杂交水稻育种技术的研究进展

Progress in Hybrid Rice Breeding Technology

摘要

杂交水稻育种技术的发明是现代科技史上的重大事件，为世界粮食安全做出了巨大贡献。本文主要综述了杂交水稻育种技术的研究进展，包括以细胞质雄性不育系为遗传工具的第一代杂交水稻、以环境敏感型核雄性不育系为遗传工具的第二代杂交水稻、以遗传工程雄性不育系为遗传工具的第三代杂交水稻和以无融合生殖为遗传工具的新一代杂交水稻，介绍了不同育种技术的应用情况，浅析了现阶段开展育种工作的局限性，展望了未来杂种优势利用的方向。

Abstract

The invention of hybrid rice breeding technology is a significant milestone in the history of modern technology, making substantial contributions to global food security. This paper reviews the progress in hybrid rice breeding technology. It covers the first generation of hybrid rice using cytoplasmic male sterile lines, the second generation which employed environment-sensitive genic male sterile lines, then the third generation using genetically engineered male sterile lines, and the new generation that utilizes apomixis. The paper also discusses the application of different breeding technologies, analyzes the limitations of breeding work at this stage, and looks into the future direction of the exploitation of heterosis.

Graphical abstract

关键词

杂交水稻 / 细胞质雄性不育系 / 环境敏感型核雄性不育系 / 遗传工程雄性不育系 / 无融合生殖

Key words

hybrid rice / cytoplasmic male sterile lines / environment-sensitive genic male sterile lines / genetically engineered male sterile lines / apomixis

0　 引 言

杂种优势策略用于提高作物的产量已取得显著成就。利用杂种优势策略培育的杂交水稻促进了水稻产量的飞跃，被誉为“第二次绿色革命”。同时，杂交水稻由于利用了不同亲本间的遗传差异性和互补性，能够在多样的生态环境中保持较高的病虫害防御能力，减少了生产过程中农药的投入，有利于生态环境的保护和农业的可持续发展。尽管如此，杂交水稻的育种和推广仍面临诸多挑战，如高昂的制种成本和复杂的技术要求等。只有不断创新杂交水稻育种技术，降低制种成本并提升其普及度，才能让更多的农民受益于这项技术。通过不断引入分子标记辅助育种、基因编辑以及智能育种等生物学方法，杂交水稻育种经历了第一代杂交水稻生产（利用细胞质雄性不育系的三系法），逐步到更高效的第二代杂交水稻生产（利用环境敏感型核雄性不育系的两系法），再到智能化的第三代杂交水稻生产（利用遗传工程雄性不育系），目前，正向着新一代杂交水稻技术（利用无融合生殖的一系法）迈进。

1　 第一代杂交水稻育种技术

1970年，袁隆平团队发现了野败（wild abortive）雄性不育株，并成功培育出三系杂交水稻，建立了利用细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterile，CMS）系的第一代杂交水稻育种技术^[1]。CMS是指在细胞核基因组携带隐性恢复基因时，由细胞质基因引起的雄蕊发育异常，导致花粉缺陷而无法正常授粉的现象。该技术涉及3个关键的亲本，分别是CMS系、保持系和恢复系^[2]，因此也称三系法。CMS系（母本）的细胞质中有雄性不育基因（表示为S），其细胞核中无育性恢复基因（基因型为S/rr），在育种过程中，株系若无法同时满足这两个条件，则无法成为不育系。保持系细胞质中有可育基因型（表示为N），其细胞核基因中同样缺乏育性恢复基因（基因型为N/rr），因此保持系既能自交结实，也能作为父本与不育系进行杂交，产生与不育系遗传特征相同的雄性不育后代（基因型为S/rr）。恢复系（父本）的细胞核基因携带育性恢复基因（基因型为S/RR或N/RR），当其与不育系杂交时，可产生具有杂种优势的可育后代^[3]。

1.1　类型及机理

目前，水稻中已发现多种类型的CMS系统，如野败型细胞质雄性不育（CMS-WA）、包台型细胞质雄性不育（CMS-BT）、Lead型细胞质雄性不育（CMS-LD）、红莲型细胞质雄性不育（CMS-HL）、中国野生稻型细胞质雄性不育（CMS-CW）、滇Ⅰ型细胞质雄性不育（CMS-D1）、福建细胞质雄性不育（CMS-FA）等，其中CMS-WA、CMS-BT和CMS-HL是目前应用最广泛的3种类型^[4]。

CMS-WA型细胞质雄性不育系的不育基因是线粒体嵌合基因WA352。该基因起源于线粒体基因组序列间的多次重组^[5]。在花粉母细胞发育时期，WA352基因编码的蛋白质会特异性地在绒毡层中积累，与细胞核编码的COX11蛋白发生作用，削弱COX11对活性氧的清除能力，花粉母细胞时期提前发生细胞程序性死亡，导致雄性不育^[6~8]。Rf3和Rf4是CMS-WA相关的育性恢复基因，Rf3在蛋白质水平上调控WA352蛋白的积累^[9]，Rf4则编码一个具有五肽重复结构的三角状蛋白（pentatricopeptide repeat protein，PPR），可以降低不育系中WA352 mRNA的水平，使绒毡层细胞程序性死亡时间恢复正常，从而使植株恢复育性^[10]。

CMS-BT型细胞质雄性不育系被用于杂交粳稻的选育，而CMS-LD型细胞质雄性不育系被用于杂交籼稻的选育，两者的不育基因均是orf79。在小孢子发育阶段，orf79基因的特异性积累会引发配子体雄性不育^[11]。对于CMS-BT系统，Rf1a和Rf1b两个恢复基因通过降解orf79的转录本抑制其功能，从而恢复育性^[11]。在CMS-LD系统中，Rf2基因的存在能有效阻止ORF79蛋白的积累，实现育性的完全恢复^[12]。

CMS-HL型细胞质雄性不育系中决定花粉败育的基因是orfH79，与orf79基因高度同源^[13]。ORFH79蛋白与电子传递链复合物Ⅲ的一个亚基P61相互作用，影响电子传递链复合物Ⅲ的酶活性，从而引起线粒体能量缺乏和活性氧（ROS）上升，最终导致花粉败育^[14]。Rf5和Rf6介导CMS-HL系统的育性恢复，RF5蛋白与GRP162蛋白结合，形成一个育性恢复复合体（RFC），该复合体与atp6-orfH79的转录本结合并对其进行切割加工，恢复花粉育性^[15]；RF6蛋白与O_SHXK6蛋白相互作用，在另一个位点切割atp6-orfH79的转录本^[16]。

CMS-CW型细胞质雄性不育系源自普通野生稻W1，其不育植株可以产生外观正常的花粉粒，但这些花粉粒缺少在柱头上萌发的能力。CMS-CW的不育性状与orf307基因密切相关^[17]。恢复基因Rf17可以通过调控逆行信号恢复CMS-CW的不育性状^[18~20]。CMS-D1是一种源自东乡野生稻的孢子体雄性不育类型，其不育性状由orf182基因控制。ORF182是一种质膜蛋白，与呼吸链复合物的相关蛋白相互作用，会导致花药绒毡层细胞异常解体^[21，22]。CMS-FA则是一种孢子体细胞质雄性不育类型，其特征是不育彻底且仅由单一的育性恢复基因控制^[23]，其育性由线粒体基因FA182决定，育性恢复基因Rf19通过剪切FA182的转录本来恢复花粉育性^[4]。

1.2　应用

根据中国杂交水稻品种资源数据库的数据，第一代杂交水稻在陕西、重庆、四川等地的种植面积占水稻种植总面积的比例超过了90%，广东、云南、浙江等地占比为40%~60%，上海和江苏等地占比低于20%。沿海地区对粳稻的需求量较大，而粳稻不育细胞质资源较稀缺，且杂种优势不够显著，故这些地区主要种植常规稻，杂交水稻种植面积占比相对较低^[24]。根据国家水稻数据中心（https://www.ricedata.cn）的统计，截至2023年，有6 797个三系杂交水稻品种通过了省级及以上的审定。三系法杂交育种技术极大地推动了水稻杂种优势的应用，但也存在一些问题，如仅少部分水稻资源能同时满足不育细胞质的存在和细胞核内无育性恢复基因两个条件；一些不育系类型的育性易受高温等环境条件影响，且不育系选育周期较长，这使不育系选育的难度增加；在恢复系选育过程中，也必须确保恢复基因存在才能达到育性恢复的目的。这些问题都阻碍了三系法杂交水稻育种技术的发展^[25,26]。

2　 第二代杂交水稻育种技术

在第一代杂交水稻育种技术的基础上，人们进一步提出了环境敏感型核雄性不育（environment-sensitive genic male sterility，EGMS）系的两系法育种技术^[27,28]。EGMS系为细胞核基因控制的雄性不育，其育性在不同环境下的表现不同。该技术涉及2个关键的亲本，分别是EGMS系和恢复系，因此也称两系法。EGMS系的细胞核中存在环境敏感型不育基因（基因型为rr），该不育系在特定的环境中，表现为雄性不育，可以与恢复系杂交，在适宜的环境中表现为可育，可以自交结实。大多数普通水稻品种均可作为恢复系，只要细胞核基因携带育性恢复基因（基因型为RR），就能恢复杂种一代的花粉可育性^[27]。

2.1　类型及机理

植物雄配子的发育受细胞内遗传物质调控，该过程受外界环境因素如光照、温度、湿度和氮含量等的影响。根据不同的环境影响因素，环境敏感型核雄性不育主要分为光敏雄性不育、温敏雄性不育、湿敏雄性不育和氮敏雄性不育。

1） 光敏雄性不育（photoperiod sensitive genic male sterility，PGMS）。1973年，石明松^[29]在湖北仙桃的农垦58大田中发现了PGMS的粳型材料，将其命名为农垦58S（NK58S）。该不育系在长日照条件下表现为雄性不育，在短日照条件下表现为正常的雄性育性。遗传分析表明，NK58S的PGMS性状由pms1和pms3基因控制。pms1发生了单碱基突变（由G突变为A），影响其编码的长链非编码RNA（lncRNAs） PMST1二级结构，在长日照条件下，PMST1被miR2188切割产生过量的21-nt phasiRNAs，导致雄性不育^[30]。pms3基因发生了单碱基突变（由C突变为G）^[31]，提高其编码的lncRNA LDMAR启动子甲基化程度，LDMAR表达量降低，无法满足长日照条件下花粉正常发育的需求，导致花粉败育。在短日照条件下，pms1和pms3转录水平正常，花粉育性恢复^[31,32]。

2） 温敏雄性不育（thermosensitive genic male sterility，TGMS）。1988年，邓华凤等^[33]发现了水稻温敏雄性不育系，将其命名为安农-1（AnS-1）。该不育系在低温条件下不育，高温条件下可育。AnS-1的TGMS性状由tms5基因控制^[34]，该基因由于发生了单碱基突变（由C突变为A），翻译提前终止，导致其编码的核糖核酸酶Z（RNase Z^S1）功能丧失，无法降解UbL40转录本。在高温条件下，UbL40蛋白过量积累，导致花药败育，而在较低温度条件下，UbL40基因表达水平较低，花药发育正常，育性恢复^[34]。

3） 湿敏雄性不育（humidity sensitivity genic male sterility，HGMS）。湿敏核不育指在低湿度环境下表现雄性不育，而在高湿度条件下育性恢复的核不育类型^[13]。2003年，研究人员在拟南芥中观察到一种现象，即在低湿度条件下，突变体的花粉会失活，这一现象的产生原因是花粉外壁中缺乏孢粉素^[35]。随后，Xue等^[36]发现禾谷绒毡醇合酶（OsOSC2/OsPTS1）基因引导的代谢途径可以调控花粉外壁中的脂肪酸积累。该基因在花粉包被形成过程中发挥关键作用，影响突变体在干燥和高湿环境中的育性，当湿度低于60%时花粉会快速失水导致雄性不育，当湿度高于80%时，表现为完全可育。Ni等^[37]发现OsCER1是拟南芥蜡质合成基因CER1的同源基因，在敲除OsCER1基因的材料中，花粉在低湿度条件下表现为败育，而在高湿度环境下，花粉黏附率和萌发率显著提高，表现为可育^[37]。

4） 氮敏雄性不育（nitrogen sensitivity genic male sterility，NGMS）。氮敏雄性不育是指氮营养通过影响减数分裂的起始作用于水稻的育性。Yang等^[38]在水稻中鉴定了1个氮依赖型的减数分裂突变体，该突变体电子传输黄素蛋白功能缺失。在氮元素缺失条件下，突变体出现减数分裂起始缺陷，导致花粉败育，但可以通过外源施加无机氮达到育性恢复。

2.2　应用

自1973年光敏雄性不育被发现以来，我国已选育出一大批环境敏感型核雄性不育系，并配套了具有生产实用价值的第二代杂交水稻优良组合。国家水稻数据中心数据显示，截至2023年，已有3 377个两系杂交水稻通过省级以上审定，其产量、抗病性和稻米品质均超过第一代杂交水稻^[39]。

与第一代相比，第二代杂交水稻不受恢保关系的限制，更易选配到强优势组合，且育种程序极大简化，可以加速育成杂交水稻新品种，但其不育系育性转换的临界条件不稳定，当环境条件波动较大时，不育性状有一定的恢复度，因而在杂交种制种时存在较大风险^[40]。

3　 第三代杂交水稻育种技术

3.1　建立与应用

许多雄性不育突变体是由对环境条件不敏感的基因调控。这些基因在花粉发育过程中发挥重要作用，被称为普通核雄性不育（genic male sterility，GMS）基因^[41]。由于GMS基因通常由隐性突变引起，所以任何含有野生型基因的水稻种质都能恢复杂交种的育性，这一特性为杂交水稻育种提供了更广泛的种质选择。为此，研究者可以通过生物学方法，在常规稻中引入GMS基因来创制遗传工程雄性不育系。这种方法虽然在理论上可行，但在实际应用中面临无法规模化繁殖的问题。

为了解决这一难题，美国杜邦先锋（DuPont Pioneer）公司将育性恢复基因和花粉失活基因引入到不育系中，获得维持不育性状的保持系，再通过自交的方式实现了对不育系的繁殖^[42]。基于此发现，研究者建立了第三代杂交水稻技术。如图1所示，该技术将花粉育性恢复基因（MS）、花粉失活基因（PIG）以及标记筛选基因（Tag）作为紧密连锁表达载体，一同插入到遗传工程核不育系ms/ms中，获得遗传工程繁殖系ms/ms^MSTPIG，其转基因材料的育性在后代中恢复。通过自交，繁殖系产生的后代有两种遗传组合，一种是含有突变基因但不含转基因元件的不育系（ms/ms），另一种是既含突变基因又含转基因元件的繁殖系（ms/ms^MSTPIG ），两者的占比约为1∶1。借助这一技术，能从同一植物中收获到可用于杂交制种的非转基因种子和恢复花粉育性并可用于不育系繁殖的转基因种子，然后再使用标记筛选技术区分这两种类型的种子^[43]。

为了推动第三代杂交水稻技术的发展与应用，科研团队不断攻关。Chang等^[44]利用化学诱变方法获得突变体osnp1，该突变体在不同环境条件下均表现出不育性状稳定、营养生长正常、柱头外露率和异交结实率高的特点，可以作为遗传工程核不育系用于第三代杂交水稻的生产。为了创建突变体osnp1的繁殖系，他们将野生型OsNP1基因、花粉失活基因ZmAA1和红色荧光标记基因DsRed2连接到一个T-DNA盒中，导入osnp1突变体，成功培育出Zhen18B繁殖系。2020年，第三代杂交水稻叁优一号在湖南衡阳实现了双季稻年产22 500 kg/hm²的目标 ^[45]。2021年，Song等^[46]利用CRISPR-Cas9技术敲除9311品种中的Cyp703A3基因，创制了不育系9311-3A，并利用CMS基因orfH79建立了花粉失活系统，构建了包含Cyp703A3、Rf1b-orfH79和DsRed2的连锁表达载体，通过遗传转化获得了9311-3B繁殖系，并在此基础上选配了多个强优势组合。

在第三代杂交水稻育种技术的发展过程中，隐性核不育基因、花粉失活基因和种子分选基因的研究与创新对于推动该技术的进步具有重要意义。

3.2　隐性核不育基因

第三代杂交水稻育种应优先考虑那些专一影响水稻育性而不干扰其他发育过程的隐性核雄性不育（recessive genic male sterility, RGMS）基因。在理想的情况下，RGMS基因应只在雄性生殖器官中特异性表达，而不会影响到其他营养器官，否则可能对植株的生长发育产生不良影响。目前，获得RGMS基因的方法主要有两种，分别是克隆突变体基因和CRISPR/Cas9技术。

1） 克隆突变体基因。通过突变体基因的克隆可以获得GMS基因，如OsMs26（CYP704B2）^[47]和OsNP1^[48]。研究者在以粳稻9522为背景的突变体文库中筛选出雄性不育突变体cyp704B2，并克隆出不育基因OsMs26（CYP704B2）。其编码的脂肪酸羟化酶对水稻花药囊和花药外壁的发育至关重要，可用于第三代杂交水稻系统^[47]。还有研究者通过筛选籼稻品种黄华占的突变体库，获得GMS突变体osnp1，克隆出OsNP1基因。该基因在花药角质层和花粉外壁的发育过程中发挥重要作用^[44,48]。

2） CRISPR/Cas9技术。利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术在优良材料中创制GMS株系，如基于OsCYP703A3不育基因的第三代杂交稻的构建。OsCYP703A3基因在花药中特异表达，编码一种水稻花粉壁形成所必需的细胞色素P450羟化酶。该基因最初在一个不适合用于杂交育种的粳稻突变体中被发现。为了在具有优良性状的籼稻9311中开发GMS系，研究者利用CRISPR/Cas9获得OsCYP703A3功能缺失的突变体9311^03a3[49]。

3.3　花粉失活基因

许多国家对转基因作物采取了监管措施，其中对水稻和小麦等主要粮食作物监管更加严格。在这样的背景下，花粉失活基因与育性恢复基因的紧密连锁对于确保转基因成分的有限传播至关重要。理想的繁殖系应能在不传播转基因元件的情况下繁殖雄性不育种子，这要求花粉失活基因对转基因花粉具有致死性，而对非转基因花粉则无致死性^[50]。目前，广泛使用的花粉失活基因是来自玉米的α-淀粉酶基因ZmAA1，它通过降解花粉中的淀粉来使转基因花粉失去活性。然而，ZmAA1的致死率在一定程度上受环境因素的影响，转基因通过授粉的传递率介于0.01%~0.08%之间^[51]。提升花粉失活基因的致死率有两种策略：一是采用比ZmAA1更有效的花粉失活基因；二是利用更强的启动子来增强现有花粉失活基因在转基因花粉中的表达水平。

1） 采用更有效的花粉失活基因。多个基因被报道具有花粉失活功能，如orfH79^[46]、Dam^[52]和ZmGa1F^[50]。orfH79基因是一个CMS基因，通过花粉发育后期特异性启动子PG47驱动与线粒体靶向信号肽RF1b融合的ORFH79蛋白的表达，ORFH79在线粒体中表现出细胞毒性，使转基因花粉失活^[46]。目前，已经从水稻和其他植物物种中鉴定出许多CMS基因，但这些基因是否适用于花粉失活系统仍需进一步研究验证。Dam基因在花药中的特异性表达能够干扰绒毡层细胞和小孢子的正常发育，导致玉米雄性不育^[52]。同时表达ZmAA1和Dam能显著提高花粉失活效率，转基因花粉的传递率仅为单独表达ZmAA1植株的12%，这表明联合使用这两种基因能显著增强花粉失活效果^[52]。ZmGa1F基因在玉米花药中的特异性表达能干扰花粉管发育，有效阻止转基因元件的传播^[50]。

2） 利用更强的启动子。通过高效启动子增强花粉失活基因在转基因花粉中的特异性表达，是防止转基因花粉传递的另一策略。已报道的花粉失活系统普遍采用玉米花粉特异性启动子PG47驱动花粉失活基因的表达，能有效阻断花粉粒中淀粉粒的形成。然而，考虑到商业化生产过程中可能涉及的知识产权问题，Wang等^[53]通过RNA测序分析筛选出在成熟花粉粒中特异性表达的基因，并鉴定了OsLSP3、OsLSP5和OsLSP6等启动子。这些启动子具有巨大的潜力，可应用于第三代杂交水稻技术中，为提高转基因花粉失活基因的表达效率提供关键支持。

3.4　种子分选基因

如何高效、精确且低成本地分选繁殖系和不育系对第三代杂交水稻育种非常重要。目前，许多繁殖系使用红色荧光蛋白基因DsRed2和mCherry作为种子分选的标记。在565 nm光的激发下，含标记基因的繁殖系种子的糊粉层会发出红色荧光，可与无荧光的不育系种子区分开。然而，田间生长的种子可能受到多种环境和栽培条件的影响，如病虫害、温湿度变化以及灌溉和肥料管理等，这些因素可能导致不育系种子的种皮出现褐色或黑色斑点，产生微弱的荧光信号，影响种子分拣的准确性，最终降低GMS种子的纯度。此外，荧光分选依赖于专门的荧光分选机，而现有设备的处理能力有限，每小时仅能处理35 kg种子^[51]。

为了解决上述问题，研究人员正在开发新的种子分选技术，其中一种是基于种子质量的分选方法：首先利用人工微小RNA来抑制ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）基因的表达，干扰胚乳中淀粉的合成，使转基因种子的质量减轻；然后通过质量分选机分离较轻的转基因繁殖系种子与较重的非转基因不育系种子。这种质量分选机对水稻种子的处理速度非常快（3 000~6 000 kg/h），约为荧光分选机速度的100倍^[54]。此外，还可以利用植物色素生物合成基因进行种子颜色分选，如利用番茄花青素合成基因ANT1使种子苗期积累花青素而呈现紫色，便于通过幼苗颜色进行区分^[55]；利用甜菜红色素生物合成基因RUBY使种子呈现红色，无须任何设备即可肉眼识别、分选^[56]。还有研究者如An等^[57]设计了一套利用除草剂抗性基因Bar来筛选繁殖系的系统。Bar基因使水稻对草甘膦除草剂不敏感，通过喷洒除草剂可以杀死对该除草剂敏感的不育系，而保留繁殖系种子。这些创新的种子分选技术对于第三代杂交水稻技术的成功实施至关重要，它们确保了高效、准确地分离不育系和繁殖系种子，从而保证了杂交种子生产的质量和纯度。

第三代杂交水稻育种技术结合现代生物技术和传统育种方法，有以下优势^[58]：首先，其育性不受环境条件变化的影响，表现出更高的稳定性，从而确保了制种过程的安全性；其次，不育系的遗传特性更简单，有助于聚合优良性状，推进育种工作，扩大杂交水稻的适应范围；最后，不育系可通过自交同时完成不育系和繁殖系两类种子的繁种过程，极大地降低了制种成本。同时，这一技术还为那些在第一代和第二代杂交水稻技术中未能成功应用的品种提供了利用杂种优势的新途径。

4　 新一代杂交水稻育种技术

早在1977年，赵世绪^[59]就提出了“一系法”的概念。该方法借助无融合生殖技术来固定杂交种F₁代的优势。无融合生殖是一种无性生殖方式，雌雄配子不经历减数分裂，也不经过受精，而是由二倍体配子直接发育成新个体，使后代的基因型与亲本高度一致^[60]。这不仅有助于固定特定的优良性状，还简化了育种流程并降低了种子生产的成本。一系法的理念与简化和高效化育种程序的现代发展理念相契合，成为新一代杂交水稻育种技术^[61]。

研究者不断探索无融合生殖资源，并围绕自然发生的无融合生殖现象开展了一系列深入的分子机制研究^[62]。Mieulet等^[63]利用基因编辑技术敲除控制水稻减数分裂的关键基因OsOSD1、PAIR1和OsREC8，将减数分裂转变为有丝分裂（meiosis into mitosis，MiMe），使后代的基因型与亲本体细胞基因型完全一致。这一突破为利用无融合生殖技术固定杂种F₁代的优势奠定了坚实基础。随后，研究者致力于将有丝分裂产生的二倍体雌配子诱导为含有正常胚的种子。Khanday等^[64]在研究精细胞过程中，成功鉴定出胚胎产生基因BBM1，该基因属于转录因子AP2家族，在植物受精后的胚发育启动过程中发挥作用。为进一步探究BBM1的功能，他们在卵细胞中异位表达该基因，并阻止雌配子减数分裂，使卵细胞在未受精情况下触发孤雌生殖，直接发育成胚，完成无融合生殖过程。Yao等^[65]通过CRISPR/Cas9技术敲除OsMATL基因，诱导水稻产生单倍体。Wang等^[66]利用基因编辑技术在杂交水稻春优84中同时敲除4个与生殖相关的基因，得到杂交水稻的克隆种子Fix，实现杂合基因型的固定，建立了水稻无融合生殖体系。但该体系存在结实率低（<10%）的问题。Wei等^[67]不断优化无融合生殖体系，利用拟南芥卵细胞特异性启动子pDD45驱动孤雌生殖基因BBM1同源基因的表达，鉴定到BBM4可以触发水稻的孤雌生殖，并获得了具有无融合生殖能力的Fix2植株，其结实率提高到80.9%~86.1%。Liu等^[68]将Fix材料加代繁殖，鉴定每一代种子的倍性水平，发现每个世代都稳定保持无融合生殖特性。在此基础上，他们从全基因组、甲基化、转录组和亚基因组等层面揭示了无融合生殖体系遗传的稳定性。Underwood等^[69]在蒲公英中定位到一个控制无融合生殖的位点，利用基因编辑技术使该位点上的候选基因发生突变，最终鉴定出孤雌生殖基因PARTHENOGENESIS（PAR），该基因编码一个含有K2-2锌指EAR结构域的蛋白，当PAR基因功能丧失后，植物体无法产生存活的种子，但通过授粉可以获得有活力的种子。还有研究利用拟南芥卵细胞特异启动子EC1.1驱动PAR，结合MiMe突变技术，实现杂交水稻的无融合生殖，并结合基因编辑技术敲除BC1和SD1基因，改良水稻的脆秆和半矮秆性状，使杂交水稻具有更好的农艺性状^[70]。

目前，有关无融合生殖分子机制的研究已取得一定进展，研究者通过基因编辑等手段精确调控参与生殖途径的基因，改变减数分裂过程以实现孤雌生殖，并对孤雌生殖产生的种子在遗传中的稳定性进行研究，确保此项技术商业化应用的可行性。

5　 展 望

1926年，美国育种家Jones提出了水稻具有杂种优势的理论^[71]，随后各国开始探索利用水稻杂种优势的可能性。我国水稻专家丁颖院士采用“人工去雄”技术成功培育出杂交水稻品种，为中国杂交水稻的发展开辟了新径。此后，中国育种家开始不断尝试水稻杂交育种，逐渐形成了水稻杂种优势利用的技术体系。袁隆平院士发表的论文《水稻的雄性不孕性》^[72]标志着中国杂交水稻研究正式起步。杂交水稻的配组一般是种内杂交（如籼-籼和粳-粳杂交），研究主要集中在籼型亚种内的杂种优势利用。近年来，为进一步挖掘杂种优势利用的潜力，杂交水稻的研究已逐步过渡到籼粳亚种间杂交分子机制和利用无融合生殖实现杂种优势的固定。

5.1　利用籼粳亚种间杂交增强杂种优势

亲本之间亲缘关系越远，其杂种优势越明显^[73]。研究者发现，籼粳亚种间杂交展现出强大的杂种优势^[74,75]，这一发现成为实现下一阶段水稻产量突破的重要方向之一。然而，粳稻和籼稻之间存在较严重的生殖隔离现象，杂交后代的生殖能力较差，导致结实率低，产量受到较大影响^[76]。为此，研究者聚焦籼粳亚种间生殖隔离基因的挖掘及其作用机制的解析，致力于建立更加全面的水稻杂种优势调控网络，以促进杂种优势的利用，目前已定位并克隆多个不育位点，如Sa^[77]、S5^[78]、HSA1^[79]、Sc^[80]和RHS12^[81]等。由于亚种间杂种优势的利用还面临其他诸多问题，如籼粳两个亚种间开花时间不同步、育种周期长和杂交不亲和等，后续研究须重点挖掘控制花时差异的关键基因，并加深对杂种优势分子机制的理解，以推动籼粳杂交水稻的进一步发展。

5.2　利用无融合生殖固定杂种优势

利用无融合生殖育种技术，可以有效固定水稻的杂种优势，避免优良性状在遗传过程中分离，也是未来研究的重要方向之一。为了将无融合生殖育种技术应用于杂交水稻育种，研究者一直在探索通过有丝分裂替代减数分裂来产生二倍体配子的方法。由于这一策略在后代的育性和结实率方面仍面临挑战，故尚未在农业生产中广泛应用^[64,66,67]。进一步的研究发现，在无融合生殖过程中，胚的自主发育被激活，释放的信号会抑制胚乳的形成，进而降低种子的结实率。因此，寻找能够高效启动胚乳特异性表达的基因，成为提高无融合种子结实率的关键。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31670310)

国家自然科学基金项目(31871592)

湖北省创新群体(2020CFA009)