槟榔中4种酚类化合物的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

Analysis on the Four Phenolic Compounds in Areca Nut by UPLC-ESI-Q- TOF-MS

摘要

采用超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）分析方法，测定了不同产地（中国海南、广东、广西和越南、印度尼西亚）及批次的槟榔饮片中4种主要酚类化合物的含量。结果显示：海南产3批槟榔饮片中的4种主要酚类化合物原花青素B₁（2.476±0.090 mg/g）、儿茶素（3.379±0.108 mg/g）、原花青素B₂（0.108±0.010 mg/g）和表儿茶素（0.454±0.015 mg/g）含量的均值最高，且相对稳定；中国广东、广西和越南、印度尼西亚产槟榔饮片酚类化合物含量均低于海南，且不同批次4种主要酚类化合物含量变化较大。本研究以多指标酚类化合物来评价槟榔饮片质量，可望为综合开发槟榔新用途提供参考。

Abstract

The contents of 4 main phenolic compounds in areca nut decoction pieces from different places (Hainan, Guangdong and Guangxi in China, Vietnam and Indonesia) and batches were determined by using ultra-high performance liquid chromatography-electrospray/quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-Q-TOF-MS) analysis. The results show that the contents of procyanidin B₁ (2.476±0.090 mg/g), catechin (3.379±0.108 mg/g), procyanidin B₂ (0.108±0.010 mg/g) and epicatechin (0.454±0.015 mg/g) are the highest in 3 batches of areca nut decoction pieces produced in Hainan, and relatively stable. The contents of phenolic compounds in areca nut decoction pieces produced in Guangdong, Guangxi in China, Vietnam and Indonesia are significantly lower than those in Hainan, and the contents of 4 main phenolic compounds change greatly among batches. In this study, the quality of areca nut decoction pieces is evaluated by multi-index phenolic compounds, which is expected to provide reference for comprehensive development of new uses of areca nut.

Graphical abstract

关键词

中草药 / 药食 / 槟榔 / 超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS） / 酚类化合物

Key words

Chinese herbal medicine / medicine and food / areca nut / ultra-high performance liquid chromatography-electrospray/quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-Q-TOF-MS) / phenolic compounds

0　 引 言

近年来，新型冠状病毒肺炎疫情肆虐全球，严重影响人们的健康和生活。在此次疫情防治中，中药发挥了举足轻重的作用，使人们重新认识到中药材在疾病防治方面和药食两用方面的潜在价值^[1]。国家卫生健康委员会发布的历版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》推荐中药（饮片）用药中，槟榔饮片用药频次为7^[2]。同时，槟榔加工制成的食品在市场亦有销售。我国是世界槟榔的主产地之一，近几年年产量占世界总产量的20%以上，已形成了新兴的槟榔产业。槟榔的药用价值亟需深度挖掘，食用价值亦有待探索^[3]。

槟榔为棕榈科植物槟榔（Areca catechu L.）的干燥成熟种子，具有杀虫、消积、行气、利水和截疟等功效，常用于寄生虫病、消化不良、腹胀、腹痛、水肿和黄疸的治疗^[4]。槟榔为我国著名的四大南药之一,广泛分布于南亚和东南亚，包括中国、印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾和越南等国，在我国主要分布在广东、广西、海南等地。百余种中药复方含有槟榔如四磨汤、槟榔四消丸、槟榔十三味丸和柴胡舒肝丸等，临床常用于治疗抑郁症等多种精神疾病^[5，6]。现代药理研究表明，槟榔具有抗寄生虫、抗氧化、抗结核、抗细菌和真菌、抗炎镇痛、抗过敏、抗缺氧、调节血糖和血脂等多方面的药理活性^[7~9]，尤其对寄生虫病、消化功能紊乱和抑郁症具有较好的治疗作用^[10]。槟榔中蕴含有丰富的天然活性成分^[11]，主要为生物碱类（0.3%~0.6%）和酚类（31.1%）化合物。其中，最主要的活性成分为生物碱类化合物，均与鞣质结合存在。生物碱类化合物中主要含槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、异去甲基槟榔次碱和去甲基槟榔次碱等。作为传统中药，槟榔从1953年至今被历版《中华人民共和国药典》收录，对其质量一直采用测定单一指标成分槟榔碱的含量来控制。但是，目前有很多研究结果显示，槟榔及其主要成分槟榔碱过量使用时具有致癌、致畸和致突变的风险，而关于食用槟榔可能致癌的报道也时有披露，特别是导致口腔癌发生的风险更是令人担忧。这也使得人们过于关注槟榔的危害，而忽视了其长期使用的历史和有益的功效，影响了对槟榔其他功效的深入挖掘^[12]。

作为槟榔中含量较多的天然活性成分，酚类化合物无疑是发掘槟榔新用途的很好的研究对象。研究发现，槟榔多酚可以促进骨骼形成，改善骨质疏松^[13]；槟榔酚类物质对变异链球菌（Streptococcus mutans）有较好的抑制效果，在预防龋齿、抑制致龋菌方面有一定的作用^[14]；纯化后的槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用显著增强^[15]；槟榔水溶性提取物可以改善抑郁症状和认知功能下降^[16~18]，而槟榔生物碱无此活性^[19]。目前已证实，槟榔中存在不同的抗抑郁活性成分和毒性成分^[17，20]，其中一些天然代谢物可能参与抑郁症的干预，主要包括L-苯丙氨酸、原儿茶酸、烟酸、L-酪氨酸、苯佐卡因、丁香酸等^[21]。

孙立立等^[22]以所含水分、水浸出物、醇浸出物、醚溶性生物碱的含量来评价6产地15批次市售槟榔饮片的质量，发现其外观及内在质量有明显差异，但未给出明确的差异成分。近年来，高效液相色谱和高效液相色谱-电喷雾串联离子阱质谱等新技术被用于槟榔中的多酚类物质的检测^[23~25]，同时槟榔多酚类物质的提取工艺也不断优化，如成焕等^[26]采用响应面法优化提取条件，提取率与理论预测值基本一致。目前，关于我国槟榔主产地的饮片多组分系统分析尚未见报道。本文采用超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）法对不同主产地槟榔中的4种主要酚类化合物进行定量分析，希望为槟榔的综合利用和安全用药提供数据支持和技术参考。

1　 材料与方法

1.1　药材及酚类提取

实验所用槟榔饮片于2017年5月购自河南省新乡市佐今明制药股份有限公司，经新乡医学院药学院薛金涛副教授鉴定为槟榔，信息见表1和图1。将200 g槟榔饮片粉碎，过20目筛，按料液比1∶10，用pH 4.0的80%丙酮超声（70 W，60 ºC）提取2次，每次90 min。合并提取液，回收溶剂，减压干燥得浸膏。用500 mL水悬浮浸膏，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对悬浮液进行萃取，将乙酸乙酯提取部位减压干燥获得槟榔酚类提取物，-20 ºC保存备用。

1.2　仪器及试剂

仪器：Agilent 6890Plus型超高效液相色谱仪（UPLC，Agilent公司）；MicrOTOF Q型飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS，Bruke公司）；BSA224S型分析天平（Sartorius公司）；TG16-W型微量高速离心机（长沙维尔康湘鹰离心机有限公司）；KQ3200E型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；Vent Filter MPK01型超纯水仪（Millipore公司）。

试剂：化学对照品儿茶素（批号151013）、表儿茶素（批号16052404）、原花青素B₁（批号16090801）、原花青素B₂（批号16090802）购于成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯级（Sigma-Aldrich公司），水为超纯水，丙酮等其他试剂均为分析纯。

1.3　UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析条件

色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱(4.5 mm×50 mm, 1.8 μm)；流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)；洗脱程序0 min 5% A，10 min 20% A，15 min 95% A，16 min 5% A；流速0.3 mL/min；柱温 30 ºC；进样量5 μL，单个样品运行时间为16 min。

质谱条件：ESI(⁃)，干燥气N₂，温度220 ºC，流速6 L/min；雾化气压241.325 kPa；鞘气温度400 ºC，流速12 L/min；毛细管电压2 500 V；喷嘴电压 0 V；碎裂电压75 V；离子扫描范围m/z 100~1 500；负模式参比离子112.993 3、962.881 3。称取适量样品用5%乙腈超声溶解，于12 000 r/min、常温条件下离心5 min，取上清液。

1.4　对照品溶液制备

精密称取儿茶素、表儿茶素、原花青素B₁和原花青素B₂对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加入50%乙腈-水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度分别为9.2×10²，3.0×10²，1.1×10²，0.3×10² mg/L的对照品溶液。

1.5　供试品溶液的制备

将适量槟榔饮片酚类提取物用50%乙腈-水超声溶解，12 000 r/s离心10 min，取上清液备用。

2　 结果与讨论

2.1　方法的专属性

首先分析混合对照品（图2A），4种主要酚类化合物原花青素B₁（保留时间9.87 min）、儿茶素（10.92 min）、原花青素B₂（12.12 min）、表儿茶素（12.81 min）的基峰色谱图及其结构式见图2。4种酚类化合物分离良好，检测不受基质成分干扰。再采用Agilent SB-C18色谱柱考察样品（HN_150305）槟榔酚类色谱峰的分离效果（图2B）。由于槟榔酚类化合物均带有酚羟基，在流动相中易发生电离而导致拖尾，故在流动相中加入适量挥发性的甲酸以改善峰形和分离效果。样品的色谱图（图2B）表明，Agilent SB-C18色谱柱(4.5 mm×50 mm, 1.8 μm)可使各色谱峰得到较好分离，且峰形对称、尖锐、保留时间较适宜。

负离子扫描模式ESI(-)适用于检测含有多个酚羟基的槟榔酚类化合物，具体结果如图3所示。

本研究还考察了样品溶液制备方法中提取溶剂、次数和时间等因素。实验结果表明，用pH 4.0，80%丙酮水溶液提取2次，每次提取1.5 h，即可将槟榔酚类化合物基本提取完全。经不同极性溶剂分级萃取后，槟榔酚类化合物主要集中在乙酸乙酯萃取物中，与王明月等^[23，25]的研究结果基本一致。

2.2　方法的线性范围

精密量取对照品溶液适量，混合并稀释到一定浓度，再分别逐级配制成7个梯度浓度的对照品溶液，进行色谱分析。以4个对照品的浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，分别得到4种成分的线性回归方程、相关系数r²和线性范围，见表2。

2.3　方法的性能

1） 精密度

将合适浓度的混合对照品溶液重复进样6次，计算得到药材中各酚类化合物色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）在1.4%~2.6%范围内，表明仪器的精密度良好。

2） 重复性

称取同一批次的样品（HN_150305）6份，用本文方法分别测定其中各酚类化合物含量。所测各含量间的RSD在2.4%~4.3%范围内，表明方法的重现性较好。

3） 稳定性

将同一批次的样品（HN_150305）分别于0、2、4、8、12和24 h时进样分析，分别计算各成分含量，其RSD值在2.2%~2.7%范围内，表明样品中的酚类化合物可在24 h内保持稳定。

4） 回收率

精密称取已知含量的同一批次的样品（HN_150305）6份，分别加入4种对照品溶液，按1.5节方法制备供试品溶液，再按1.3节方法进样分析，计算得到各成分的加样回收率在98.27%~102.4%范围内，RSD在1.1%~2.4%范围内。

综合上述结果后，可以确定本方法适用于槟榔酚类化合物的定量分析。

2.4　实际样品分析

将10批槟榔酚类提取物按1.5节方法制备供试品溶液，按1.3节方法进样分析，分别计算各酚类化合物的含量。用SPSS数据分析软件对4种酚类化合物进行邓肯氏新复极差法（DMRT）分析。由表3可知，海南产3批槟榔饮片中4种主要酚类化合物含量的均值最高，原花青素B₁、儿茶素、原花青素B₂和表儿茶素的含量均值分别为2.476±0.090、3.379±0.108、0.108±0.010、0.454±0.015 mg/g，且相对稳定，而中国广东、广西和越南、印度尼西亚产槟榔饮片酚类化合物含量均低于海南，且不同批次4种主要酚类化合物含量的差异较大。

市售槟榔饮片与果仁尚不成型的槟榔嫩果中主要含有的多元酚类物质不完全一致，儿茶素为其共有成分，槟榔饮片中主要含有原花青素B₁、原花青素B₂和表儿茶素，而槟榔嫩果中含有表没食子儿茶素没食子酸酯^[25]。

3　 讨论与结论

本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术对我国市场流通的、不同产地的10批槟榔饮片中的主要酚类化合物进行定量分析，得到如下结论：

1） UPLC-ESI-Q-TOF-MS方法用于考察槟榔中4种主要酚类化合物的含量，精密度、重复性、稳定性和回收率均较好。其中，原花青素B₁与原花青素B₂重复性检验的RSD值偏高（>3.0%），可能与其含量较低有关，但与已有相关文献检测原花青素类化合物重复性结果一致^[27，28]。可见，通过定量分析多种酚类化合物来评价槟榔饮片质量的方法是可行的，可为综合开发槟榔新用途保证用药安全提供有效参考。

2） 海南产3个批次的槟榔饮片中4种酚类化合物含量的均值较高。本实验所用槟榔饮片分别来自中国海南、广东、广西和越南、印度尼西亚两国，产地分布较广泛，所得结果具有一定的代表性。同一产地的药材样本中，考察了存放时间对槟榔中酚类物质含量的影响，使结果更具参考价值和利用度。在对不同批次槟榔饮片中的酚类化合物含量进行比较之后，发现海南产3个批次的槟榔饮片中4种酚类化合物含量的均值高于其他产地的槟榔饮片，且含量相对稳定，为其主要抗氧化成分。中国广东、广西和越南、印度尼西亚产槟榔饮片酚类化合物含量均较低，且不同批次产品中4种主要酚类化合物含量变化较大。

关于槟榔酚类及其他活性成分组成、药理作用以及药动学特征还有待进一步的探究。此外，目前对槟榔除果实外的其他部分研究很少。为了充分利用该植物的药用潜力，实现其更大的价值，有必要在关注槟榔果实的同时，对槟榔叶、花等部位的化学成分和药理作用进行研究。

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基金资助

国家级大学生创新创业训练计划(202210472018)