蜗牛酶对酸枣叶醇提物生物活性的影响

Effect of Snailase on the Bioactivity of Ethanol Extracts from Ziziphus jujuba var. spinosa Leaves

摘要

采用蜗牛酶对酸枣叶醇提物进行酶解，比较了酶解前后样品的体内外活性差异，并结合超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行成分分析，以揭示蜗牛酶对酸枣叶醇提物生物活性的影响。结果显示，酶解后的酸枣叶醇提物在体内外均具有更好的抗氧化活性，且神经保护作用显著。蜗牛酶主要影响了酸枣叶中黄酮、有机酸、苯丙素、糖类等化合物的含量；酸枣叶醇提物的生物活性与黄酮苷元、二羟基苯甲酸、简单苯丙素、糖酸等化合物的含量呈正相关。据此推测，蜗牛酶通过断裂酸枣叶中化合物的糖苷键增加有效活性成分含量，从而提高其生物活性。

Abstract

The enzymatic hydrolysis of the ethanol extracts from Ziziphus jujuba var. spinosa leaves was carried out by snailase. In order to reveal the effect of snailase on the biological activity of the extracts, the differences of in vitro and in vivo activities of the samples before and after enzymatic hydrolysis were compared. And the composition changes were analyzed by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS). The results showed that the enzymatic hydrolyzed ethanol extracts of Ziziphus jujuba var. spinosa leaves had better antioxidant activity both in vitro and in vivo, and had significant neuroprotective effect. UPLC-MS analysis and Spearman correlation analysis showed that enzymatic hydrolysis mainly affected the content of flavonoids, organic acids, phenylpropanes, carbohydrates and other compounds. The biological activity was positively correlated with the content of flavonoid aglycones, dihydroxybenzoic acid, simple phenylpropanoids and saccharic acid. It is speculated that snailase can increase the content of active ingredients by breaking the glucoside bonds of compounds in Ziziphus jujuba var. spinosa leaves, so as to improve the biological activity.

Graphical abstract

关键词

酸枣叶 / 酶解 / 抗氧化活性 / 神经保护

Key words

Ziziphus jujuba var. spinosa leaves / enzymatic hydrolysis / antioxidant activity / neuroprotection

0　 引 言

酸枣叶是鼠李科植物酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）的干燥叶，俗称棘叶，具有抗菌、抗炎、保护肝脏、镇静安神等功效^[1]。酸枣叶作为酸枣仁及果肉加工过程的重要副产品，常因缺乏有效利用而被浪费。因此，研究酸枣叶的综合开发及利用，是发展酸枣产业的有效切入点之一。酶解（enzymatic hydrolysis）是一种高效的生物转化方法，具有选择性高、温和、稳定等特点，广泛应用于化学结构的修饰，是提升天然产物利用率及利用价值的有效方法^[2]。蜗牛酶（snailase）是一种从蜗牛嗉囊或消化道中提取的混合酶，包含纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种生物酶^[3]，能够高效裂解细胞壁，被广泛应用于实验研究及工业生产^[4]。蜗牛酶所包含的β-葡萄糖苷水解酶对β-葡萄糖苷底物特异性较高，能够水解糖苷类化合物的糖苷键，实现去糖基化，从而提升化合物的生物活性及吸收效率^[5]，被广泛应用于植物苷元^[6]、多糖^[7]、稀有皂苷^[8]的提取转化。

酸枣叶中富含黄酮、多糖和皂苷等糖苷类化合物^[9]。为了提高酸枣叶资源的生物利用率，本研究将考察蜗牛酶对酸枣叶醇提物体内外生物活性及化学成分的影响，希望为酸枣叶的高效开发及利用提供参考。

1　 材料与方法

1.1　材料、试剂及仪器

材料：酸枣叶购自河北国金太行中医药公司，经河北省农林科学院药用植物研究中心谢晓亮研究员鉴定为鼠李科枣属植物酸枣（Ziziphus jujuba var. Spinosa）的干燥叶，标本保藏于河北省农林科学院蔬菜与药用植物中心实验室（标本号20211028）；秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称秀丽线虫，包括野生型N2、疾病模型HA759）和大肠杆菌（Escherichia coli，包括OP50和NA22）均购自美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传中心。

试剂：蜗牛酶（批号S8280，纯度98%）购自北京索莱宝公司；二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，纯度≥97%）购自Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，纯度≥97%）、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、氯化钠、双乙酰、百草枯均为分析纯，购自国药集团；异氟烷购自EZVET公司；甲醇、甲酸、醋酸铵均为色谱纯，购自Thermo Fisher公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、总SOD活性检测试剂盒（WST-8法）、活性氧检测试剂盒、ATP检测试剂盒均购自碧云天生物技术公司；实验用水为超纯水。

仪器：B-510LD4型荧光倒置显微镜（OPTIKA公司）、SpectraMax iD5型多功能酶标仪（Molecular Devices公司）、2L5V177202型紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher公司）、Vanquish^TM UHPLC型色谱仪（UHPLC，Thermo Fisher公司）、Q Exactive^TM HF-X型质谱仪（MS，Thermo Fisher公司）、FDS-2000型真空冷冻干燥机（EYELA公司）。

1.2　方法

1.2.1　酸枣叶醇提物的制备及酶解

将酸枣叶粉碎，过2号筛。取粉末100 g，加入70%乙醇溶液1 000 mL，加热回流提取3次，每次2 h。合并提取液，于45 °C减压浓缩至100 mL，浓缩液经D101大孔吸附树脂吸附，洗脱。收集70%乙醇部位洗脱液，减压浓缩后，经真空冷冻干燥，得到酸枣叶醇提物共计3.72 g。

称取上述酸枣叶醇提物样品1.0 g，蜗牛酶0.2 g，置于锥形瓶中，加入蒸馏水20 mL，摇匀，滴加0.1 mol/L冰乙酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值为5.0。将锥形瓶置于摇床中，于37 °C、120 r/min酶解处理。到达预设时间后，取出锥形瓶，于100 °C水浴加热10 min，灭活蜗牛酶，终止酶解，离心，上清液为不同处理时间的酶解后样品，于4 ℃保存。以不添加蜗牛酶的酸枣叶醇提物平行处理，作为酶解前样品对照。

1.2.2　体外抗氧化活性测定

1） 总还原力测定。参考文献方法^[10]，取上述酶解前和酶解后样品（母液以50 mg/mL计），加水稀释成浓度为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的样品溶液，各取1 mL于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液及1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀，于55 ℃水浴加热20 min，再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，3 000 r/min离心5 min，取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2 mL和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混匀，室温静置10 min，于700 nm波长处测其吸光度，考察总还原力：

\mathrm{\Delta }A=A-A_{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}}（1）

式中：A为样品组吸光度；A_{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}}为蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。

2） DPPH^•清除能力测定。参考文献方法^[11]，取上述酶解前和酶解后样品加入95%乙醇溶液稀释成浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的样品溶液，各取100 μL于96孔板中，加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液，每个样品浓度设置3个重复，摇匀，避光反应30 min，于517 nm处测其吸光度，计算DPPH^•清除率：

\mathrm{清除}\mathrm{率}=[\mathrm{1}-(A-A_{\mathrm{1}})÷A_{\mathrm{E}\mathrm{t}\mathrm{O}\mathrm{H}}]\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

式中：A为样品组吸光度；A₁为95%乙醇替代DPPH溶液的对照组吸光度；A_EtOH为95%乙醇替代样品溶液的空白组吸光度

1.2.3　体内抗氧化活性测定

1） 秀丽线虫食物清除率检测。参照Zhang等的方法^[12]，将同步化处理的L1期秀丽线虫N2、大肠杆菌NA22以及不同浓度的样品溶液加入96孔板中（虫15~20条/孔、总液体100 μL/孔、10孔/实验组，NA22初始光密度OD_{570 nm}≈0.8），于20 ºC恒温培养。将上板时间定为第1天，之后于每天相同时刻，测定各孔大肠杆菌在570 nm的光密度，连续测定7 d，得到食物清除率曲线。

2） 秀丽线虫体内活性氧（ROS）水平检测。参照Zhang等的DCFH-DA探针法^[12]测定。将同步化处理的L1期秀丽线虫N2加入24孔板中（虫500条/孔、总液体700 μL/孔、3孔/实验组，NA22初始光密度OD_{570 nm}≈0.8）。实验设置空白对照组、百草枯氧化胁迫模型组和百草枯造模与药物共处理组3种处理方式。其中，药物处理组的给药浓度以食物清除率结果为基础，选取高、中、低3个浓度，空白对照组和模型组以等体积的S medium液体培养基（秀丽线虫的液体培养基）代替药物上板，于20 ºC培养2 d，除空白对照组外，其他各组分别加入10 μL百草枯溶液（终浓度10 mmol/L）进行氧化胁迫造模，于20 ℃继续培养24 h。收集秀丽线虫，清洗以除去残留的样品、NA22和造模试剂，加入组织裂解液，冰上匀浆2 min，4 ℃，5 000 r/min离心10 min，上清液为秀丽线虫裂解液，置于冰上保存待测。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒和ROS检测试剂盒分别测定上述裂解液的蛋白质浓度和ROS水平。测定ROS水平时，DCFH-DA探针的终浓度为100 μmol/L，荧光酶标仪检测条件为激发波长485 nm、检测波长538 nm，以探针孵育60 min的样品荧光值进行比较，ROS水平以每mg裂解液蛋白的相对荧光值表示。

3） 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测。秀丽线虫的给药处理及线虫裂解液的制备方法同ROS检测。采用WST-8显色法，按检测试剂盒方法测定SOD活性，并根据BCA蛋白定量结果，换算为每mg裂解液蛋白的SOD酶活力。

4） 三磷酸腺苷（ATP）含量检测。秀丽线虫的给药处理及线虫裂解液的制备方法同ROS检测。按检测试剂盒方法测定ATP含量，结果换算为每mg裂解液蛋白的ATP含量。

1.2.4　神经保护活性测定

1） 秀丽线虫HA759神经元存活实验。参照Wang等的方法^[13]，采用24孔板对同步化的L1期秀丽线虫HA759上板给药（方法同ROS检测）。20 ℃恒温培养箱中给药处理60 h后，收集秀丽线虫，转移至2%的琼脂糖垫上，经异氟烷麻醉后，加盖盖玻片，于荧光显微镜下观察秀丽线虫咽部两侧与ASH（amphid sensory neuron of the head）神经元共表达的GFP（green fluorescent protein）荧光点数目，每个实验组观察50条。琼脂糖垫制作方法为：称取2 g琼脂糖，加入100 mL S medium溶液，用微波炉加热溶解后，滴于载玻片上，使用玻璃板压制成1 mm厚度在薄垫即可。

2） 秀丽线虫HA759避化行为实验。参照Zhang等的方法^[12]，提前准备测试平板：取30 µL 8 mol/L高渗甘油溶液将9 cm秀丽线虫固体培养板（NGM板不涂菌）均分为正常侧（N）和引诱剂侧（T）两个区域。将收集的HA759线虫（给药处理方法同神经元存活实验）约200条均匀滴加在N侧区域中间，待其适应1 min后，于T区域距平板边缘1 cm位置滴加2 μL引诱剂双乙酰溶液，盖上平板盖，转移测试平板至23 ℃恒温培养1.5 h，取出，在显微镜下统计两侧区域的秀丽线虫数量，计算避化率：

\mathrm{避化}\mathrm{率}=\frac{N}{T+N}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（3）

式中：N为测试平板N侧秀丽线虫数量；T为测试平板T侧秀丽线虫数量。

1.3　UPLC-MS分析

1.3.1　样品前处理

取待测样品100 μL，加入400 μL甲醇溶液，涡旋振荡，冰浴静置5 min后，离心，收集上清液，过0.22 μm微孔滤膜后，用于UPLC-MS分析。每个待测样品取6份平行样品进行测定。其中，质控样本（QC）为各测试样品的等比例混合物；空白对照样本（Blank）为80%甲醇水溶液。

1.3.2　测定条件

色谱条件：Hypesil Gold C18 column色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm），以甲醇（A）-醋酸铵（5 mmol/L，pH 9.0，B）为流动相进行梯度洗脱（0~3 min，2% A；3~10 min，2%~85% A；10~12 min，85%~2% A），流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样量6 μL。

质谱条件：采用四级杆-轨道肼混合型质量检测器，电喷雾离子源（ESI），负离子扫描模式，喷雾电压-3.5 kV，鞘气流速35 psi（1 psi=6 894.76 Pa），辅助气流速10 L/min，离子传输管温度320 ℃，离子导入射频电压60 V，辅助气加热器温度350 ℃，质谱扫描范围m/z 100~1 500，监测方式为Full MS/ddMS²模式。

1.3.3　数据预处理和化合物鉴定

将下机数据（.raw）文件导入Compound Discoverer 3.1搜库软件，基于Linux操作系统（CentOS版本6.6）以及软件R和Python进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理；再整合目标离子，通过分子离子峰和碎片离子峰进行分子式的预测，并与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对；用Blank样本去除背景离子，并对原始定量结果进行标准化处理，最后得到化合物的鉴定和相对定量结果。

1.4　数据分析

活性检测数据采用Graphpad prism 8.0软件进行统计学处理，实验结果以mean±SEM形式表示，one-way ANOVA分析和邓尼特多重比较检验（Dunnett’s multiple comparisons test）比较实验组和对照组的差异性，P<0.05被认为具有显著性差异。利用SIMCA-P14.0软件对成分分析中鉴定到的化合物进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），进而得到变量重要性投影（variableimportance in projection，VIP）值。通过t检验计算各化合物的差异显著性P值，并计算化合物在两组间的差异倍数（fold change，FC），以VIP≥1、P<0.05且|log₂FC|>1为标准，进行差异化合物筛选。采用Origin 2024软件进行差异化合物火山图的绘制及Spearman相关性分析。

2　 结果与分析

2.1　蜗牛酶对酸枣叶醇提物体外抗氧化活性的影响

酶解前后酸枣叶醇提物的体外总还原力和DPPH^•清除率结果如图1所示。在检测浓度范围内，总还原力和自由基清除率均随待测样品浓度的升高而增强。与酶解前样品相比，蜗牛酶酶解处理组样品的总还原力和DPPH^•清除率随酶解时间的延长呈现先升高后降低的趋势，其中酶解72 h的样品表现出最强的体外总还原力和DPPH^•清除能力，即具备最好的体外抗氧化活性。该结果表明蜗牛酶具有增强酸枣叶醇提物体外抗氧化活性的潜力，且在酶解72 h时达到最强。因此，后续体内活性检测实验选用酶解72 h的样品进行测试。

2.2　蜗牛酶对酸枣叶醇提物体内抗氧化活性的影响

2.2.1　秀丽线虫体内活性实验的给药浓度

秀丽线虫培养基中大肠杆菌的消耗速率间接反映药物处理对秀丽线虫生长发育的影响，因此，本研究首先通过食物清除率实验，确定酸枣叶醇提物进行秀丽线虫N2体内活性检测的安全给药浓度。如图2所示，与空白对照组（给药0.0 mg/mL）相比，酶解前及酶解后的样品给药浓度≥2.0 mg/mL时，均抑制了秀丽线虫培养基中大肠杆菌含量（用OD_{570 nm}表示）的降低速率，表明上述给药浓度对秀丽线虫的生长发育产生了影响。因此，后续秀丽线虫相关实验的给药浓度将控制在2.0 mg/mL以内。

2.2.2　酸枣叶醇提物对秀丽线虫体内ROS水平的影响

ROS是机体代谢的天然副产物，在机体正常的情况下其生成与清除处于平衡状态，在受到外界刺激时ROS过量生成会导致氧化应激，并损伤细胞功能。使用外源性抗氧化剂清除过量的ROS，有助于缓解氧化应激，因此ROS清除能力可以反映外源性抗氧化剂的体内抗氧化活性。本实验使用百草枯溶液对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，以DCFH-DA探针法测定秀丽线虫体内ROS水平。如图3所示，与空白对照组相比，模型组秀丽线虫体内ROS水平显著升高（P<0.01），表明氧化胁迫造模成功；与模型组相比，不同给药浓度下，酶解前和酶解后的酸枣叶醇提物均可降低秀丽线虫体内的ROS水平，且酶解后的样品表现出更显著的ROS清除活性。这说明蜗牛酶处理具有增强酸枣叶醇提物体内抗氧化活性的潜力。

2.2.3　酸枣叶醇提物对秀丽线虫体内抗氧化酶活性及线粒体功能的影响

SOD是一种抗氧化酶，对维持ROS的体内平衡起着关键调节作用。线粒体是ROS的主要来源，过量的ROS会引起线粒体氧化损伤与功能异常，恢复线粒体功能有助于抑制ROS的过量产生。为了探究酸枣叶醇提物的ROS清除活性与抗氧化酶的激活及线粒体功能恢复的相关性，测定了酶解前后酸枣叶醇提物对秀丽线虫体内SOD酶活性及线粒体ATP含量的影响。如图4所示，与空白对照组相比，百草枯造模组中SOD酶活力、线粒体ATP含量均呈现下降趋势。当给以药物处理后，与模型组相比，酶解前和酶解后的酸枣叶醇提物均可提高SOD酶活力，且酶解后的样品的增强作用更加显著（P<0.000 1）。同样，ATP含量检测结果也表明，相较于模型组，酶解后的样品可显著增加秀丽线虫体内ATP含量（P<0.05），表现出更好的线粒体功能恢复活性。上述结果与酶解后表现出更好的ROS清除活性结果相一致。因此我们推测，蜗牛酶酶解对酸枣叶醇提物体内抗氧化活性的增强作用应该与其激活抗氧化酶活性和恢复线粒体功能相关。

2.3　蜗牛酶对酸枣叶醇提物神经保护活性的影响

亨廷顿病（Huntington disease，HD）模型线虫HA759的致病蛋白特异性表达在头部ASH神经元中，伴随着致病蛋白的表达和聚集，逐渐积累的蛋白聚集毒性会导致神经元的损伤或死亡，同时丢失与ASH神经元共表达的荧光标记性状及相应的神经功能。通过荧光点的有无及个数可以间接判断ASH神经元的存活率。正常情况下，荧光显微镜下可观察到HA759头部2个清晰的荧光点，当ASH神经元损伤或死亡时，秀丽线虫头部的GFP荧光点从2个变为1个或0个。观察蜗牛酶酶解前后样品处理的HA759线虫（图5a）可以初步判断，蜗牛酶酶解处理能够增强酸枣叶醇提物的ASH神经元保护活性。为了验证该结果，进一步检测了酶解前后酸枣叶醇提物对秀丽线虫HA759避化行为（avoidance）的影响。ASH神经元属于化学感知神经元，调控着秀丽线虫对高渗溶液的回避行为，当ASH神经元损伤后，秀丽线虫将在引诱剂的诱导下跨越高渗甘油溶液区。通过计算HA759线虫对高渗溶液的避化率可以判断酶解对ASH神经元的保护活性。如图5(b)所示，与空白对照组相比，不论酶解前还是酶解后，酸枣叶醇提物均可增强HA759线虫的避化率，表现出对ASH神经元的保护活性，且酶解后的样品神经保护活性更为显著（P<0.01）。该结果与抗氧化活性结果相一致，表明蜗牛酶酶解确实有助于增强酸枣叶醇提物的生物活性。

2.4　蜗牛酶对酸枣叶醇提物化学成分的影响

为明确蜗牛酶提升酸枣叶醇提物生物活性的物质基础，采用UPLC-MS技术结合多元统计分析法对酶解前后酸枣叶醇提物的化学成分进行表征与差异分析。

2.4.1　UPLC-MS数据分析

分析酶解前、酶解后及质控样本（QC）3组样本的18个化合物图谱，共鉴定到化合物582种，根据其相对定量结果进行多元统计分析，并通过PCA分析法使组间差异可视化。如图6 (a)所示，3组样本均可有效分离。其中，主成分1（PC1）的方差贡献率为72.10%，主成分2（PC2）的方差贡献率为7.01%，即前2个主成分可反映所有化合物79.11%的特征，表明酶解前后化学成分存在差异。继而使用OPLS-DA分析法，降低组内差异，放大组间差异，提高模型的有效性和解析能力，将分组差异最大化。样本间横向距离越远表明组间差异越大，纵向距离越近表明组内重复性越好。如图6(b)所示，组间样本的区分显著，组内样品重复性良好，样本全部处于95%置信区间内，表明酶解前后，酸枣叶醇提物的化学成分存在显著性差异，可用于后续差异化合物分析。

2.4.2　差异化合物的筛选及分析

使用火山图对酶解前后酸枣叶醇提物的差异化合物进行可视化，结果如图7所示。横坐标log₂FC反映化合物在两个分组之间的差异倍数，其绝对值越大，差异越大；纵坐标-lgP反映酶解前后化合物差异的显著性，P值越小，代表差异越显著，对应的-lgP就越大。基于|log₂FC|>1和P<0.05，由图7可知，与酶解前相比，酶解后共有162种化合物下调（蓝点），169种化合物上调（红点）。结合OPLS-DA结果，以同时满足VIP≥1为筛选标准，从上述结果中筛选出差异化合物41种（详见表1）。其中：有机酸类15种、糖类8种、苯丙素类7种、黄酮类5种、萜类3种、苯酚类、醌类和醇类各1种。根据表1中log₂FC值可以看出，黄酮、有机酸、苯丙素、糖类化合物的含量变化更明显。酶解后，黄酮类化合物中的儿茶素、山柰酚、槲皮素含量升高，杨梅苷、芦丁含量降低；苯丙素中，简单苯丙素化合物（咖啡酸、阿魏酸）含量升高；苯丙素衍生物（细叶远志苷B、绿原酸、丹酚酸D、阿魏酸-O-葡萄糖苷）含量降低；3种二羟基苯甲酸（原儿茶酸、焦儿茶酸、对羟基水杨酸）含量升高。糖类化合物中，4种低聚糖（棉子糖、麦芽三糖醇、α,α-海藻糖、2-hydroxy-2-methyl-3-buten-1-yl β-D-glucopyranoside）含量降低，4种单糖类化合物含量升高。上述结果表明，蜗牛酶酶解有效增加了样品中苷元和小分子化合物的含量，降低了苷类成分及大分子化合物的含量。推测上述变化应与蜗牛酶中丰富的糖苷酶及糖苷键断裂形式相关。

2.4.3　差异化合物与生物活性变化的相关性分析

利用斯皮尔曼相关性分析（Spearman correlation analysis）对酸枣叶醇提物酶解前后的生物活性与酶解前后41种差异化合物的含量变化进行相关性分析。如图8所示，红色区域代表正相关，蓝色区域代表负相关。可以看出：ROS含量与总还原力、DPPH^•清除率、SOD酶活性、线粒体ATP含量及HA759避化率呈负相关性，表明体内、体外抗氧化活性与神经保护活性趋势一致，且体内抗氧化酶活性增强与线粒体功能恢复有助于ROS的清除。从差异化合物含量变化与生物活性变化的相关性分析可以看出：酶解后含量降低的化合物如细叶远志苷B、α,α-海藻糖、绿原酸、杨梅苷、芦丁等18种化合物与ROS水平呈正相关，与总还原力、DPPH^•清除率、SOD酶活性、ATP含量及避化率呈负相关；而其余23种苷元类及小分子化合物如儿茶素、槲皮素、山柰酚、原儿茶酸、焦儿茶酸、儿茶酚、葡萄糖酸等的含量变化与ROS水平呈负相关，与总还原力、DPPH^•清除率、SOD酶活性、ATP含量及避化率呈正相关。

上述结果表明，酶解后，与酸枣叶醇提物体内生物活性增强呈正相关性的苷元及小分子化合物含量升高，推测此类化合物应为蜗牛酶酶解改善酸枣叶醇提物生物活性的主要成分基础。

3　 讨论与结论

为了提高酸枣叶资源的生物利用率，本研究考察了蜗牛酶酶解对酸枣叶醇提物体内外生物活性及化学成分的影响，实验结果表明：

1） 蜗牛酶酶解可提高酸枣叶醇提物的体内、外抗氧化活性。本研究通过体内、外自由基清除及平衡调节活性的测定，分析了蜗牛酶酶解对酸枣叶醇提物抗氧化活性的影响。结果表明，酶解后的酸枣叶醇提物不仅具备更高的体外总还原力和DPPH^•清除效率，还可以显著降低秀丽线虫体内ROS水平，增强秀丽线虫抗氧化酶活性，并提高线虫线粒体ATP含量，表现出更好的体内、外抗氧化活性。

2） 蜗牛酶酶解可增强酸枣叶醇提物的神经保护活性。本研究评价了蜗牛酶酶解对酸枣叶醇提物神经保护活性的影响。通过HD模型线虫ASH神经元存活及整体动物水平的避化行为实验发现，酶解后的样品可显著提高HD模型线虫的神经元存活率，并改善疾病线虫的化学感知行为异常，表现出更好的神经保护活性。

3） 蜗牛酶酶解可改变酸枣叶醇提物中苷及苷元类活性物质的比例。本研究对酶解前后酸枣叶醇提物中的化学成分进行表征，共鉴定化合物582种，筛选出差异化合物41种。分析差异化合物变化可知：酶解后样品中黄酮苷类、苯丙素苷类衍生物等大分子化合物含量降低，而黄酮苷元、简单苯丙素、二羟基苯甲酸等小分子化合物增多。该结果表明，蜗牛酶酶解有助于酸枣叶醇提物中化合物糖苷键的断裂及苷元的释放，可有效实现化合物的生物转化。

4） 酸枣叶醇提物的体内外抗氧化及神经保护活性与酶解后苷元及小分子化合物含量呈正相关。Spearman相关性分析结果表明，酸枣叶醇提物的生物活性与黄酮苷元、二羟基苯甲酸、简单苯丙素、糖酸等化合物的含量呈正相关，与细叶远志苷B、α,α-海藻糖、绿原酸、杨梅苷、芦丁等化合物呈负相关。该结果表明，苷元及小分子化合物的增多与蜗牛酶增强酸枣叶醇提物生物活性密切相关。有研究发现，游离酚羟基与糖以糖苷键形式结合后，不仅影响其自由基清除活性，还会影响化合物的吸收效率，如芦丁需经肠道菌群代谢，被α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶分解为游离苷元槲皮素^[14]方可被吸收；苯丙素衍生物大多以简单苯丙素与糖结合的苯丙素苷的形式存在，其吸收效率受限于体内酶活性^[15]；二羟基苯甲酸被认为是酚酸衍生物的常见单酚结构，具有更好的抗氧化活性^[16]。此外，根据已有文献，酶解后小分子化合物如原儿茶酸^[17]、山柰酚^[18]、虎杖苷^[19]等含量的增加也有助于神经保护活性的增强。上述结果为蜗牛酶酶解增强酸枣叶醇提物生物活性提供了物质基础。

综上，蜗牛酶酶解可以增强酸枣叶醇提物的体内外抗氧化与神经保护活性，该活性改变可能与其断裂酸枣叶中化合物的糖苷键，释放苷元及小分子化合物，增加有效活性成分含量相关。本文研究结果有望为酸枣叶资源的高效开发及利用提供研究基础及数据支撑。有关蜗牛酶在酸枣叶开发中的规模化应用仍需深入探究。

参考文献

[1] 闫艳， 付彩， 杜晨晖. 酸枣叶的营养成分、保健功能及产品开发研究进展［J］. 食品工业科技， 2018， 39（20）： 330-336. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2018.20.056 .

[2] YAN Y， FU C， DU C H. Research progress on nutrient composition， health functions and product development of ziziphi spinosae folium［J］. Science and Technology of Food Industry， 2018， 39（20）： 330-336. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2018.20.056（Ch ）.

[3] 于兆慧， 刘其媛， 崔莉， 等. 蜗牛酶转化人参皂苷Rb₁制备人参稀有皂苷Compound K的研究［J］. 中华中医药杂志， 2015， 30（2）： 412-416.

[4] YU Z H， LIU Q Y， CUI L， et al. Study on the preparation of rare ginsenoside Compound K by enzymolysis of ginsenoside Rb₁ with snailase［J］. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy， 2015， 30（2）： 412-416 （Ch）.

[5] KORNPOINTNER C， SCHEIBELREITER J， HALBWIRTH H. Snailase： A promising tool for the enzymatic hydrolysis of flavonoid glycosides from plant extracts［J］. Frontiers in Plant Science， 2022， 13： 889184. DOI： 10.3389/fpls.2022.889184 .

[6] LI W， ZHAO L C， WANG Z， et al. Response surface methodology to optimize enzymatic preparation of deapio-platycodin D and platycodin D from radix platycodi［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2012， 13（4）： 4089-4100. DOI： 10.3390/ijms13044089 .

[7] ZHAO Y H， SU Y X， LI Z L， et al. Efficient snailase-based production of mogrol from Luo Han Guo extract in an aqueous-organic system［J］. Enzyme and Microbial Technology， 2023， 165： 110212. DOI： 10.1016/j.enzmictec.2023.110212 .

[8] 梁红宝， 袁晓梅， 关永霞， 等. 马钱苷的酶解工艺及其产物的降血糖活性［J］. 中国医药工业杂志， 2018， 49（3）： 333-337. DOI： 10.16522/j.cnki.cjph.2018.03.010 .

[9] LIANG H B， YUAN X M， GUAN Y X， et al. Enzymolysis process of loganin and the hypoglycemic activity of hydrolysates［J］. Chinese Journal of Pharmaceuticals， 2018， 49（3）： 333-337. DOI： 10.16522/j.cnki.cjph.2018.03.010（Ch ）.

[10] 陈文娟， 陈建福， 卢惠婷， 等. 蜗牛酶辅助提取白芽奇兰茶多糖及其抗氧化活性［J］. 安徽农业大学学报， 2018， 45（6）： 996-1003. DOI： 10.13610/j.cnki.1672-352x.20190102.005 .

[11] CHEN W J， CHEN J F， LU H T， et al. Polysaccharides extraction from Baiyaqilan tea by snail enzyme and it antioxidant activity［J］. Journal of Anhui Agricultural University， 2018， 45（6）： 996-1003. DOI： 10.13610/j.cnki.1672-352x.20190102.005（Ch ）.

[12] LI R Z， LIU X C， LI X P， et al. Co-immobilized β-glucosidase and snailase in green synthesized Zn-BTC for ginsenoside CK biocatalysis［J］. Biochemical Engineering Journal， 2022， 188： 108677. DOI： 10.1016/j.bej.2022.108677 .

[13] 叶嘉， 杨明建， 杨香瑜， 等. 太行山区酸枣叶化学成分的UPLC-QTOF-MS分析［J］. 天然产物研究与开发， 2019， 31（7）： 1183-1191. DOI： 10.16333/j.1001-6880.2019.7.010 .

[14] YE J， YANG M J， YANG X Y， et al. Analysis of chemical constituents in Ziziphus jujuba var. spinosa folium by UPLC-QTOF-MS［J］. Natural Product Research and Development， 2019， 31（7）： 1183-1191. DOI： 10.16333/j.1001-6880.2019.7.010（Ch ）.

[15] 于慧， 李明艳， 张典， 等. 响应面试验优化裙带菜蛋白酶解工艺及酶解液抗氧化活性［J］. 食品科学， 2017， 38（6）： 96-103. DOI： 10.7506/spkx1002-6630-201706015 .

[16] YU H， LI M Y， ZHANG D， et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of undaria pinnatifida protein and antioxidant activity of its hydrolysate［J］. Food Science， 2017， 38（6）： 96-103. DOI： 10.7506/spkx1002-6630-201706015（Ch ）.

[17] LI N， LI Q C， HE X Y， et al. Antioxidant and anti-aging activities of Laminaria japonica polysaccharide in Caenorhabditis elegans based on metabonomic analysis［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2022， 221： 346-354. DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2022.09.008 .

[18] ZHANG J， SHI R N， LI H F， et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans ［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2016， 192： 413-422. DOI： 10.1016/j.jep.2016.09.031 .

[19] WANG Q Q， ZHANG J， JIANG Y Y， et al. Caenorhabditis elegans as a model system for discovering bioactive compounds against polyglutamine-mediated neurotoxicity［J］. Journal of Visualized Experiments， 2021（175）： （175）. DOI： 10.3791/63081 .

[20] 苏镶月， 崔刚， 张波， 等. 黄酮类化合物调节肠道菌群的研究进展［J］. 广东化工， 2022， 49（6）： 116-117. DOI： 10.3969/j.issn.1007-1865.2022.06.037 .

[21] SU X Y， CUI G， ZHANG B， et al. Research progress of flavonoids regulating intestinal flora［J］. Guangdong Chemical Industry， 2022， 49（6）： 116-117. DOI： 10.3969/j.issn.1007-1865.2022.06.037（Ch ）.

[22] 戴承恩， 李海龙， 何小平， 等. 益生菌代谢中药有效成分的研究进展［J］. 中国中药杂志， 2018， 43（1）： 31-38. DOI： 10.19540/j.cnki.cjcmm.20170919.012 .

[23] DIA C E， LI H L， HE X P， et al. Research advance in metabolism of effective ingredients from traditional Chinese medicines by probiotics［J］. China Journal of Chinese Materia Medica， 2018， 43（1）： 31-38. DOI： 10.19540/j.cnki.cjcmm.20170919.012（Ch ）.

[24] FARHOOSH R， JOHNNY S， ASNAASHARI M， et al. Structure-antioxidant activity relationships of o-hydroxyl， o-methoxy， and alkyl ester derivatives of p-hydroxybenzoic acid［J］. Food Chemistry， 2016， 194： 128-134. DOI： 10.1016/j.foodchem.2015.08.003 .

[25] HORNEDO-ORTEGA R， ÁLVAREZ-FERNÁNDEZ M A， CEREZO A B， et al. Protocatechuic acid： Inhibition of fibril formation， destabilization of preformed fibrils of amyloid-β and α-synuclein， and neuroprotection［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2016， 64（41）： 7722-7732. DOI： 10.1021/acs.jafc.6b03217 .

[26] VISCO D B， MANHÃES-DE-CASTRO R， SILVA M M DA， et al. Neonatal kaempferol exposure attenuates impact of cerebral palsy model on neuromotor development， cell proliferation， microglia activation， and antioxidant enzyme expression in the hippocampus of rats［J］. Nutritional Neuroscience， 2024， 27（1）： 20-41. DOI： 10.1080/1028415X.2022.2156034 .

[27] 黄炳旭. 虎杖苷在帕金森病大鼠模型中的神经保护作用及其机制［D］. 长春： 吉林大学， 2021. DOI： 10.27162/d.cnki.gjlin.2021.000382 .

[28] HUANG B X. Neuroprotective effects and mechanisms of polydatin in Parkinson’s disease rat model［D］. Changchun： Jilin University， 2021 （Ch）.

基金资助

河北省自然科学基金青年科学基金(H2020207002)

河北省中央引导地方科技发展资金(226Z2801G)

河北省人社厅择优资助博士后科研重点项目(B2022005014)

河北经贸大学科研基金(2021SGYB04)

河北省农林科学院科技创新项目(C21R0803)

河北省农林科学院科技创新项目(C22R0802)