三峡库区消落带土壤中携带phoD基因的细菌群落结构特征

Characteristics of Soil phoD-Harbouring Bacteria Community in the Water Level Fluctuation Zone of the Three Gorges Reservoir Area

摘要

为研究三峡库区消落带土壤中解磷细菌群落特性，于2021年5月在干流消落带采集了不同高程的土壤样品，分析了土壤的总磷（TP）、无机磷（IP）和有机磷（OP）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活性，测定了携带phoD基因的细菌群落结构，并探究其与土壤性能指标的关系。结果表明，消落带土壤中携带phoD基因细菌群落的丰富度随高程的降低而下降（P<0.05），不同高程土壤中的优势门和属排序存在差异；各高程间表现出显著差异的细菌有1门1纲1目4科6属，其中Verrucomicrobia门的一支类群在175 m高程土壤的丰度更高，而Streptosporangiaceae科和Aquisphaera属分别在155 m和165 m的低高程土壤中有更高丰度，可能来源于底层沉积物。Spearman相关性分析表明，携带phoD基因的细菌群落多样性与高程、IP含量显著相关。db-RDA分析表明，TP和IP是主导消落带土壤携带phoD基因的细菌群落结构的环境因子。

Abstract

To investigate the characteristics of the phosphate-solubilizing bacterial community in the Water Level Fluctuation Zone (WLFZ) of the Three Gorges Reservoir (TGR) Area, soil samples were collected at different altitudes in May, 2021. The contents of total phosphorus (TP), inorganic phosphorus (IP) and organic phosphorus (OP), and activities of acidic phosphatase (ACP) and alkaline (ALP) phosphatase were analyzed. The community structure of phoD-harbouring bacteria was determined, and its relationship with soil performance parameters was also investigated. The results showed a significant decline in the richness of the soil phoD-harbouring bacterial community in the WLFZ with decreasing altitudes (P<0.05). Moreover, variations in dominant phyla and genera were observed in soils at different altitudes. Among these, one phylum, one class, one order, four families, and six genera exhibited significant differences between altitudes. A taxon from the phylum Verrucomicrobia exhibited higher abundance in soils at an altitude of 175 m while the family Streptosporangiaceae and the genus Aquisphaera showed higher abundance in soils at altitudes of 155 m and 165 m, respectively, suggesting a potential source from the bottom sediment. Spearman correlation analysis demonstrated a significant correlation between the diversity of the phoD-harbouring bacterial community and altitudes as well as IP contents. Distance-based redundancy analysis (db-RDA) confirmed that TP and IP were the primary environmental factors influencing the structure of the phoD-harbouring bacterial community in the WLFZ of the TGR.

Graphical abstract

关键词

三峡库区 / 消落带 / 磷循环 / 群落结构 / phoD基因

Key words

the Three Gorges Reservoir Area / water level fluctuation zone / phosphorus cycle / community structure / phoD gene

0　 引 言

河流将物质和能量输送到河口和沿海海域，是连接陆地和海洋的主要纽带^[1]。在近几十年里，大坝的大规模修建改变了河流的水文条件^[2]，将河流转变为了河道型水库，并对生物地球化学循环过程和生态系统功能产生重大影响^[3~6]。因水位波动出现的消落带^[7]，作为水陆生态系统中物质传递和能量流通最活跃的区域，成为研究的热点区域^[8，9]。

磷是生物活动所需的一种主要元素，高达80%的磷以有机磷形式存在于表层土壤中^[10]。这些有机磷大多以超分子/大分子结构的磷酸单酯存在^[11]，通常无法直接被植物利用。在洪水季节，磷随着降雨等过程进入土壤-水界面并随地表径流进入水体，在河流下游或大坝前，较高悬浮负荷降低了水流速度，导致磷沉积在的河床或河岸带^[12，13]。在磷的迁移和转化过程中，微生物起着重要作用^[14]。磷矿化的微生物过程主要由植物或微生物的磷需求驱动^[15]，微生物通过分泌细胞外酶（如磷酸酶）将有机磷矿化^[16]。约60%的土壤有机磷可以被磷酸酶酶解^[17]，其中磷酸二酯酶（EC 3.1.4）和磷酸单酯酶（EC 3.1.4）在有机磷矿化为无机磷的过程中依次发挥作用^[18]。磷酸单酯酶主要有酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP），其中ALP能适应中性和碱性土壤表现出更高的活性^[19]。phoD基因作为编码ALP细菌的同源基因之一，可为确定编码ALP细菌群落提供有效手段^[20]。携带phoD基因的细菌群落通过ALP调控土壤有机磷矿化的机制已经在森林^[21]、农田^[22]和沉积物^[23]等生境中得到证实，但对消落带更深入的磷循环分子机制的研究还较少。

三峡水库水位被控制在145~175 m之间，形成库区消落带高达30 m的落差。不同高程的消落带土壤经历的淹水深度、淹没时间等水文条件存在差异，土壤中的各形态磷含量和酶活性也表现出差异。145 m高程的土壤长期处于淹水中，总磷含量和磷酸酶活性均较低^[24，25]；165 m高程的消落带土壤，由于频繁经历淹没-出露交替的过程，潜在可被释放的磷较高^[26]。消落带土壤中ALP的活性高于ACP的活性，随着高程降低，二者活性均减弱^[25]。土壤磷形态和磷酸酶活性与解磷细菌群落的丰度和部分特殊类群密切相关^[27]，但目前对于消落带土壤在不同高程上的解磷细菌群落分布特征的研究仍相对匮乏。

本文通过研究三峡库区干流消落带不同高程土壤的理化性质、磷含量、磷酸酶活性和相关功能细菌群落的分布特征，探究消落带土壤中携带phoD基因的细菌在不同高程间群落多样性、组成和结构的差异，并分析这种分布格局的成因。本文研究结果将有助于深刻理解三峡库区消落带土壤有机磷矿化的微生物调控机制。

1　 研究方法

1.1　区域概况

三峡库区（29°16′~31°25′N，106°~111°50′E）位于长江上游河谷地带。该地区以山地（占74%）和丘陵（占22%）为主，气候属于东南亚热带季风气候。年平均气温为16.5~19 ℃，年降水量约为1 100 mm，其中约80%发生在5月至10月^[28]。三峡大坝建成之后，大坝上游形成了垂直高度30 m、最大面积350 km²的消落带，每年水库水位会从夏季（5月至9月）145 m波动至冬季（10月至次年4月）175 m。

1.2　消落带土壤样品采集与处理

在三峡库区干流自上游至下游布置3个消落带采样点，依次为丰都（FD，107°45.067′E，29°53.100′N）、云阳（YY，108°41.167′E，30°56.717′N）、奉节（FJ，109°31.950′E，31°01.984′N）。所有采样点均为缓坡坡地，土壤类型为紫色土壤。在每个采样点，布置3个高程采样带（155、165、175 m）。为避免消落带植物生长的生命活动过程影响消落带土壤微生境和微生物群落，于2021年5月在每个采样带采集3个土壤样品，每个样品在约25 m²范围内采集表层土壤（0~20 cm），混合均匀后，用四分法取适量置于聚乙烯自封袋中，保存于装有冰袋的保温箱中，于当天运回实验室。去除土壤中植物残体、细根和石砾等杂质，将样品分为3份，1份样品自然风干后，研磨过10目筛，于-20 ℃贮藏，用于土壤理化性质测定；1份样品过10目筛后，用于磷酸酶活性测定；1份样品过10目筛后，于-80 ℃贮藏，用于携带phoD基因的细菌群落测定。

1.3　理化指标的测定

土壤pH值以1∶2.5（m/V）的土壤水比例，采用电极法^[29]测定；含水率（MC）采用质量法^[29]测定；土壤有机质（OM）含量采用烧失量法^[30]测定。消落带土壤总磷（TP）、无机磷（IP）、有机磷（OP）含量采用欧洲标准测试委员会框架下发展的磷含量测定（SMT）法^[31]提取，提取液中磷含量采用钼锑钪比色法^[32]测定。酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活性参考Tabatabai提出的快速测定土壤磷酸酶活性的方法^[33]。ACP和ALP活性均表示为每g干重土壤每小时产生的对硝基苯酚（pNP）的量，单位为μmol·g^-1·h^-1。

1.4　高通量测序方法

phoD基因的扩增和测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。

1.4.1　土壤DNA提取

按照制造商的说明，使用土壤基因组DNA提取试剂盒（FastPrep® SPIN Kit for Soil分离试剂盒，MP biomedicals公司）从0.50 g土壤样品中提取基因组DNA一式两份。通过引物组（phoD-F733和phoD-R1083）进行phoD扩增子测序，鉴定土壤中ALP编码基因细菌群落^[20]。

1.4.2　PCR扩增、文库构建和测序

phoD的PCR扩增在GeneAmp® 9700型PCR仪（ABI公司）上运行，PCR的反应体系为TransStart Fastpfu DNA聚合酶20 μL反应体系，体系包括4 μL 5×FastPfu缓冲液、2 μL 2.5 mmol/L 脱氧核糖核苷酸三磷酸、0.8 μL 5 μmol/L正向引物、0.8 μL 5 μmol/L反向引物、0.4 μL FastPfu聚合酶、0.2 μL牛血清白蛋白、10 ng模板DNA，并补充双蒸水至20 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每次循环中，95 ℃保持30 s使模板变性，55 ℃保持30 s，使引物与模板充分退火，72 ℃保持45 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成1个循环。循环完成35次后，于72 ℃最终延伸10 min。PCR扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）目的片段，使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit试剂盒（Illumina公司）构建文库，通过Illumina Hiseq平台进行测序。

1.4.3　物种注释

使用QIIME2（2019.4版本）软件对微生物组生物学信息进行分析。原始序列数据使用demux插件进行解码处理、cutadapt插件进行引物切除，然后使用DADA2插件对序列进行质量过滤、去噪、拼接和嵌合体去除等数据处理。对获得的phoD基因序列，采用Blast best hit方法，通过NT（nt_v20200604）数据库按照80%的序列一致性注释扩增子序列变异（amplicon sequence variants，ASVs）的分类学信息。

1.5　数据处理

采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey校正方法（Tukey HSD检验）评价不同高程样带之间的指标差异。去除丰度低于全体样本测序总量0.001%的ASV后，再根据最小样本序列数抽平得到丰度矩阵，用于后续的一系列细菌群落分析。通过α多样性分析和基于Bray-Curtis距离算法的非度量多维尺度（NMDS）分析确定ASV水平的细菌群落的多样性和结构差异。采用Spearman法分析各个环境因子之间的相关关系，并采用Mantel检验确定ASV水平的携带phoD基因的细菌群落与环境因子之间的相关性。采用基于“hellinger”方法计算的距离矩阵的冗余分析（db-RDA）确定环境因子和属水平的携带phoD基因的细菌群落的相关关系。上述分析采用R语言（R-4.2.1）统计分析和可视化。通过线性判别分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）^[34]得到不同高程的样品之间门到属水平上存在差异的细菌类群。

2　 结果与讨论

2.1　不同高程消落带土壤理化指标的特征

表1为消落带不同高程土壤的理化性质、磷含量以及磷酸酶活性等性能参数。土壤pH在6.76~6.92之间，高程间没有显著差异（P>0.05）；155 m高程消落带土壤的含水率显著高于175 m高程（P<0.05）；土壤有机质随高程增加而增加，但不同高程之间没有显著差异（P>0.05）；土壤中的总磷和无机磷的含量在高程上的分布均遵循165、155、175 m的递增顺序，有机磷含量随高程升高而增加（101.56~148.74 mg/kg），但差异不显著（P>0.05）；土壤ALP活性在所有高程上均显著高于ACP活性，ALP活性在165 m高程最高，ACP活性在155 m高程最高，但3个高程间的差异不显著（P>0.05）。

消落带土壤中的无机磷占比为50.49%~80.66%，高于森林或农田土壤（40%~70%）^[35]。这意味着消落带易被植物利用的磷形态充足，在土壤出露期间，会被植物吸收同化，使植物群落快速生长，但在土壤淹水期间，可能释放到水中增加水体富营养的风险^[36]。所有高程的土壤pH均呈中性且波动范围较小，可能是被偏碱性的江水淹没导致^[37]。在消落带生境适宜的pH条件下，ALP表现更高的活性^[25]。此外，与ACP相比，ALP有更广泛的底物特异性^[38]，可以使其在土壤无机化程度较高时仍能获得可用的磷源，也可能是消落带土壤中ALP活性更高的原因。

2.2　群落多样性

2.2.1　 α多样性

表2为消落带土壤中携带phoD基因的细菌群落的序列数和α多样性指数。携带phoD基因的细菌群落的序列数在各高程之间均无显著差异（P>0.05）。Shannon指数综合衡量物种均匀度和丰富度，携带phoD基因的细菌群落的Shannon指数，在175 m高程土壤中最高，但高程间没有显著差异（P>0.05）。Chao1指数反映了细菌群落的丰富度，在175 m高程土壤中最高，并且显著高于155、165 m高程（P<0.05）。Pielou指数反映细菌物种的均匀度，在175 m高程土壤中最高，但没有显著差异（P>0.05）。以上结果表明，携带phoD基因的细菌群落的丰富度和均匀度在175 m高程土壤中最高，在155、165 m高程土壤间的差异不大，可能与175 m高程土壤受到水淹胁迫干扰的频率和程度相对较小有关。

2.2.2　 β多样性

采用NMDS确定携带phoD基因的细菌群落的β多样性在各高程之间的差异（图1）。样品在图中距离越大，表明其细菌群落的β多样性差异越大。携带phoD基因的细菌群落按照不同高程聚集成类，表明不同高程间的β多样性存在较大差异。175 m高程的3个采样点样品之间距离很近，表明在水淹干扰较小的175 m高程上，不同采样点的土壤携带phoD基因的细菌群落结构相差不大。165 m高程的3个采样点样品之间距离较大，但与另外两个高程采样点的距离很远，形成明显聚类，表明165 m高程的消落带土壤中携带phoD基因的细菌群落结构和其他样品相比发生了较大变化。

不同高程间水淹干扰差异可能是主导消落带携带phoD基因的细菌群落多样性的变化因素。适度的干扰可以提高群落多样性，周期性淹水显著增强了中等程度淹水干扰原核生物的多样性^[6]，但过轻或过重的干扰均会使多样性降低^[39]。消落带土壤细菌多样性相较于河岸带土壤多样性有所降低，在低高程的区域，水位频繁受到三峡大坝调控的影响，消落带生境水淹干扰的频率和程度也更高，干扰会很大程度降低表层土壤的细菌丰度^[40]。

2.3　群落组成

消落带土壤中携带phoD基因的细菌共鉴定出11门65科144属。图2为门和属水平上不同高程土壤中优势细菌群落的组成。

主要优势门（相对丰度>1%）包括：放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和蓝藻门（Cyanobacteria）。155 m高程土壤携带phoD基因的细菌优势门依次为放线菌门（51%）、变形菌门（33%）和浮霉菌门（12%）；165 m高程土壤中的优势门排序相同，相对丰度依次为70%、20%和8%；与其他两个高程不同，175 m高程土壤中的优势门依次为变形菌门（44%）、放线菌门（43%）和浮霉菌门（9%）。各优势门在不同高程的占比不同，放线菌门在165 m高程消落带土壤中分布最多（43%），175 m高程最少（26%）；而变形菌门相反，在165 m高程消落带土壤中分布最少（20%），175 m高程最多（43%）；浮霉菌门在155 m高程土壤中分布最多（43%），在165、175 m高程分布的比例分别为27%和30%。

主要优势属（相对丰度>1%）共有22个，包括Phytohabitans（18%）、Streptomyces（15%）、Vario- vorax（5%）、Acidovorax（5%）和Pseudomonas（4%）等。155 m高程土壤中的优势属依次为Streptomyces（25%）、Acidovorax（9%）、Pseudomonas（5%）和Phytohabitans（4%）；165 m高程土壤中的优势属依次为Phytohabitans（45%）、Streptomyces（9%）、Pseudomonas（3%）和Acidovorax（3%）；175 m高程土壤中的优势属依次为Streptomyces（14%）、Variovorax（13%）、Pseudomonas（6%）和Acidovorax（4%）。各优势属在不同高程的占比不同，Pseudomonas、Variovorax和Rubrobacter 3个属中分别有87%、87%和51%主要分布在175 m高程；Phytohabitans属90%都分布在165 m高程；Streptomyces、Acidovorax、Gemmata、Thermobispora 4个属分别有52%、60%、61%和55%分布在155 m高程；Pseudomonas和Bradyrhizobium属在3个高程分布相差不大；Allokutzneria属的分布特征与其他优势属不同，该属的48%和45%分别分布在155 m和175 m高程，但在165 m高程土壤分布较少，仅为7%。

采用LEfSe分析不同高程间存在显著差异的细菌类群（线性判别分析>2.0），共发现1门1纲1目4科6属（图3）。Verrucomicrobia门的一支类群（Verrucomicrobiae纲Verrucomicrobiales目Verrucomicrobioaceae科Luteolibacter属），以及Corynebacteriaceae科Corynebacterium属和Hylemonella属等，主要集中在175 m高程中，而在155 m和165 m高程消落带土壤中分布较少，表明这些细菌类群可能不能适应较低高程土壤中长时间的水淹胁迫。部分细菌类群在较低高程的消落带生境有较高的丰度，其中Streptosporangiaceae科在155 m高程土壤中的丰度更高，Aquisphaera属在165 m高程消落带土壤中的丰度更高。

一方面，一些确定性过程会影响群落的组成，如某些物种特征能够适应环境变化，或者能够在种间相互作用（竞争等）中占据优势从而表现出更高的丰度^[41]。另一方面，一些随机化过程也可能塑造消落带细菌群落的组成，相较于距离河流水体更远的河岸土壤，沉积物中的细菌群落与距离较近的土壤中有更高的相似性^[42]，细菌可能从沉积物或水体中迁移到消落带土壤定植。有研究在淡水沉积物中发现Aquisphaera属^[43]，推断在165 m高程土壤中富集的Aquisphaera属细菌可能来自河流沉积物。

2.4　携带phoD基因的细菌群落与土壤理化性质的关系

图4为携带phoD基因的细菌群落与消落带土壤理化性质的Spearman相关性分析及Mantel检验结果。Mental检验结果表明，ASV水平上的携带phoD基因的细菌群落与采样点距大坝的距离和ALP活性显著相关（P<0.05）。Spearman相关性分析表明，携带phoD基因的细菌群落的多样性（div_D）与高程（ALT）和IP含量显著正相关（P<0.05）。此外，ALP活性与采样点距大坝的距离（DIS）显著正相关（P<0.05）；TP含量与IP含量显著正相关（P<0.01），与DIS显著负相关（P<0.05）；MC与高程显著负相关（P<0.01）。

图5为db-RDA分析结果，表示消落带土壤携带phoD基因的细菌群落结构和部分优势属与环境因子的关系。两个主坐标（CAP1和CAP2）共同解释了携带phoD基因的细菌群落总体变异的39.90%，其中CAP1解释度为24.28%，主要代表了IP、OP、TP、ACP和ALP；CAP2解释度为15.62%，主要代表了pH、OM和MC。对携带phoD基因的细菌群落有显著影响的环境因子有TP（r²=0.742，P=0.015）和IP（r²=0.691，P=0.026）。优势属（点）与环境因子（箭头）的方向是否一致代表正、负相关性，丰度最高的优势属受不同环境因子的调控，其中影响丰度最高的Phytohabitans属的环境因子有ACP、ALP活性和MC，影响Acidovorax属的环境因子有TP、IP和MC，影响Variovorax属的环境因子有OP、OM以及pH。

IP和TP含量是主导携带phoD基因的细菌群落结构的主要因素，且细菌群落的多样性与IP含量呈显著正相关关系。IP是微生物直接利用的底物，当其含量升高时，增加了资源可利用性，携带phoD基因的细菌群落的丰度和多样性升高^[44]，并且会使微生物短期内从K策略转向r策略以响应土壤有效养分的变化^[45]，从而改变其群落结构。此外，携带phoD基因的细菌为维持自身生存需求，会在解磷过程中增加丰度的同时释放出无机磷，从而使土壤表现为高IP含量^[46]。TP含量充足时，不同类群的细菌响应效果存在差异，相对于不施加磷肥，携带phoD基因的细菌在施加磷肥时的目和科水平上的群落组成都发生了变化^[47]，表明不同细菌对磷含量变化的敏感程度不同。这可能与该类群在种间竞争中获得优势有关，如Bradyrhizobium属可以产生有机酸来解磷，从而在竞争中获得优势^[48]。

土壤含水率、有机质和pH等条件也可能影响携带phoD基因的细菌群落结构。土壤含水率降低会使微生物脱水，抑制微生物代谢，导致微生物活性降低进而降低其丰度^[49]；土壤含水率升高，会使土壤出现缺氧，携带phoD基因的细菌群落中的兼性厌氧型生物会增加，如Singulisphaera和Pseudorhodoferax，进而改变群落结构^[50，51]。携带phoD基因的不同细菌对有机质的响应不同，丰度较高的类群，如变形菌门的部分细菌类群，随着有机质含量升高丰富度增加，而部分稀有类群，如浮霉菌门的部分细菌类群，则表现出相反的趋势^[52]。pH对携带phoD基因的细菌群落的调控作用已在多个研究中被证实，其主要与根际的有机酸分泌和对根际土壤中总体微生物群落的丰度和活性提升有关^[19，53]。

3　 结 论

本文调查了三峡库区消落带不同高程土壤中解磷细菌群落组成、结构及其与环境因子的相关关系，研究发现：

1） 三峡库区消落带土壤中携带phoD基因的细菌丰富度随高程降低而显著下降，不同高程土壤中携带phoD基因的细菌群落的β多样性也存在显著差异；

2） 消落带土壤中携带phoD基因的细菌的主要优势门为放线菌门、变形菌门、浮霉菌门、厚壁菌门和蓝藻门，主要优势属有Phytohabitans、Streptomyces、Variovorax、Acidovorax和Pseudomonas等，不同高程土壤中携带phoD基因的细菌群落在优势门和属的排序存在差异；

3） Verrucomicrobia门的一支类群（Verrucomicrobiae纲Verrucomicrobiales目Verrucomicrobioaceae科Luteolibacter属），以及Corynebacteriaceae科Corynebacterium属和Hylemonella属等在175 m高程土壤的丰度更高，部分细菌类群如Streptosporangiaceae科和Aquisphaera属分别在155 m和165 m的低高程消落带土壤中有更高丰度，可能来源于底层沉积物；

4） Spearman相关性分析表明，携带phoD基因的细菌群落多样性与采样点高程和IP含量显著正相关。db-RDA分析结果表明，TP和IP含量是消落带土壤携带phoD基因的细菌群落结构的主要环境因子。

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基金资助

国家自然科学基金(32001195)