂解液裂解小鼠肝组织并提取总蛋白，使用BCA法对蛋白浓度进行定量；SDS-PAGE电泳分离目的蛋白后，将其电转印至PVDF膜上；5%脱脂牛奶溶液封闭1 h后，用TBST缓冲液洗涤膜2次，每次5 min；将膜与稀释的一抗在4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗涤膜4次，每次洗涤10 min；在室温下，将膜与稀释的二抗孵育1 h；再次用TBST缓冲液清洗，使用ECL试剂盒检测，最后使用智能化学发光成像系统拍照；使用Image J软件对蛋白条带进行灰度值定量，计算所选蛋白表达水平与相应内参蛋白表达水平的比值。所有实验重复3次。

1.4.8　数据处理

通过GraphPad 9程序对实验数据进行分析。数据以“平均值±标准差”表示。采用普通单项方差分析中的多重比较分析实验数据组间的显著性。

2　 结 果

2.1　LPLS对CCl₄处理小鼠肝功能的影响

表2为各组小鼠血清中的AST和ALT水平。由表2可知，CCl₄组小鼠血清中AST、ALT水平较Control组显著升高。与CCl₄组相比，口服LPLS60或LPLS150后，小鼠血清中AST、ALT含量明显下降，且随着口服LPLS剂量的增加而进一步降低。

2.2　LPLS对肝组织病理性变化的影响

图1A为各组小鼠的肝脏指数。由图1A可知，CCl₄组小鼠肝脏指数较Control组明显升高；与CCl₄组相比，口服LPLS60或LPLS150后，小鼠肝脏指数降低，且随着LPLS剂量的增加而进一步降低。图1B为各组200倍的小鼠肝组织切片H&E染色结果。由图1B可知，Control组肝细胞和肝小叶结构正常，而CCl₄组肝小叶结构混乱且难以区分，细胞大面积坏死，血管周围肝细胞结构丧失；口服LPLS60或LPLS150后，与CCl₄组相比，显著减少了肝组织损伤面积和坏死细胞数量，减轻了组织学改变，且随着口服LPLS剂量的增加，小鼠肝组织病理性状态进一步改善。

2.3　LPLS对肝脏氧化应激水平的影响

进一步考察了各组小鼠肝脏的MDA、SOD、GSH水平，结果见图2。

如图2A所示，与Control组相比，CCl₄组小鼠的MDA水平明显升高，而口服LPLS60或LPLS150后，MDA水平下降，接近Control组。如图2B、C所示，与Control组相比，CCl₄组小鼠的SOD和GSH水平显著降低，口服LPLS60或LPLS150后，SOD和GSH水平回升，接近Control组。因此，口服LPLS可以降低CCl₄处理小鼠肝脏的氧化应激水平。

2.4　LPLS对肝脏细胞凋亡水平的影响

图3为各组小鼠肝组织切片TUNEL（FITC）染色结果。由图3可知，与Control组相比，CCl₄组肝脏中绿色荧光标记的凋亡细胞数量显著增加，提示CCl₄所诱导的肝脏细胞异常凋亡；口服LPLS60或LPLS150后，与CCl₄组相比，小鼠肝脏细胞凋亡水平整体降低，且随着LPLS剂量的增加肝脏细胞凋亡的数量进一步下降（图3）。因此，口服LPLS可以降低CCl₄诱导的小鼠肝脏细胞的异常凋亡水平。

2.5　LPLS对肝脏中Nrf2/HO-1信号通路的调控

探讨了LPLS对CCl₄处理小鼠肝脏中Nrf2/HO-1信号通路的调控作用。图4A、B显示各组小鼠肝脏中Nrf2和HO-1的mRNA相对表达量。CCl₄组小鼠肝脏中Nrf2、HO-1的mRNA水平均明显低于Control组；口服LPLS60或LPLS150后，与CCl₄组相比，Nrf2和HO-1的mRNA水平得到不同程度的恢复。这些结果经WB实验进一步证实。图4D~G显示，CCl₄组小鼠肝脏中Nrf2、HO-1的蛋白水平明显低于Control组，但在口服LPLS60或LPLS150后，与CCl₄组相比，小鼠肝脏中Nrf2和HO-1蛋白的表达水平明显升高。此外，荧光定量PCR和WB结果（图4C、D、H）显示，与CCl₄组相比，口服LPLS60或LPLS150后，小鼠肝脏中Nrf2/HO-1信号通路的抑制因子Keap-1的mRNA和蛋白水平均下调。

2.6　LPLS对肝脏中Bcl-2/Bax信号通路的调控

进一步研究了LPLS在CCl₄处理小鼠肝脏中对Bcl-2/Bax信号通路的调控。图5A、B给出了各组小鼠肝脏中Bcl-2和Bax的mRNA相对表达量。与Control组比较，CCl₄组小鼠肝脏中Bcl-2的mRNA水平明显降低、Bax的mRNA水平明显升高；口服LPLS60或LPLS150后，与CCl₄组相比，小鼠肝脏中Bcl-2的mRNA水平明显升高、Bax的mRNA水平明显下降。WB实验证实了这些结果。与CCl₄组相比，口服LPLS60或LPLS150后，小鼠肝脏中Bcl-2的蛋白水平明显升高、Bax的蛋白水平明显降低（图5C~E）。此外，图5F显示，口服LPLS60或LPLS150后，与CCl₄组小鼠相比，小鼠肝脏中Bcl-2/Bax蛋白相对表达量的比值显著增加。

3　 讨论与结论

商萌萌等^[22]通过检测肝功能指标ALT、AST，简单评价了包括LPLS在内的泥鳅不同部位冻干粉对CCl₄诱导小鼠急性肝损伤的保护作用，但未对各冻干粉的护肝机制进行深入研究。本文采用不同工艺制备LPLS，使用CCl₄诱导的慢性肝损伤小鼠模型，进一步研究了LPLS对小鼠肝损伤肝功能标志物和氧化应激标记物水平、肝组织病理改变、肝细胞凋亡水平的影响。

1） LPLS对CCl₄诱导的小鼠肝损伤具有明显的保护作用。与CCl₄组相比，口服LPLS显著降低小鼠血清AST和ALT水平，上调SOD活性和GSH水平，降低MDA水平。结合H&E和TUNEL染色结果，LPLS组小鼠的肝功能明显改善。因此，LPLS对CCl₄诱导的小鼠肝损伤具有明显的保护作用。虽然Control组小鼠血清中AST水平略高于正常值范围, 但考虑到Control组小鼠经历了每周3次、持续4周的花生油腹腔注射，因此这种情况会偶有发生^[24]。

2） LPLS通过调控Nrf2/HO-1信号通路降低CCl₄诱导的小鼠肝损伤。氧化应激深度参与肝脏疾病的发生和发展过程，Nrf2及其负调控因子Keap-1构成了对抗氧化应激损伤的防御机制。根据越来越多的研究，该信号通路可能是治疗肝病的理想靶点之一^[9，25]。Nrf2诱导的HO-1表达增强对不同肝损伤具有保护作用。据报道，许多天然产物，如槲皮素、姜黄素和布渣叶中富含的多酚，可诱导HO-1表达，发挥细胞保护功能，防止氧化损伤^[10，26]。本文通过研究口服LPLS对CCl₄处理小鼠肝脏Keap-1/Nrf2/HO-1通路的调控，确定了LPLS对氧化应激的调节作用。LPLS可上调肝脏HO-1和Nrf2的mRNA和蛋白水平、下调Keap-1的mRNA和蛋白水平，表明LPLS可以通过增强Nrf2/HO-1信号通路启动抗氧化应激的防御机制，有效降低CCl₄诱导的肝损伤程度。

3） LPLS降低了肝脏细胞凋亡的整体水平。 ROS过多释放会导致细胞内氧化剂/抗氧化剂失衡，引起细胞坏死和凋亡。大量肝细胞凋亡在各种肝脏疾病中均有发生，持续的肝细胞凋亡与肝纤维化的发展相关^[3，10]。本文确定了LPLS对肝脏细胞过度凋亡的调节作用。本文数据显示，CCl₄可导致Bax表达上调和Bcl-2表达下调，二者分别具有促凋亡和抗凋亡作用。因此，CCl₄可诱导小鼠肝脏细胞过度凋亡，这与之前的报道一致^[27]。值得注意的是，口服LPLS分别降低和增加了CCl₄处理的小鼠Bax和Bcl-2的肝脏表达，从而降低了肝脏细胞凋亡的整体水平。由于ROS主要攻击线粒体，过多的ROS积累导致氧化应激和线粒体功能障碍^[11]。因此，LPLS启动的Nrf2/HO-1防御机制可能通过抑制氧化应激来减少CCl₄诱导的小鼠肝脏细胞过度凋亡。

综上所述，LPLS能够通过下调小鼠血清AST和ALT水平，上调SOD和GSH水平，降低MDA水平，上调Nrf2、HO-1、Bcl-2基因表达水平，下调Keap-1和Bax蛋白表达水平，有效缓解CCl₄诱导的肝脏氧化应激和细胞凋亡。因此，LPLS具有预防和治疗化学性肝损伤的潜力。

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基金资助

国家自然科学基金(81703409)

动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题(KLAEMB-2019-02)