滇黄芩叶总黄酮的自由基清除及抑酶活性

Radicals Scavenging and Enzymes Inhibitory Activities of Total Flavonoid from Leaves of Scutellaria amoena

摘要

从滇黄芩（Scutellaria amoena）叶中提取黄酮类成分，经制备获得滇黄芩叶总黄酮（SALF），检测其含量，并考察了SALF清除自由基及抑制α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性的能力。结果显示，SALF中黄酮含量为492.1±15.5 mg/g。SALF清除DPPH自由基（DPPH^•）、ABTS自由基（ABTS^•+）、羟基自由基（OH^•）和一氧化氮自由基（NO^•）的半清除率（SC₅₀）分别为57.58±7.10、20.71±1.63、44.40±2.74、104.61±9.39 μg/mL。对酿酒酵母α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase-Y）活性的半抑制浓度（IC₅₀）为228.6±4.61 μg/mL，对大鼠肠道α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase-R）活性的半抑制浓度为128.4±5.83 μg/mL；对胰脂肪酶活性的半抑制浓度为22.41±1.13 μg/mL。统计分析表明，SALF具有一定的自由基清除和α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性的抑制能力。

Abstract

The total flavonoid from leaves of Scutellaria amoena (SALF) was obtained and the content was determined. The radicals scavenging, α-glucosidase and pancreatic lipase inhibitory activities of SALF were investigated. The results showed that the content of total flavonoid was 492.1±15.5 mg/g by spectrophotometry with rutin as a reference. The 50% scavenging concentrations (SC₅₀) of SALF on DPPH radicals (DPPH^•), ABTS radicals (ABTS^•+),hydroxyl radical (OH^•) and nitric oxide radical (NO^•) were 57.58±7.10, 20.71±1.63, 44.40±2.74, and 104.61±9.39 μg/mL, respectively. The 50% inhibitory concentrations of enzymes activities （IC₅₀）of SALF on α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae (α-glucosidase-Y), α-glucosidase from rats small intestine (α-glucosidase-R), and pancreatic lipase were 228.6±4.61, 128.4±5.83, and 22.41±1.13 μg/mL, respectively. The results after statistical analyzed indicate that SALF has a certain degree of radicals scavenging, α-glucosidase and pancreatic lipase inhibitory activities.

Graphical abstract

关键词

滇黄芩 / 总黄酮 / 自由基清除 / α-葡萄糖苷酶 / 胰脂肪酶

Key words

Scutellaria amoena / total flavonoid / radicals scavenging / α-glucosidase / pancreatic lipase

0　 引 言

滇黄芩（Scutellaria amoena C.H.Wright）是唇形科黄芩属的多年生草本植物（图1），主要分布于云南中南部、中部、西北部以及四川南部和贵州西北部，多生长于海拔1 300~3 000 m的山坡松林下。据记载，滇黄芩常以根入药，药材味苦、性寒，入心、肺、胆、大肠经，多用于热症的治疗^[1]。当地彝族、白族、纳西族、傈僳族等少数民族在日常生活中常采集其新鲜茎叶泡茶，用于咽喉肿痛、频繁口渴、小便赤黄、降逆止呃、大便硬结等症的日常保健^[2]，而这些症候往往与现代医学的炎症、机体糖脂代谢紊乱相关。

现代药理学研究表明，滇黄芩根主要含黄酮类成分，并具有抗炎、抗氧化、抗病毒、调脂保肝等药效作用^[3，4]。但目前，滇黄芩叶的药效作用及生物活性研究却鲜有报道。本研究从滇黄芩叶中提取总黄酮，并测试滇黄芩叶总黄酮（total flavonoid from leaves of Scutellaria amoena, SALF）的含量，分析SALF清除自由基能力及对α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性的抑制能力，为滇黄芩的进一步综合开发和利用提供实验依据。

1　 材料与方法

1.1　仪器

仪器：L5S型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、BP211D型电子分析天平（Sartorius公司）、imark型酶标仪（BIO­RAD公司）、JD- JPT型鼠兔解剖台（上海继德教学实验器械厂）、WP-USP-40型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。

1.2　药物与试剂

药物：芦丁对照品（含量>98%，批号20200410，中国食品药品检定研究院）、维生素C（Vitamin C）和姜黄素（curcumin，AR&BR纯，上海源叶生物科技有限公司）、阿卡波糖片（Acarbose，50 mg/片，华东制药有限公司）、奥利司他胶囊（Orlista，0.12 g/粒，重庆华森制药有限公司）。

试剂：对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，阿拉丁公司）；对硝基苯酚丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate, pNPB，Fisher公司）；源于酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase-Y）、胰脂肪酶（BR纯，30 000 U/g）、D101型树脂（BR纯）购自上海源叶生物科技有限公司；1,1′-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1′-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）、2.2′-联氮双（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2′-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS）购自Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

1.3　材料

1.3.1　植物及药材

滇黄芩新鲜叶于2022年7月中旬采自云南省云龙县关坪乡（99°30′49.86″ E，25°51′34.21″ N），经云南中医药大学王皎实验师鉴定为唇形科植物滇黄芩（Scutellaria amoena C.H.Wright）的叶，标本号SAL-001，保存于云南中医药大学医鉴戊楼207室。

1.3.2　大鼠小肠α-葡萄糖苷酶

取SD大鼠（200±20 g，动物许可证号SCXK（豫）2020-0005），禁食24 h后，乙醚麻醉处死。打开腹腔，迅速取出小肠上部置于冰浴手术台上，剖开小肠露出肠黏膜，用冷生理盐水（含0.1%EDTA-2Na）充分冲洗后拭干，用玻片刮取小肠黏膜，称其质量，与冷生理盐水按质量比1∶5制成匀浆液，于4 ^oC、10 000 r/min离心15 min，取上清液，即为大鼠小肠α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase-R）悬液，于冰箱中-20 ^oC保存。本研究所涉及的动物处置方案，获云南中医药大学动物实验伦理审查委员会审查同意，符合动物伦理学标准，动物实验伦理审批编号R-062022S018。

1.4　方法

1.4.1　SALF的提取和制备

将滇黄芩新鲜叶分散晾干，粉碎，过2号筛（直径0.85 mm），取粉末 500 g，加入10倍质量的75%乙醇回流提取3次，每次 2 h。合并提取液，低温减压浓缩，加超纯水分散，再加入石油醚混合，分层萃取，收集水相。水相经D101型大孔吸附树脂吸附后，洗脱，分段收集洗脱液，减压旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得到淡黄色粉末SALF 14.57 g，冷冻保存。

1.4.2　SALF的含量测定

以芦丁为对照品，采用分光光度法测定样品中总黄酮含量。精密称取芦丁对照品8 mg至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，摇匀，定容，得到浓度为0.137 6 mg/mL的标准品溶液。分别量取芦丁标准品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.2 mL于10 mL容量瓶中，加入70%乙醇使总体积为5.0 mL，再加入5%亚硝酸钠（NaNO₂）0.3 mL，混匀，放置6 min，加入10%氯化铝（AlCl₃）0.3 mL，混匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠（NaOH）2.0 mL，最后以70%乙醇定容，强力振摇混匀，放置15 min。以第1份为空白对照，测定各样品溶液在波长510 nm处吸光度（A），绘制芦丁标准曲线。

精密称取SALF 200 mg，用甲醇溶解，于50 mL容量瓶中定容。精密移取上述样品溶液0.15 mL于5.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。同芦丁标准曲线测定方法处理，测定样品溶液在510 nm处的吸光度，根据芦丁标准曲线计算样品中芦丁的含量，再按（1）式计算SALF的含量Y：

Y=\frac{\rho \times V\times D}{m}（1）

其中：ρ（mg/mL）为样品溶液中芦丁的质量浓度；V（mL）为样品溶液体积；D为样品稀释倍数；m（g）为SALF样品的质量。

1.4.3　性能测试

1） 清除自由基的测试

根据文献方法^[5，6]，取0.4 mL不同浓度（10~100 μg/mL）的SALF甲醇溶液，加入3.6 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混匀，避光反应30 min，测定波长517 nm处吸光度。以甲醇代替样品作为空白对照，维生素C作为阳性对照。样品和阳性对照均平行重复测定3次，结果用“平均值±标准偏差”表示。按（2）式计算SALF对DPPH自由基（DPPH^•）的清除率（%）:

\mathrm{清除}\mathrm{率}=\left(\mathrm{1}-A_i/A_{\mathrm{0}}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

其中：A₀表示空白溶液的吸光度；A_i 表示DPPH自由基与样品溶液反应后的吸光度。

根据文献方法^[5，7]，使用无水甲醇稀释ABTS储备液作为工作液，使其在波长734 nm 处的吸光度为0.700±0.005。分别取0.3 mL不同浓度（10~100 μg/mL）的SALF甲醇溶液，各加入2.7 mL ABTS工作液，混匀，于30 ^oC反应30 min，测其在波长734 nm处的吸光度。以甲醇代替样品作为空白对照，维生素C作为阳性对照。样品和阳性对照均平行重复测定3次。按（2）式计算ABTS自由基（ABTS^•+）的清除率。

根据文献方法^[5，7]，取1.0 mL不同浓度（5、10、20、40、80 μg/mL）SALF甲醇溶液，加入0.5 mL 8 mmol/L的硫酸亚铁溶液和0.8 mL 6 mmol/L双氧水，再加入0.5 mL超纯水，37 ^oC水浴1 h后，加入0.2 mL 20 mmol/L的水杨酸钠溶液终止反应。于波长532 nm处测定吸光度。以超纯水作为空白对照，维生素C作为阳性对照。样品和阳性对照均平行重复测定3次。按（2）式计算羟基自由基（OH^•）的清除率。

根据文献方法^[5，8]，取0.5 mL不同浓度（6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）SALF甲醇溶液，加入1.0 mL 10 mmol/L的硝普钠溶液，混匀，37 ^oC孵育150 min，加入1.0 mL Greiss试剂（1%对氨基苯磺酸与0.1%盐酸萘乙二胺质量比1∶1的盐酸溶液）反应6 h后，测定波长546 nm处的吸光度。以甲醇为空白对照，以姜黄素为阳性对照。样品和阳性对照均平行重复测定3次。按（2）式计算一氧化氮自由基（NO^•）的清除率。

2） 抑制酶活性的测试

根据文献方法^[9]，取0.2 mL不同浓度SALF溶液（10、20、40、80、100 μg/mL），分别加入0.2 mL 200 U/mL α-glucosidase-Y酶液，混匀，37 ^oC保温10 min，加入100 μL 70 mmol/L的底物pNPG溶液，37 ^oC保温30 min，再加入2.0 mL 0.5 mol/L Na₂CO₃溶液终止反应，混匀，于波长400 nm处分别测定样品（样品+酶液+底物）、样品空白（样品+缓冲液+底物）、酶（缓冲液+酶液+底物）、酶空白（缓冲液+底物）以及阳性对照阿卡波糖的吸光度。每份样品平行重复测定3次。按（3）式计算α-glucosidase-Y活性抑制率（%）：

\mathrm{抑制}\mathrm{率}=[\mathrm{1}-\frac{(A_{\mathrm{样品}}-A_{\mathrm{样品}\mathrm{空白}})}{\left(A_{\mathrm{酶}}-A_{\mathrm{酶空}\mathrm{白}}\right)}]×100%（3）

根据文献方法^[10]，制备大鼠小肠α-葡萄糖苷酶悬液，使用前于37 ^oC水浴解冻，参照上述方法计算α-glucosidase-R活性抑制率（%）。

根据文献方法^[11]，取20 μL不同浓度（20、40、60、80、100、120 μg/mL）SALF水溶液，分别加入20 μL 0.2 mol/L pH 7.2 PBS溶液，混匀，加入55 μL胰脂肪酶溶液（60 U/mL），混匀，37 ^oC恒温1 h，再加入100 μL 10 mmol/L的底物pNPB溶液，混匀，37 ^oC反应30 min，于波长360 nm处测定吸光度。以超纯水作空白对照，以奥利司他作阳性对照。样品和阳性对照均平行重复测定3次。按（3）式计算胰脂肪酶活性抑制率。

3） 自由基半清除率和酶活性半抑制浓度的计算

根据自由基清除实验结果，分别计算SALF、阳性对照维生素C及姜黄素对自由基的半清除率（SC₅₀）；根据α-glucosidase-Y、α-glucosidase-R、胰脂肪酶活性抑制活性测试结果，分别计算SALF、阳性对照阿卡波糖及奥利司他对酶活性的半抑制浓度（IC₅₀）。计算方法：以样品浓度lgc为横坐标，清除率或抑制率为纵坐标，进行最小二乘法回归，获得回归方程，再根据回归方程计算各样品50%清除率或50%抑制率时所需的样品浓度。数据结果采用SPSS10.0分析软件进行统计学处理，数据间均数比较采用one-way ANOVA分析，P<0.05表示具有显著性差异。

2　 结 果

2.1　SALF含量

以芦丁为对照品，在6.88~30.27 μg/mL范围内，吸光度与SALF含量之间呈良好的线性关系（R²=0.999 9），回归方程为A=0.019 9ρ+0.005 1。根据（1）式，SALF含量为492.1±15.5 mg/g。

2.2　SALF清除自由基能力及抑酶活性

2.2.1　SALF清除自由基能力

SALF对自由基的清除率见图2。结果表明，随着SALF浓度的增加，其DPPH^•、ABTS^•+、OH^•和NO^•的清除率也在增加，自由基清除能力与SALF浓度呈现出正相关。当SALF浓度为80、40、80、100 μg/mL时，DPPH^•、ABTS^•+、OH^•和NO^•四种自由基清除率分别为（58.45±0.09）%、(69.87±1.39)%、(52.83±4.80)%和(39.27±3.13)%，而在给予相同浓度情况下，阳性对照则表现出更强的自由基清除能力。

2.2.2　SALF抑制α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性

SALF对α-glucosidase-Y、α-glucosidase-R、胰脂肪酶的抑制活性，结果见图3。可以看出，随着SALF浓度的增加，其对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制活性也随之增加，抑酶活性与SALF浓度呈现出正相关。当SALF浓度为100 μg/mL时，其对α-glucosidase-Y和α-glucosidase-R的抑制活性分别为（33.30±2.41）%和（39.37±5.79）%，阳性对照阿卡波糖对α-glucosidase-Y和α-glucosidase-R的抑制活性分别为（60.03±2.34）%和（54.17±3.08）%；当SALF浓度为120 μg/mL时，其对胰脂肪酶的抑制活性为（41.96±2.71）%，阳性对照奥利司他对胰脂肪酶的抑制活性为（64.07±5.01）%。

2.2.3　SALF的自由基半清除率和酶活半抑制浓度

分别计算SALF的SC₅₀和IC₅₀，统计分析结果见表1和表2。由表1结果可知，在不同的自由基清除体系中，与阳性对照相比SALF表现出强弱不同的自由基清除能力。SALF对DPPH^•、ABTS^•+的清除能力与阳性对照维生素C相当，无显著性差异（P>0.05）；SALF对OH^•的清除能力与维生素C有显著性差异（P<0.05）；SALF对NO^•的清除能力与姜黄素相比有显著性差异（P<0.05）。由表2结果可知，在α-glucosidase-Y和α-glucosidase-R酶活性抑制实验中，SALF与阳性对照阿卡波糖相比均有显著性差异（P<0.05），对α-glucosidase-Y和α-glucosidase-R的IC₅₀分别为阿卡波糖的5.53倍和2.77倍；在胰脂肪酶活性的抑制实验中，SALF与阳性对照奥利司他相比有显著性差异（P<0.05），IC₅₀是奥利司他的3.41倍。

3　 讨论与结论

3.1　滇黄芩叶富含黄酮成分

对SALF进行初步定性分析，发现其盐酸+镁粉反应、5%氯化铝（AlCl₃）反应均呈阳性，说明富含黄酮类成分。有研究报道^[12]，滇黄芩地上部分富含黄芩素、黄芩苷、千层纸素A、千层纸素A-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、汉黄芩素、去甲汉黄芩素和白杨素等黄酮化合物。因此，有必要进一步通过色谱分析来确证SALF的组成。

3.2　SALF具有一定的清除自由基能力

不同结构的黄酮化合物，其抗氧化能力和清除自由基的能力不同^[13]。通过考察不同反应体系的自由基清除能力，SALF表现出强弱不同的自由基清除能力：对DPPH^•、ABTS^•+自由基的清除能力较强，而对OH^•和NO^•自由基清除能力较弱。这可能与SALF中黄酮物质种类、结构和含量相关。

3.3　SALF对α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶活性具有抑制作用

SALF对α-glucosidase-Y和α-glucosidase-R两种α-葡萄糖苷酶均有一定抑制活性，但弱于阳性对照阿卡波糖。SALF对胰脂肪酶也显示出一定的抑制活性，但弱于阳性对照奥利司他，说明滇黄芩叶具有一定的日常保健功效。

研究表明，黄酮类物质具有清除自由基的能力，而其清除能力与黄酮化合物的结构密切相关。SALF含多种黄酮化合物，其组成与相对含量直接影响其清除自由基的能力和抑制α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的活性。后续工作将对SALF的组成、相对含量及生物活性进行深入研究。

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