不同产地金银花初生代谢物化学成分的GC-MS分析

Chemical Composition Analysis of Primary Metabolites of Lonicera japonica Flos from Different Habitats by GC-MS

摘要

利用柱前衍生化气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）结合主成分分析（PCA）以及正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）等方法对不同产地金银花初生代谢物的化学成分进行了比较，并进行代谢通路的富集分析，探讨了不同产地金银花初生代谢物化学成分的差异代谢机制。共确定了28种初生代谢物、10种初生差异代谢物以及3条主要差异代谢通路。结果表明，不同产地金银花的初生代谢物存在明显差异；不同产地金银花的初生差异代谢物在氨酰-tRNA生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径中存在着显著差异。该方法可为快速区分金银花产地提供理论依据。

Abstract

The chemical composition of primary metabolites of Lonicera japonica flos from various producing regions was compared using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) along with principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA). Additionally, metabolic pathway enrichment analysis was conducted to study the differential metabolic mechanisms of primary metabolites of Lonicera japonica flos from different habitats. A total of 28 primary metabolites, including 10 primary differential metabolites and 3 major differential metabolic pathways, were identified. The findings revealed significant variations in the primary metabolites of Lonicera japonica flos from distinct producing areas, particularly in aminoacyl-tRNA biosynthesis, valine, leucine, and isoleucine biosynthesis, as well as glycine, serine, and threonine metabolic pathways. This approach can serve as a basis for efficiently distinguishing the geographical origin of Lonicera japonica flos.

Graphical abstract

关键词

金银花 / 代谢组学 / 初生代谢物 / 柱前衍生化 / 气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）

Key words

Lonicera japonica flos / metabolomics / primary metabolites / pre-column derivatization / gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

0　 引 言

金银花中药材为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，其味甘、性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热的功效，对于热毒疮痈、温热病有较好疗效^[1]，在新冠病毒感染治疗中也发挥了很大作用^[2]。金银花的主要成分包括挥发油、有机酸、黄酮、环烯醚萜苷、三萜及三萜皂苷^[3]等化合物，具有抗病原微生物、解热、抗炎、抗氧化、保肝利胆^[4，5]等药理作用。金银花主要分布于河北、河南和山东等省，但由于地理环境的不同，各地所产金银花在品质与化学成分上有一定差异^[6]，也出现了较多同名异物事件，这极大地影响了金银花中药材的推广使用。

中药往往由多组分体系构成，一般采用代谢组学技术和化学计量学方法对中药样品中的小分子物质进行综合评价，并分析其代谢产物，以客观反映中药化学成分的整体差异。近年来，有关金银花的研究主要集中于其挥发油成分，石雨荷等^[7]采用高效液相色谱法（HPLC）测定了不同产地金银花不同部位的化学成分含量，发现产地和部位不同金银花化学成分含量存在差异。郭慧玲等^[8]采用顶空-气质联用（HS-GCMS）的方法比较了不同产地金银花和山银花挥发性成分差异，发现在数量和含量上均有较大差异。目前，尚未发现金银花初生代谢物的相关报道。

本文利用柱前衍生化气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）并结合主成分分析（PCA）以及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等方法，比较了不同产地金银花初生代谢物以及代谢通路的差异，可望为快速区分金银花产地提供理论依据。

1　 材料与方法

1.1　仪器与材料

仪器：7890-5977B型气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，安捷伦公司）；BSA224S-CW型万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；JP-060S型超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；Milli-Q超纯水仪（Millipore公司）。

试剂：吡啶（批号B1926025，阿拉丁公司）；甲氧胺盐酸盐（批号BCCB8541）、N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺（MSTFA，批号BCCC2821）均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

材料：金银花药材样品购自河北省安国中药材市场，来自河北巨鹿、河南封丘和新密、山东平邑4个产地的金银花样品共计20批，来源信息见表1。其中，为验证河北产地的道地性选用了11批河北巨鹿的药材。经河北中医药大学药学院严玉平教授鉴定，药材为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。样品经冷冻干燥、粉碎后过40目筛，-80 ℃保存。

1.2　方法

1.2.1　分析方法

1） 样品溶液配制。精密称取0.10 g不同产地金银花粉末，加入1 mL提取溶剂甲醇-水-甲酸（体积比70∶28∶2），于25 ℃超声分散15 min，再于13 000 r/min离心10 min。取上清液40 μL于玻璃衍生瓶内，加入20 μL水杨酸（1 mg/mL）作为内标，快速吹干，加入20 μL 40 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液，于30 ℃金属浴90 min，再加入80 μL MSTFA^[9，10]衍生试剂于37 ℃金属浴30 min，再于13 000 r/min离心10 min。取上清液经0.22 μm滤膜过滤，进行GC-MS代谢组学分析。

2） GC-MS分析。色谱条件：Agilent HP-5 MS弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比5∶1；载气为高纯氦气；进样口温度230 ℃；进样量1 μL；从80 ℃以10 ℃/min速率升至200 ℃，再以6 ℃/min速率升至250 ℃，继续以10 ℃/min速率升至310 ℃。质谱条件：电子电离（EI）源，电子能量70 eV，接口温度为280 ℃，扫描范围m/z为50~500，溶剂延迟时间为3 min。

1.2.2　数据处理

使用安捷伦数据分析软件MassHunter Qualitative Analysis Navigator B.08.00软件对GC-MS数据进行归一化分析^[11]。空白样中可能出现由于气相色谱柱或衍生化试剂在高温条件柱子流失造成的谱峰，予以删除。使用Orign 2018软件进行主成分分析（PCA）^[12，13]，判别不同产地金银花初生代谢物之间的差异性。将不同产地样品GC-MS数据中的17个共有峰进行PCA分析，其Q² >0.5，表明PCA模型符合代谢分析要求。进一步运用VIP值将OPLS-DA模型中每一变量对判别分析的贡献值量化，比较不同产地金银花初生代谢产物之间的差异。基于OPLS-DA模型获得的变量重要性投影（VIP）进行评分，根据VIP≥1及P<0.05评分进一步筛选出的代谢物，定义为差异代谢物（significant changed metabolites，SCMs）。当VIP≥1、ANOVA分析的P<0.05时，说明代谢物与生物活性密切相关。根据VIP≥1及P<0.05对不同产地金银花的初生差异代谢物进行定性分析。利用基因组百科全书（KEGG）代谢数据库将鉴定出的差异代谢物进行比对并注释，进行相关代谢通路的分析。

2　 结果与分析

2.1　GC-MS分析

将不同产地的金银花样品进行衍生化和色谱分析，得到金银花化学成分GC-MS总离子流色谱图（略）。经过质谱库（NIST20）检索匹配，得到4个产地28种初生代谢物，具体结果见表2。其中，有17种初生代谢物是4产地所共有的，分别是L-丙氨酸、L-缬氨酸、硅醇、L-脯氨酸、丝氨酸、L-苏氨酸、苹果酸、水杨酸、4-氨基丁酸、柠檬酸、奎宁酸、D-果糖、D-葡萄糖、肌醇、单棕榈酸单甘油酯、蔗糖、单硬脂酸甘油酯。

2.2　差异代谢物的筛选

通过PCA分析得到前2个主成分的累计方差贡献率为59.2%，其中主成分1（L-缬氨酸）占31.4%，主成分2（4-氨基丁酸）占27.8%，表明其可以充分体现出金银花的基本特征。以这2个主成分建立坐标系进行投影结果见图1A，提示不同产地金银花初生代谢物含量存在一定差异性，但是某些产地样品仍有重叠现象，说明PCA分析能够揭示较多的初生代谢物，而不能区分某一特定化合物。为了进一步区分不同产地金银花的初生代谢物，对数据进行了有监督的正交偏最小二乘法判别分析^[14]。如图1B所示，3个产地的金银花样品区分效果较好，累计解释能力参数R²Y与Q²分别为0.836、0.760，提示所建立的模型稳定性和预测能力较好。

筛选单因素方差分析结果VIP≥1及P<0.05的变量，从不同产地金银花样品中筛选出10种初生差异代谢物（图2A），其VIP值由高到低依次为：4-氨基丁酸、L-缬氨酸、柠檬酸、L-丙氨酸、D-果糖、单硬脂酸甘油酯、蔗糖、肌醇、苹果酸、L-苏氨酸。运用统计推断（statistical inference）分析进一步验证模型，图2B为模型置换检测。该模型建立时经过200次置换验证后（P<0.01），R²和Q²的截距值分别为0.368和-0.396，说明模型没有过度拟合，可以较好区分出不同产地金银花。

2.3　差异代谢物分析

如表3所示，从不同产地金银花样品中共筛选出7种初生差异代谢物，分别是L-缬氨酸、乙醇胺、甘氨酸、L-苏氨酸、4-氨基丁酸、D-甘露糖、肌醇半乳糖苷；其中，甘氨酸VIP值最高，说明该代谢物在各产地之间差异显著。

图3为金银花初生差异代谢物定量分析结果，可以看出，除D-甘露糖外，河北产地其余6种初生差异代谢物含量均高于其他地区。整体来看，河北产地金银花的初生差异代谢物含量要高于其他地区，说明不同产地金银花的初生差异代谢物含量也存在区别。

2.4　差异代谢物通路分析

为进一步明确不同产地之间金银花初生代谢物含量的差异，以差异代谢物的相对百分含量作为指标结合KEGG数据库进行富集分析，如图4所示。利用MetaboAnalyst工具进行权重计算，识别出含有差异代谢物匹配度较高的通路共3条（见表4），分别是氨酰-tRNA生物合成，L-缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，甘氨酸、丝氨酸和L-苏氨酸代谢途径；其中，氨酰-tRNA生物合成通路中P值最小，说明结果差异性显著。

3　 讨论与结论

本研究以4个产地20批的金银花作为研究对象，通过GC-MS技术结合多元统计学分析金银花初生代谢物的差异，得到如下结果：

1） 共鉴别出28种初生代谢物，包括有机酸类、糖类、氨基酸类、脂肪酸类等，并筛选得到10种初生差异代谢物，分别是4-氨基丁酸、L-缬氨酸、柠檬酸、L-丙氨酸、D-果糖、单硬脂酸甘油酯、蔗糖、肌醇、苹果酸、L-苏氨酸；4-氨基丁酸的VIP值最高，提示4-氨基丁酸是区别各产地金银花差异性的重要产物。

2） 共得到3条主要差异代谢通路，分别是氨酰-tRNA生物合成，L-缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，甘氨酸、丝氨酸和L-苏氨酸代谢途径。其中，氨酰-tRNA生物合成是形成蛋白质的重要通路，并且参与能量代谢，在蛋白质的生物合成中，氨酰-tRNA作为氨基酸转移到肽链的羧末端过程的中间物而发挥重要的作用^[15]；在L-缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成中L-缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸是支链氨基酸；甘氨酸、丝氨酸和L-苏氨酸代谢通路中苏氨酸蛋白激酶在植物细胞中参与糖代谢、细胞生长、基因遗传等^[16，17]等代谢活动，所以在金银花初生差异代谢通路中，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路受影响程度最高。

3） 氨酰-tRNA生物合成通路是影响金银花代谢差异的主要途径。由于不同产区对差异代谢通路中初生差异代谢物的表达不同，河北产区的初生差异代谢物表达较多且含量较高，这一结果为河北作为金银花道地产区提供佐证。

本文研究发现，河北产区初生差异代谢物含量高于河南、山东两产地，表明不同产地金银花的品质与含量存在差异，通过初生差异代谢物分析能够较好地区分金银花样品的产地。该研究结果可望为区分不同产地的金银花提供理论依据。

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基金资助

河北省重点研发计划(19276414D)

河北省中医药管理局项目(2019075)

河北省现代农业产业技术体系中药材创新团队(HBCT2018060205)

河北中医学院大学生创新创业训练计划(202014432036)