三峡库区冬季河岸带土壤微生物群落结构及功能

Structure and Function of Winter Soil Microbial Communities in Riparian Zone of the Three Gorges Reservoir Area

摘要

人为周期性调控水库运行条件下，河岸带生境复杂，其土壤微生物特性研究甚少。本研究选取三峡库区干流河岸带土壤为研究对象，于水库调度运行高水位时期，探索土壤微生物沿程变化特征及其影响因素，并预测它们在土壤生态系统中的关键功能。研究发现，微生物群落的α多样性指数随着河岸带与大坝的距离增大而逐渐增加，在上下游不同的处理间，细菌β多样性有着显著性差异（P<0.001），真菌无显著性差异（P>0.05）；群落组成相似性随Bray-Curtis距离的增加而逐渐降低（细菌，P<0.001；真菌，P>0.05）；PICRUSt2功能预测分析表明，土壤细菌主要功能以代谢（Metabolism，78.64%）相关通路为主，碳代谢相关的酶功能基因的表达远高于氮代谢酶功能基因的表达；硝酸还原酶基因在氮代谢中发挥了重要作用，Armatimonadota门和髌骨菌门（Patescibacteria）以及螺旋体门（Spirochaetota）可作为冬季河岸带土壤微生物代谢途径的标记性物种。

Abstract

The riparian habitat undergoes complex changes due to the artificial periodic operation of reservoirs, and little is known about the characteristics of riparian soil microorganisms during the winter season. In this study, riparian zones were selected as the research object during the high water level period of reservoir operation to investigate the variation characteristics in soil microorganisms, explore the driving factors, and predict key functions along the Three Gorges Reservoir (TGR). The results revealed that the α-diversity index of microbial communities increased with the distance from the dam. Between the upstream and downstream, the β-diversity of bacteria showed a significant difference (P<0.001) while fungi exhibited no significant difference (P>0.05). The similarity of community composition decreased as the Bray-Curtis distance increased (Bacteria: P<0.001; Fungi: P>0.05). PICRUSt2 function prediction showed that the main function of soil bacteria was related to metabolism pathways (78.64%), and the expression of carbon metabolism-related enzyme functional genes was much higher than that of nitrogen metabolism-related enzyme functional genes. Additionally, the nitrate reductase gene played a crucial role in nitrogen metabolism, and Armatimonadota, Patescibacteria and Spirochaetota could be used as marker taxa of the microbial metabolic pathway in winter riparian zones.

Graphical abstract

关键词

三峡库区 / 河岸带土壤 / 微生物群落 / 显著性差异物种 / 功能基因 / 代谢

Key words

the Three Gorges Reservoir Area / riparian zone soil / microbial communities / significantly differential species / functional genes / metabolism

0　 引 言

三峡大坝是当今世界最大的水力发电工程，兼具防洪、发电、航运和水资源利用等重要功能^[1，2]。三峡库区是非常重要的生态功能区，在确保长江下游生态安全和维护长江生态系统健康方面发挥着至关重要的作用^[3]。由于独特的“冬蓄夏排”水文调度方式，库区两岸形成了总面积达348.93 km²的水陆交错区^[4]。三峡工程在带来防洪、发电等便利的同时也引发了诸多新问题，如库区生物多样性降低、水土流失、土地利用变化、重金属污染等生态问题日益严重^[4~7]，进而影响三峡库区的生态完整性。

三峡库区河岸带是由水生生态系统向陆生生态系统过渡所形成水陆交错区^[8，9]，是水陆生态环境之间物质、能量、信息传输与转换最为活跃的区域，兼具水域和陆地双重特征。三峡水库在蓄水后水位季节性波动，使得河岸带形成“水淹-干旱”交替胁迫的特点，带来了极大的生态环境问题。目前已有研究者对库区内河岸植被^[7，10]、不同土地利用方式^[11，12]、水淹胁迫^[13，14]、植物群落^[15，16]等做了大量研究，但对该区域内冬季河岸带土壤微生物群落结构及其功能鲜少研究。微生物是土壤生态系统中最活跃的部分，在生态系统的诸多过程中都扮演着重要角色，对外界环境的干扰也有着十分敏感的响应^[17，18]。冬季河岸带微生物群落结构的变化、组成差异以及物种功能基因的表达均可在一定程度上反映土壤生态系统功能和过程，土壤生态系统中微生物如何响应生境条件的变化不得而知。在此过程中，微生物受多种生物和非生物因素影响。已有研究表明，植被类型^[19]、土壤性质^[20]、土壤酶活性^[21]、水文条件^[22]以及人为活动干扰^[17，23]等均会对其产生影响。在人为周期性调控水库运行下，与消落带出露期相比，三峡水库冬季河岸带土壤相对稳定，因此冬季河岸带土壤生态系统研究作为消落带出露期的生态基线，可为河岸带土壤碳循环过程及生态修复提供理论依据。

本研究的主要目的有：1） 研究三峡库区河岸带土壤微生物多样性沿程变化趋势和群落组成差异；2） 揭示影响河岸带土壤微生物群落及物种组成的重要因素；3） 初步探索三峡库区干流不同区段的物种差异性以及细菌群落的功能基因表达情况。本研究可望为水位脉动下河岸带土壤微生物群落结构及物种功能基因的表达提供数据参考，为河岸土壤生态系统管理提供理论依据。

1　 材料与方法

1.1　研究区域

研究区域选取三峡库区干流河岸带（见图1）。三峡库区以东南亚热带季风气候为主，年平均气温16.5~19 ℃，年平均降雨量1 100 mm，其中80%降雨发生在4—10月^[24]。土壤类型主要包含红土、黄土和山地黄土^[25]。三峡水库干流库区段消落带面积占库区消落带的44.53%，且涪陵下游区县消落带所占面积较大^[26]。干流库岸是保护三峡水库的直接防线，也是沿岸居民生活、生产的集中地。根据三峡库区自然地理环境特征和消落带分布情况，选取三峡库区干流的库区背景断面（朱沱），库区变动回水区（木洞），库区中段过渡区（涪陵、忠县、万州）以及库区坝前高山峡谷区（奉节、巴东、香溪河口、茅坪）共9处典型河岸带进行样品采集。采样点信息如表1所示。

1.2　土壤样品采集与分析

此次采样活动于2021年12月中旬开展，整个采样在一周内完成，采样期间三峡水库坝前水位为170.88~171.48 m。用洛阳铲采集河岸带表层土壤（0~20 cm），将明显的土壤残枝、落叶和石块等杂质去除，采用四分法将土壤样品充分混匀装填在聚乙烯自封袋中，低温储存，运回实验室。将一部分土壤样品保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于后续环境DNA的提取；一部分样品保存在4 ℃，用于测量土壤含水率（soil water content，SWC）、微生物量碳（microbial biomass carbon，MBC）和土壤胞外酶活性等指标；剩余土壤样品室温下自然风干，测量土壤pH值、土壤总碳（total carbon，TC）、总氮（total nitrogen，TN）以及总磷（total phosphorus，TP）等理化指标。

本研究按照酶活性检测试剂盒（https://www.boxbio.cn）的说明书对碳[β-1,4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG）、β-木糖苷酶（β-xylosidase，BX）、纤维二糖水解酶（cellobiosidase，CBH）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）]，氮[β-1,4-N-乙酰葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG）和亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，LAP）]和磷[酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）]相关的土壤微生物胞外酶活性进行测定。所有酶活性检测在M200PRO型多功能酶标仪（Tecan生物科技公司）上进行。酶活性最终数据采用MBC进行归一化处理，以避免MBC变化所带来的不确定性^[27]。其中，MBC通过氯仿熏蒸萃取法测定^[28，29]。土壤pH值采用FE20型pH计（梅特勒-托利多公司）测定。土壤TC和TN含量用Vario PYRO Cube型元素分析仪（Elementar公司）测量。土壤TP采用SMT方法进行分析^[30，31]。

1.3　土壤微生物测定

使用Powersoil^® DNA提取试剂盒（MoBio公司）提取土壤总DNA。每份土壤样品设2个平行样本。纯化后的DNA通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。检测合格的样本用于后续PCR扩增。本研究中使用引物对338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）/806R（5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′）^[32，33]扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域；用引物ITS1F（5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′）/ITS2R（5′-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）^[34，35]扩增真菌ITS基因。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒纯化，之后，将纯化产物以等摩尔比合并，送往上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina MiSeq平台（http://www.majorbio.com）进行测序。

1.4　数据分析

所有生物信息学分析均基于扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASVs）^[36]，使用DATA2去噪以去除任何低质量读数，然后将合格的数据合并序列聚类为ASVs^[37]。

本研究中分别参照Silva数据库（Release132，http://www.arb-silva.de）和Unite真菌数据库（Release7.2，http://unite.ut.ee/index.php）^[38]对细菌和真菌ASVs进行物种分类。采用单因素方差分析（ANOVA）以确定细菌和真菌多样性的显著性差异。不同组别间的微生物群落异同使用主坐标分析（PCoA）以及基于物种门水平层面的Welch’s T（W-T）检验实现。利用皮尔森（Pearson）相关性研究土壤理化性质、酶活性与微生物α多样性之间的关系。利用linkET包^[39]进行Mantel Test分析检验微生物群落对外界环境因子以及微生物多样性变化的响应。物种-环境因子相关性网络分析使用ggraph包实现。微生物群落相似性的Bray-Curtis距离衰减模式利用geosphere包和vegan包实现。

该研究中所有R包的运行都是在R（4.2.1）中执行。统计分析使用OriginPro 2021（OriginLab公司）进行。此外，基于PICRUSt2工具对微生物进行功能预测，应用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）预测代谢途径^[40，41]。

2　 结果与讨论

2.1　河岸带土壤微生物群落组成及沿程变化趋势

通过对三峡库区干流河岸带土壤细菌及真菌α多样性沿程变化趋势进行分析，结果见图2。其中：B表示细菌（bacteria）；F表示真菌（fungi）；Ace为丰富度指数，Simpson为多样性指数，Shannoneven为均匀度指数，PD为系统发育多样性指数。研究结果显示，细菌和真菌α多样性指数整体变化趋势一致，即距三峡大坝越远，河岸带土壤微生物丰富度和多样性越高，但整体均未呈现出显著性变化（P>0.05）。这可能与三峡库区不同区段河岸带土壤基底性质存在一定差异有关。

进一步研究了微生物群落组成、α多样性以及优势物种的沿程变化，结果见图3。我们将物种相对丰度小于0.01%归类为others，定义为稀有物种^[42]。由图3A可知，微生物群落组成方面，优势细菌物种主要为放线菌门（Actinobacteriota，24.85%）、变形杆菌门（Proteobacteria，19.95%）、绿弯菌门（Chloroflexi，15.25%）和酸杆菌门（Acidobacteriota，14.52%）；真菌物种以子囊菌门（Ascomycota，29.85%）、未分类真菌门类（unclassified_k_Fungi，24.27%）、被孢霉门（Mortierellomycota，20.82%）和担子菌门（Basidiomycota，17.50%）为主。属层面，较为丰富的细菌物种为盖勒氏菌属（norank_f_norank_o_Gaiellales，5.02%）、硫黄球菌属（norank_f_norank_o_Vicinamibacterales，4.27%）、norank_f_Roseiflexaceae（3.57%）、norank_f_norank_o_norank_c_MB-A2-108（3.56%）、norank_f_Vicinamibacteraceae（3.13%）；真菌物种以unclassified_k_Fungi（24.27%）、被孢霉菌属（Mortierella，20.80%）、unclassified_p_Basidiomycota（7.32%）、unclassified_p_Rozellomycota（5.57%）、Clavaria（4.39%）、新赤壳属（Neocosmospora，3.12%）以及假散囊菌属（Pseudeurotium，3.01%）为主（图3A）。值得注意的是，细菌属水平物种中59.68%为稀有物种，且丰富物种中绝大多数为未知物种。

采用单因素方差分析探讨三峡库区干流沿程细菌和真菌群落α多样性差异，结果见图3B。研究发现，在群落丰富度（Ace指数）、多样性（Simpson指数）以及均匀度（Shannoneven指数）方面，细菌和真菌两者之间表现出极显著性差异，而群落系统发育多样性（PD指数）未表现出显著性差异。本研究在细菌群落和真菌群落中分别检测到7 670个ASVs和3 351个ASVs，细菌群落α多样性远高于真菌群落，图3B中的箱图数据也显示出细菌丰富度和多样性远高于真菌。进一步将优势群落中占比最高的放线菌门（Actinobacteriota）和子囊菌门（Ascomycota）物种进行沿程变化研究，结果见图3C。结果显示，前者随着点位距离三峡大坝越远，物种相对丰度含量呈显著降低趋势，后者未发现明显变化趋势。

2.2　微生物群落β多样性与物种差异分析

细菌群落β多样性在不同区段可明显区分，且显著性差异物种类别远多于真菌群落。基于Abund-Jaccard距离算法，采用PCoA（门和属水平）对三峡库区坝前干流进行降维分析（图4A），发现上游区段（朱沱~木洞）和下游区段（木洞~坝前）细菌群落可明显区分开，而真菌群落不明显。推测是由于上游段（Group1）土质主要为沙质土壤类型，地势平坦，受人类活动影响较大，三峡库区周期性调节水位致使上游区段呈现周期性耕种农作物^[4]。人为施肥等农事活动增加了土壤中碳、氮和磷源的输入，而细菌是土壤中多样性最丰富的微生物类群，且对环境变化极其敏感^[12，43]。下游段（Group2）土壤主要为紫色土和黄壤，地貌类型以低山丘陵、坡地为主，距离大坝越近，两岸土壤生态系统受人为影响越小，土层越稀薄，水土流失加重^{[4，11，44]}。进一步采用W-T检验在物种门水平层面探讨了两个区段之间的显著性差异物种，结果见图4B。研究显示，在细菌群落中，放线菌门（Actinobacteriota）、新型厌氧甲烷氧化菌门（Methylomirabilota）和Myxococcota门在三峡库区下游段占比显著高于上游段，而硝化螺旋菌门（Nitrospirota）、MBNT15菌门和螺旋体门（Spirochaetota）在三峡库区上游段显著高于下游段。结果表明，硝化螺旋菌、MBNT15和螺旋体菌对人类活动的影响可能更为敏感。人工合成氮肥施肥量的增加导致上游土壤氮素输入量增大，而硝化螺旋体门中的物种主要参与土壤中的氮循环^[17]，这可能是上游中该物种相对丰度占比显著高于下游的主要原因。真菌群落中，只发现两类物种（担子菌门（Basidiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota））存在显著性差异，且均表现为下游丰度高于上游。由图4C可知，细菌和真菌群落组成相似度随Bray-Curtis距离的增加而呈现出不同程度的降低，且细菌群落的距离衰减趋势明显高于真菌群落（细菌 P<0.001；真菌P>0.05）。

2.3　环境因子对微生物群落的影响

库区内环境因子分布特征存在一定差异性。具体而言，库区上游段SWC远高于下游，上游土壤呈弱酸性（pH<7.0），而下游土壤整体呈弱碱性（BD除外）；土壤碳相关的酶活性与氮相关酶活性比值约为0.8，与全球尺度上碳氮酶化学计量比值（1∶1）不一致。

环境因子对微生物α多样性以及群落影响也表现出一定差异，结果见图5A。Mantel检验结果表明，SWC、pH与真菌中的Ace指数、Shannoneven指数以及PD指数均呈显著相关（P<0.05），且SWC与它们表现出正向关联，pH完全相反。TC、TN和TP都与微生物群落无显著关联。有学者^[40，45]认为TN和TP不是决定微生物种群组成的主导因素。但该研究并未发现酶活性对真菌α多样性有显著性相关（P>0.05）。尽管酶活性对细菌或真菌单一α多样性无显著影响（P>0.05），但BX和NAG酶活性可对细菌/真菌α多样性比值产生显著性正向影响（P<0.05）。这可能是由于细菌和真菌之间存在相互协同或竞争以应对外界环境变化所导致。另一个有趣的现象是所有土壤理化性质、酶活性以及微生物α多样性对微生物（包含细菌和真菌）群落的影响均不显著（P>0.05）。图中绿色线条仅反映出细菌Shannoneven指数、SWC和CBH酶活性对真菌群落作用强度强于其余影响因素（P>0.05）。绝大多数真菌为好氧菌，当土壤处于大量水分条件下极易引起土壤容重增加、养分减少等诸多理化因子的变化，不利于真菌群落结构的稳定和功能发挥^[46]。与真菌群落相比，细菌群落具有更好的应对外界水分变化的能力^[47]。张丹丹等^[4]也发现消落区域内水分的不同是造成微生物群落差异的主要原因之一，这在一定程度上解释了SWC对真菌群落作用强度略高于细菌的原因。尽管有研究显示土壤酶活性在碳、氮和磷周转过程中具有重要作用且与土壤微生物群落的分布关系密切^[48，49]，但在本文图5A、B中未发现类似结果。

图5C显示了环境因子与显著性差异物种间的互作关系。BG酶活性与MBNT15门，BX酶活性与球囊菌门，NAG酶活性与Myxococcota门之间都有着显著负向作用关系；CBH酶活性与蛭弧菌门（Bdellovibrionota）有着显著正向作用关系（P<0.05）。微生物对外界环境因子的响应存在一定差异，物种与物种之间也存在一定协同或竞争关系。图5C中仅保留了具有显著（P<0.05）正向或负向作用关系的物种和环境因子。后续研究可考虑将多个影响因素的协同作用纳入环境因子对微生物的影响，以增强人们对该复杂过程的理解。

2.4　土壤细菌KEGG代谢通路分析及功能预测

基于PICRUSt2对河岸带土壤细菌进行KEGG代谢通路分析。如图6A所示，三峡库区河岸带土壤细菌在一级预测功能中主要为代谢（metabolism）相关通路（相对丰度占比78.64%），其次为遗传信息处理（genetic information processing，7.06%）、环境信息处理（environmental information processing，4.92%）、细胞过程（cellular processes，4.27%）、人类疾病（human diseases，3.30%）和有机系统（organismal systems，1.81%）。将代谢相关通路进行二级功能预测，如图6B所示，代谢通路中最具代表性的KEGG功能类别是全局和概述图谱（global and overview maps），其次是碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）、能量代谢（energy metabolism）、辅因子和维生素代谢（metabolism of cofactors and vitamins）以及其他次生代谢的生物合成。

碳代谢方面主要涉及甲烷代谢、碳固定和碳降解3个反应。如图6C所示，不同反应占比由大到小次序为：碳降解，碳固定，甲烷代谢趋势；绝大多数与碳代谢相关的酶功能基因含量表现出下游段显著高于上游段。对于氮代谢而言（图6D），与生物固氮（NF）和异化硝酸盐还原为铵过程（DNRA）相关的酶基因（固氮酶Ec:1.18.6.1和亚硝酸盐还原酶Ec:1.7.2.2）相对丰度均值呈现出库区上游段明显高于库区下游段。已有研究表明，包括反硝化作用和DNRA在内的硝酸盐还原是河口土壤中氮代谢的主要功能途径^[50，51]，生物固氮是氮进入生物圈的主要过程^[52]。因此，推测上游段由于土壤基质较好，人为输入营养物质较多，土壤生物量增多，继而导致固氮酶基因 （Ec:1.18.6.1）和亚硝酸盐还原酶基因 （Ec:1.7.2.2）活性表达增强。此外，在氮代谢方面还观察到硝酸还原酶基因 （Ec:1.7.99.4）相对丰度均值占比最高，表明硝酸盐转化过程剧烈，有研究^[53]认为该过程有利于反硝化作用和DNRA。整体而言，与碳代谢相关的酶功能基因含量远高于与氮代谢相关的酶功能基因含量（图6C、D）。这可能与冬季的低温环境有关，有学者^[54]认为温度的变化不但会影响细菌功能的发挥，还会影响土壤微生物的生长并改变其群落结构。

Armatimonadota门、髌骨菌门和螺旋体门可作为冬季河岸带土壤微生物代谢途径的标记性物种。对显著性差异物种（细菌）相对丰度与KEGG二级代谢通路预测功能基因相对丰度的Spearman相关性进行分析。由图7可知，Armatimonadota门、髌骨菌门与二级代谢通路呈显著正相关关系（P<0.05），这与Tian等^[55]有关髌骨菌门对地下水环境的适应性研究结果相一致。髌骨菌门物种可参与碳水化合物、蛋白质、脂质代谢和生物合成过程、辅因子代谢等。在碳水化合物代谢中，该物种保留了简单中间代谢产物的基本代谢基因^[55]。Armatimonadota门显著正向影响碳和氮代谢相关的酶功能基因的表达，而髌骨菌门物种重点影响碳固定相关酶功能基因的表达（图7）。尽管Armatimonadota门、髌骨菌门和螺旋体门均为非优势门类物种且占比较低，但在微生物功能代谢方面发挥着至关重要的作用。

有研究者^[56]认为放线菌门作为优势物种具有异养生理机能，在碳代谢和同化、复杂有机化合物降解等方面扮演着重要角色，但本研究未发现放线菌门物种与二级代谢通路以及碳、氮代谢功能之间存在显著相关性（P>0.05）。这可能是由于其他物种（如硝化螺旋菌门和MBNT15门物种）增强了碳固定相关酶功能基因的表达，对放线菌门物种有着显著负向作用进而抑制了放线菌门物种活性的表达所致（图5C、图7）。

3　 结 论

本文通过高通量测序技术和PICRUSt2功能预测分析，研究了三峡库区高水位干流河岸带土壤微生物群落组成、变化特征、差异性物种、影响因素以及酶功能基因表达情况。初步揭示了微生物多样性沿程变化趋势和不同区段微生物群落物种差异性，探讨了土壤性质和酶活性对微生物α多样性以及微生物群落的影响，阐释了部分代谢通路、碳和氮相关的酶功能基因与显著性差异物种间的互作关联。主要结论如下：

1） 细菌群落中以放线菌门物种占比最高，真菌则以子囊菌门物种占比最高，与大多数类似研究结果相一致；

2） 细菌和真菌α多样性表现出随着河岸带与大坝的距离增大而逐渐增加趋势，β多样性随着Bray-Curtis距离的增加而逐渐降低（细菌P<0.001；真菌P>0.05）；

3） 河岸带细菌多样性受酶活（亮氨酸氨基肽酶和多酚氧化酶活性）显著影响（P<0.05），真菌多样性易受SWC和pH影响；未发现其他环境因子对微生物群落有显著影响（P>0.05）；

4） PICRUSt2分析结果表明，代谢相关的通路占比最高，碳代谢方面中碳降解相关的酶功能基因表达占主导地位；氮代谢则以硝酸还原酶基因的表达为主；

5） Armatimonadota门和髌骨菌门以及螺旋体门物种在冬季河岸带土壤微生物功能代谢中发挥至关重要的作用。

本研究将有助于提高人们对微生物介导土壤生源要素循环相关机制的认识，并为消落带出露期间生态修复管理提供理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金(42107273)

水利部重大计划项目(SKS-2022081)

中国科学院“西部之光”人才培养计划“西部青年学者”项目