黄连花薹及其生物碱的急性与亚急性毒性研究

Acute and Sub-Acute Oral Toxicities of Coptis chinensis Inflorescence and Its Alkaloids Mixture

摘要

为调查黄连花薹作为可食用资源的安全性，开展了黄连花薹及其主要生物碱的急性毒性和亚急性毒性试验。在急性毒性试验中，用20 000 mg/kg黄连花薹提取物和743.2 mg/kg生物碱混合物分别灌胃KM小鼠，14 d内未发现任何毒性反应且无动物死亡现象。在亚急性毒性试验中，以500、1 000、2 000 mg/kg 3个剂量的黄连花薹提取物及37.16 mg/kg的生物碱混合物分别灌胃SD大鼠28 d，对照组和各处理组的动物体重和器官相对质量没有显著性差异，生化、血液和尿液指标检查均在正常范围内，主要脏器无病变，而且未观察到动物死亡现象。上述实验结果证明了黄连花薹作为药食同源原料的安全性。

Abstract

In order to study the safety of Coptis chinensis inflorescence as an edible raw material, the acute and sub-acute oral toxicities of C. chinensis inflorescence extract (CE) and its main alkaloids (MIX) were tested. KM mice were orally administered with 20 000 mg/kg CE or 743.2 mg/kg MIX for 14 days, and no toxicity or mortality was observed. SD rats were orally administered with three different doses of CE (500, 1 000, 2 000 mg/kg) and the alkaloids mixture (37.16 mg/kg) for 28 days. There was no significant difference detected in animal weight and organ relative weight between the control group and the treatment groups. The serum biochemical, hematological and urine parameters of all groups were examined and found to be within the normal ranges. Finally, the main organs did not present any histopathological lesions, and no animal death was observed. Based on these results, the safety of C. chinensis inflorescence as a medicinal and food homologous raw material can be ensured.

Graphical abstract

关键词

黄连花薹 / 药食同源 / 生物碱 / 急性毒性 / 亚急性毒性

Key words

Coptis chinensis inflorescence / medicine and food homology / alkaloid / acute toxicity / sub-acute toxicity

0　 引 言

黄连（Coptis chinensis Franch.）是一种传统药用植物，其药用部位为根茎，其他部位如花薹、茎叶和须根通常作为副产物被废弃，造成了严重的资源浪费^[1]。根据“可持续发展”理念，中药资源的利用应遵循充分、合理、节约、高效的原则，挖掘中药材副产物利用价值，以实现药用植物资源的可持续利用。我国土家族、苗族等少数民族长期保留着将黄连花薹作为茶饮的习俗。黄连花薹抗氧化、抗辐射、降糖、降脂、润肠、解热等功效近年来陆续被报道^[2~6]，但黄连花薹作为茶饮的安全性尚未得到系统研究。

本课题组前期已证实，黄连药材中所含的异喹啉类生物碱也是黄连花薹的主要功效成分，而该类生物碱具有一定的毒性，因此公众对于黄连花薹作为茶饮是否安全存在一些疑虑^[7~9]。《中华人民共和国药典（2020年版）》对黄连饮片的使用作出明确规定：日使用量须严格控制在2~5 g ^[10]。黄连花薹中也含有与黄连饮片相似的异喹啉类生物碱，含量虽然低很多，但作为日常茶饮是否安全亟待全面评估。本研究拟从急性毒性和亚急性毒性两个方面对黄连花薹的安全性进行研究，希望为全面评估黄连花薹食用安全提供依据，进而推动黄连花薹系列产品的开发和黄连药材副产物资源的合理利用。

1　 材料与方法

1.1　仪器

电子天平（SE402F型，上海奥豪斯仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE-52AA型，郑州长城科工贸有限公司）；低速离心机（SC-3610型，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；全自动生化分析仪（AU5400型，Beckman-Coulter公司）；全自动血液分析仪（LH750型，Beckman-Coulter公司）；全自动尿液分析仪（PU-15型，希森美康公司）；荧光倒置显微镜（Ti-E型，Nikon公司）。

1.2　药物与试剂

黄连花薹采自湖北恩施州利川市建南镇箭竹溪村（108°34′25″E，30°22′41″N），阴干样本由武汉大学药学院王有为教授鉴定为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch.）的干燥花薹，凭证标本保存于武汉大学药学院中药标本馆，凭证标本号584。样品经粉碎后过二号药典筛，保存。对照品盐酸巴马汀（批号110732-200907）、盐酸小檗碱（批号110713-201212）和盐酸药根碱（批号110733-201108）购自中国食品药品检定研究院；盐酸黄连碱（批号20120821）和盐酸表小檗碱（批号20120225）购自上海源叶生物科技有限公司；非洲防己碱（批号130704）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。其他试剂购自国药试剂有限公司。

1.3　受试物的制备

称取200 g黄连花薹粉末，用70%乙醇浸提24 h，料液比1∶10。提取液过滤，旋转蒸发除去乙醇，再冷冻干燥，得到黄连花薹提取物（CE），于4 ℃储存。

生物碱混合物（MIX）：参照本课题组前期工作^[7]，将CE中6种生物碱按如下比例混合：11.68%药根碱，7.88%非洲防己碱，8.75%表小檗碱，4.55%黄连碱，5.62%巴马汀，和61.52%小檗碱，即得MIX，于4 ℃储存。

1.4　实验动物

40只SPF级KM小鼠（20±2 g）及50只SPF级SD大鼠（200±20 g），雌雄各半，购自武汉大学动物实验中心，许可证号SCXK（鄂）2008-0004。适应性喂养2 d，喂养条件12 h/12 h明暗周期，温度25±2 ℃，相对湿度30%~60%。本研究得到武汉大学实验动物伦理委员会的批准。

1.5　方法

1.5.1　急性毒性试验

急性毒性试验实施方法参照经济合作与发展组织（OECD）跨国公司指南423^[11]和《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则（2020年版）》^[12]。40只KM小鼠（雌雄各半）用于急性毒性试验。分别按照CE 20 000 mg/kg和MIX 743.2 mg/kg（与20 000 mg CE含6种生物碱总量相等）的剂量分别灌胃，前24 h内密切观察小鼠的毒性症状及死亡情况，每天记录1次体重及日常活动状态，持续14 d，在第15 d将所有动物麻醉处死，取心、肺、脾、肝、肾、睾丸或卵巢等器官观察毒性征兆。

1.5.2　亚急性毒性试验

将50只SD大鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。按照OECD指南407规定^[11]实施亚急性毒性试验。其中，Group Ⅰ（空白组）：蒸馏水；Group Ⅱ（CE高剂量组）：2 000 mg/kg 黄连花薹提取物；Group Ⅲ（CE中剂量组）：1 000 mg/kg 黄连花薹提取物；Group Ⅳ（CE低剂量组）：500 mg/kg 黄连花薹提取物；Group Ⅴ（MIX组）：37.16 mg/kg 生物碱混合物（与1 000 mg CE含6种生物碱总量相等）。以上各组每日单次灌胃，实验周期为28 d，每天观察大鼠毒性反应，每周记录1次大鼠体重，于第29 d颈椎脱臼处死大鼠，取肝、肺、肾、肾上腺、脾、大脑、心脏、胃、卵巢、睾丸和附睾，分别称质量，并计算器官相对质量：

器官相对质量=器官质量/体重×100%

用全自动生化分析仪检测血清生化指标：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酸酐（CR）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）含量、钠离子浓度（Na）和钾离子浓度（K）。用全自动血液分析仪检测以下血液学指标：血细胞比容（HCT）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、嗜中性粒细胞（NEUT）、淋巴细胞（LYMPH）、单核细胞（MONO）、嗜酸性粒细胞（EO）、嗜碱性粒细胞（BASO）和血小板（PLT）数量。用全自动尿液分析仪检测大鼠尿液的颜色、葡萄糖（GLU）含量、pH值（pH）和白细胞（WBC）数量。

上述所有取出的脏器均用冰生理盐水漂洗，并用10% 福尔马林固定，使用苏木精-伊红染色法（HE）染色，进行病理学检查。

1.6　数据处理

实验数据以“平均值±标准偏差”表示，使用IBM SPSS 20.0统计软件进行One-way-ANOVA中的LSD（least significant difference）多重比较检验。P<0.05，表示差异显著，具有统计学意义。

2　 结 果

2.1　CE和MIX的急性毒性

经受试物处理后，小鼠出现短暂的兴奋现象，主要表现为跳跃及呼吸加快，6 h后，所有小鼠恢复正常活动。实验期间，20 000 mg/kg CE和743.2 mg/kg MIX处理均未导致小鼠死亡。如图1A所示，经CE灌胃后，雄性小鼠14 d内体重由21.5±0.77 g增加至32.88±2.74 g，雌性小鼠的体重由21.47±0.87 g增加至30.07±1.85 g。如图1B所示，经MIX灌胃后，雄性小鼠14 d内体重由22.25±1.11 g增加至31.76±1.88 g，雌性小鼠的体重由21.08±1.08 g增加至26.38±1.32 g。处死后，小鼠主要器官的大小和颜色无肉眼可见病变或异常。

2.2　CE和MIX的亚急性毒性

2.2.1　宏观毒性现象

实验期间，各组大鼠均保持健康，未出现大鼠死亡现象，也未出现如毛发脱落、粪便异常等毒性症状，只有很少大鼠在受试物处理后的前5 d，与其他大鼠相比尿液偏黄。

2.2.2　对体重的影响

如图2所示，每周不同组别大鼠之间体重无显著性差异（P>0.05）。28 d后将各组大鼠平均体重减除第1 d平均体重，按Group Ⅰ~Group Ⅴ顺序，雌性大鼠平均增重分别为 44.2±11.8、34.2±19.7、33.8±19.7、37.2±7.0、39.4±8.9 g；雄性大鼠平均增重分别为 88.4±18.7、46.6±13.3、68.2±18.0、56.6±9.0、88.0±12.4 g。

2.2.3　对器官相对质量的影响

不同剂量CE和MIX处理后大鼠各脏器的相对质量如表1所示。Group Ⅱ雌性大鼠的肝相对质量大于其他组，但无显著不同(P>0.05)。其他处理组与正常组相比亦无异常。

2.2.4　对血清生化指标的影响

各组大鼠的血清生化指标如表2所示，对于雌性大鼠，空白组与各处理组的肝功能指标（AST，ALT，TBIL）、TP、ABL、GLU、肾功能指标（BUN、CR）、TC和K无显著性差异；但Group Ⅲ与空白组相比，TG降低了35.57%（P<0.05），Group Ⅳ与空白组相比，钠离子浓度下降明显（P<0.05）。对于雄性大鼠，也有相似的现象：各处理组与空白组之间绝大部分血清生化指标均无显著性差异，仅Group Ⅱ钠离子浓度低于空白组（P<0.05），但并未超出大鼠血清钠离子浓度的正常范围（140~153 mmol/L）^[13]。

2.2.5　对血液指标的影响

各组大鼠的血液指标如表3所示。对于雌性大鼠，空白组与处理组的HCT、MCHC、RBC、NEWT、MONO、EO、BASO、PLT指标无显著性差异；虽然Group Ⅳ淋巴细胞数量（LYMPH）明显高于空白组，Group Ⅱ白细胞（WBC）水平也明显高于空白组，但都在正常范围内^[13]。各处理组雄性大鼠血液指标与空白组相比均无显著性差异（P>0.05）。

2.2.6　对尿液检测指标的影响

各组大鼠的尿液检测指标如表4所示。5组大鼠尿液颜色均为淡黄色，没有肉眼可见的差别。尿液中的GLU和WBC指标均显示为阴性。此外，pH值范围为7.25±0.35~8.25±0.35，均在正常范围，且无显著性差异（P>0.05）。

2.2.7　主要器官的病理学检查

各组大鼠的病理学检查结果如图3所示。与空白组比较，处理组的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏和大脑组织的HE染色病理切片未观察到病理变化和异常。

3　 讨论与结论

天然产物作为药物替代品，越来越多地应用于疾病的预防和治疗中，并受到广泛的关注。但由于缺乏安全性评价，导致一些天然产物的开发及应用受到限制。尽管目前有一些关于黄连花薹药理活性的报道，且已在民间习用多年，但是只有在黄连花薹的安全性得到充分保证的情况下，其应用和市场才可能不断扩大。据报道^[14]，黄连花薹的急性毒性试验、Ames实验、小鼠精子畸形实验、骨髓微核实验及90 d喂养实验均显示其毒性等级为无毒级。在急毒实验中，黄连花薹的半数致死量LD₅₀≥21 500 mg/kg。在遗传毒性实验中，黄连花薹未显示出染色体畸变及精子畸变。黄连花薹混入饲料喂养90 d实验显示，动物的整体情况及血液生化指标均无异常现象。上述研究初步证实了黄连花薹的安全性，但作为市售代茶饮产品，仍需要有资质的机构对其毒性进行更全面的研究和评估。

1） CE和MIX的急性毒性试验结果证明了大剂量顿服黄连花薹是安全的。根据《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则（2020年版）》，若受试物剂量高于5 000 mg/kg而未导致实验动物死亡，表明其毒性极低，可认定为相对无毒，允许进入下一阶段毒理学实验。本研究急性毒性试验中使用的黄连花薹提取物剂量最高为20 000 mg/kg，未导致实验动物死亡，表明其是安全的。在灌胃后最初6 h中，一些小鼠表现出兴奋，推测是由于黄连花薹所含生物碱导致。生物碱可能使中枢神经系统兴奋，从而控制小鼠的身体活动^[15]。

2） 以低、中、高3个不同剂量的CE以及相当于中剂量CE所含6种生物碱总量灌胃28 d验证了连续口服黄连花薹的安全性。本实验中，以500、1 000、2 000 mg/kg 剂量的CE 和 37.16 mg/kg剂量的MIX给SD大鼠灌胃28 d，均未出现动物死亡现象及毒性征兆。在体重上，CE处理组较对照组有所下降，但无显著性差异，推测可能与黄连花薹的降脂活性有关^[5]。相对器官质量是用来评价器官是否受损的一个重要指标^[16]。在器官相对质量上，处理组未导致肉眼可见的改变，且无显著性差异。在组织病理学分析中，心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏和大脑的切片均没有显示出任何毒性征兆。由此可以基本断定，CE和MIX在设定剂量下对实验动物主要器官不造成伤害。

3） 通过测试血清生化指标、血液指标和尿液指标进一步印证了连续口服黄连花薹的安全性。生化指标主要反映受试物对血液及循环系统的影响或毒性^[17]。ALT和AST是两个主要的肝功能指标，用来评估是否发生肝损伤^[18]。AST是主要的线粒体酶，分布在各个组织中，主要用于评估线粒体损伤。TBIL主要用来诊断肝胆疾病。从本文生化指标检测结果可以看出，CE和MIX未引起实验动物肝脏超负荷。2 000 mg/kg处理组雌性大鼠的平均TG显著下降，推测CE可能具有一定的减肥作用，这还需要更多的实验证据。其他生化指标检测结果也证明，CE和MIX对大鼠的生化代谢未产生明显毒性作用。血液学指标可以反映受试物对实验动物生理和病理的影响或毒性^[19]。本研究中，绝大多数参数没有发生任何毒性变化。虽然Group Ⅱ雌性大鼠的WBC值和Group Ⅳ的LYMPH值与空白组相比显著增加，但均未超出正常范围^[20]。尿液检测指标可评价受试物对泌尿系统和循环系统的影响^[21]。GLU和pH值通常用来评估糖尿病的程度；WBC异常可能反映泌尿系统感染。本研究中，空白组和处理组的相关数据均无显著性差异，因此推断CE和MIX对泌尿系统和循环系统并无影响。

综上所述，20 000 mg/kg剂量CE和743.2 mg/kg剂量MIX未造成小鼠死亡及器官病变；500、1 000、2 000 mg/kg剂量CE和37.16 mg/kg剂量MIX对大鼠体重、生化、血液、尿液指标和病理学切片结果的影响均在正常范围内。因此，可以初步确定黄连花薹作为药食同源原料的安全性，这为进一步开发黄连花薹保健食品和其他高附加值产品提供了科学依据。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金(82004017)

湖北省自然科学基金面上项目(2023AFB670)