槟榔碱的抗疲劳活性及其作用机制

Anti-Fatigue Activity and Its Mechanism of Action of Arecoline

摘要

通过构建动物行为敏化模型，分析了槟榔碱对游泳小鼠运动耐力、血液中代谢产物堆积、氧运输蛋白水平、肌糖原、肝糖原、肌肉和肝脏中的丙二醛、中枢神经递质水平和血脑屏障通透性的影响，探讨了敏化处理和不同给药方式（口腔缓释和灌胃）对槟榔碱抗疲劳活性的增效作用。结果显示：槟榔碱不同处理均可延长小鼠游泳力竭时间，口腔缓释+敏化组小鼠的游泳力竭时间最长，且极显著大于其他组（P<0.01）；槟榔碱可有效降低游泳小鼠代谢产物血乳酸、丙二醛和血尿素氮的积累，抑制血红蛋白和多巴胺水平的下降，缓解肌糖原和肝糖原的耗竭，阻碍大脑内5-羟色胺与多巴胺质量分数比值的升高，增强血脑屏障的通透性，降低5-羟色胺对大脑兴奋的抑制，从而发挥抗疲劳作用。上述敏化小鼠的各项指标均能通过口腔缓释给药得到改善，表明嚼食槟榔能够很好地发挥槟榔的抗疲劳活性。

Abstract

The animal behavioral sensitization model was constructed to analyze the effects of arecoline on exercise tolerance，metabolite accumulation, oxygen transport protein levels, liver glycogen, muscle glycogen, malondialdehyde (MDA) levels of muscles and liver tissues, the level of central neurotransmitters, and blood-brain barrier (BBB) permeability in swimming mice, and the synergistic effects of sensitization treatment and different administration routes (oral sustained-release and gavage) on the anti-fatigue activity of arecoline were explored. The results show that arecoline can prolong the exhaustive swimming time of mice, among which the group of oral sustained-release administration and behavioral sensitization was extremely significant longer than that of other groups (P<0.01). Arecoline exerts anti-fatigue effects by effectively reducing the accumulation of metabolite such as blood lactate, MDA and blood urea nitrogen in swimming mice, alleviating the decrease in hemoglobin (Hb) and dopamine (DA) levels, inhibiting the depletion of muscle glycogen and liver glycogen, hindering the increase in the ratio of 5-hydroxytryptamine (5-HT) to DA in the brain, enhancing the permeability of BBB, and reducing the inhibition of 5-HT on the excitatory of brain. The above indicators of the sensitized mice can be improved by oral sustained-release administration, indicating that chewing areca nut can better exert the anti-fatigue activity.

Graphical abstract

关键词

槟榔碱 / 血脑屏障 / 疲劳 / 神经递质 / 行为敏化

Key words

arecoline / blood-brain barrier / fatigue / neurotransmitter / behavioral sensitization

0　 引 言

槟榔树（Areca catechu L.）是重要的热带药用植物，主要分布于印度、马来西亚以及中国的台湾省和海南省等国家或地区。槟榔（areca nut）是槟榔树的果实，其果仁和果皮均可入药，是我国重要的黎药和南药，位居四大南药之首^[1]，于1953年被列入《中华人民共和国药典》^[2]。槟榔主要用于治疗寄生虫、机体疲劳、食积气滞、食欲不振、腹痛胀满和疟疾等病症，还作为强心剂和收敛剂使用^[1]。槟榔是仅次于咖啡因、尼古丁和酒精的全球第四大口腔嗜好品，约有6亿人嚼食槟榔^[3，4]。槟榔具有丰富多样的生物活性，但也表现出一些毒副作用，2003年世界卫生组织国际癌症研究机构将槟榔认定为致癌物（Group Ⅰ）^[5]，其主要致癌物质为槟榔碱（arecoline）^[6]。但该机构在2020年再次对槟榔碱的致癌性进行评估，因无有效数据证明槟榔碱致癌，认为槟榔碱致癌不充分^[7]。槟榔碱是槟榔的特征性化学成分，具有广泛的药理作用，主要作用于神经、心血管、内分泌和消化系统等。槟榔碱具有显著的抗疲劳作用，如刺激毒蕈碱受体（M受体），促进机体兴奋性^[8]；促使脑部乙酰胆碱浓度升高，使大鼠意识清醒^[3]；降低血乳酸（blood lactate acid，BLA）和血清尿素的水平，提高小鼠肝糖原（liver glycogen）、肌糖原（muscle glycogen）含量并延长游泳力竭时间（swimming time to exhaustion）^[1]；提高血液中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度^[1]；降低中枢神经系统抑制性神经递质（neurotransmitters）γ-氨基丁酸（GABA）对机体兴奋的抑制作用^[8]等。疲劳是动物长期进化获得的一种自我保护机制，伴随有复杂的生理生化过程。一般认为，疲劳的原因来自外周和中枢两方面^[9]。外周疲劳是过量运动引起的肌肉疼痛、耐力下降和身体虚弱的状态，在生理生化指标上表现为：1） 肝糖原、肌糖原等能量物质的消耗；2） BLA、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）等代谢产物（metabolites）的积累；3） 氧运输特殊蛋白质血红蛋白（hemoglobin，Hb）水平的降低^[10，11]。中枢疲劳的产生表现为神经递质失衡，导致中枢神经系统无法充分驱动肌肉的收缩^[12]。

本研究通过构建小鼠敏化模型，模拟槟榔嚼块的口腔吸收设计口腔缓释给药，分析了槟榔碱处理的小鼠能量物质消耗、代谢产物积累、氧运输蛋白水平、血脑屏障（blood brain barrier, BBB）通透性、神经递质水平和游泳力竭时间与对照小鼠的差异，分析行为敏化和给药方式对槟榔碱抗疲劳活性的影响，探讨槟榔碱抗疲劳作用的机理（如图1），为研发槟榔碱抗疲劳产品提供理论支撑。

1　 材料与方法

1.1　主要仪器及试剂

仪器：L0-LX-H165A型台式高速离心机（上海力辰邦西公司）、SpectraMax i3x型多功能酶标仪（美谷分子公司）、UV-5100型分光光度计（上海元析仪器公司）、ME204E型电子天平（上海梅特勒-托利多公司）、热弯游泳缸（浙江森森公司）。

试剂：槟榔碱（色谱纯98%，成都格利普生物公司）、小鼠乳酸（BLA）、尿素氮（BUN）ELISA检测试剂盒（上海双赢生物公司）、小鼠丙二醛（MDA）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（上海一研生物公司）、小鼠氰化高铁血红蛋白（Hb）ELISA试剂盒（上海常达恩生物公司）、小鼠5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、肌糖原、肝糖原ELISA检测试剂盒（上海臻科生物公司）、伊文思蓝（evans blue，EB）染料（连云港伊势久生物公司）、甲酰胺（分析纯，广东方信生物公司）。

1.2　实验动物

选用4周龄SPF级KM小鼠（SCXK(湘)2019-0004，质量18±2 g，湖南斯莱克景达公司）进行实验。将小鼠置于实验室（温度22±3 ℃，光照时间12 h/d）适应7 d，以SPF级小鼠专用维持饲料（江苏省协同医药公司）喂养，自由采食及饮水。

本研究所涉及的动物处置方案获海南热带海洋学院伦理审查小组审查并同意，符合动物伦理学标准，审批编号KYLL21006。实验操作遵守《中华人民共和国实验动物管理条例》相关规定，实验动物痛苦最小化。

1.3　实验方法

动物行为敏化参考姚敏等的方法^[13]并稍作修改。小鼠敏化的4个阶段分别为预适应期（habituation，2 d）、形成期（development，7 d）、转化期（withdrawal，7 d）和表达期（expression，1 d），共17 d（见图2）。预适应期（d1~d2）：敏化组（sensitized）和非敏组（non-sensitized）均采用生理盐水（saline, S）灌胃（gavage），1次/d，剂量为20.0 mL/kg。形成期（d3~d9）：即药物处理期，敏化组灌胃给药，1次/d，给药量为20.0 mg/kg（槟榔碱浓度为1.0 mg/mL）；非敏组采用等体积生理盐水灌胃，连续给药7 d，给药前禁食8 h，给药后禁食1 h。转化期（d10~d16）：即药物撤离期，正常饲养，无给药处理。表达期（d17）：采用槟榔碱激发动物的行为敏化表现，剂量为10.0 mg/kg。敏化结束后淘汰敏化效果不佳的小鼠。此外，每2天进行一次无负重游泳锻炼，每次10 min。

口腔缓释给药方法：打开聚丙烯空心给药球（直径5 mm），放入含有槟榔碱的样品并扣紧，增加防脱落罩防止给药球脱落。给药球表面均匀分布着适当大小的孔，可以在10 min内完成给药。

构建了6个处理组。取8只敏化组雄鼠，随机分为2组；另取16只非敏化雄鼠，随机分为4组，每组均为4只。根据图2设计为6个处理组：灌胃+敏化（gavage+sensitized）、灌胃+非敏化（gavage+non-sensitized）、口腔缓释+敏化（oral+sensitized）、口腔缓释+非敏化（oral+non-sensitized）、游泳对照（swimming control）、安静对照（quiet control）。除安静对照组不参与力竭游泳（exhaustive swimming）运动外，其他各组均参与游泳运动。实验组药物剂量为10.0 mg/kg，对照组为等体积的生理盐水。

1.4　力竭游泳耐力及最短力竭时间测定

1） 力竭游泳耐力测定。根据文献方法^[14]，使鼠尾根负重5%体质量的铅丝，在蒸馏水（35 ℃，水深40 cm）中开展力竭游泳实验。轻放小鼠于水面并开始计时，以没入水中10 s内不能浮起自由呼吸为力竭标准。若小鼠静止浮在水面用鼻孔呼吸，需驱逐使其继续游泳。

2） 最短力竭时间测定。取除安静对照组外的5组小鼠开展力竭游泳实验，记录各组力竭时间，并以5组中最短力竭时间为后续实验的游泳时间。

1.5　生化指标测定方法

取6组小鼠，给药10 min后开展小鼠游泳运动，游泳时长为最短力竭时间，测定MDA、Hb、BLA、BUN、肌糖原、肝糖原以及神经递质5-HT、DA。小鼠游泳后，腹腔麻醉小鼠，摘眼球采血，室温静置2 h，离心分离（1 000g，20 min）血清和红细胞，获得血清。采用ELISA试剂盒测定血清、肌肉和肝脏（liver）中的MDA含量；采用血乳酸试剂盒测定血清中的BLA含量^[14]；参考郭云聪的方法^[15]，采用ELISA试剂盒检测血清中的BUN含量；采用ELISA试剂盒检测血清中DA和5-HT的含量；采用氰化高铁比色法^[11]测量全血中的血红蛋白(Hb)含量。参考余煊的方法^[16]，摘小鼠眼球采血后，取左右大脑，采用试剂盒测定大脑中DA和5-HT的含量。参考Liu等的方法^[11]，取肝脏和骨骼肌，以生理盐水漂洗后用滤纸吸干，按照肌糖原测定试剂盒和肝糖原测定试剂盒要求分别测定肌糖原和肝糖原。

1.6　血脑屏障通透性检测

血脑屏障通透性检测参考郑文旭等方法^[17]并稍作修改，取6组小鼠，给药后，尾静脉注射质量分数2%的EB溶液，剂量为4 mL/kg。注射10 min后开展游泳实验，游泳时长为最短力竭时间。游泳后腹腔麻醉小鼠，并剖开胸腔，剪开心脏右心耳，将生理盐水从左心室灌注至流出液无色透明。矢状缝切开左右大脑，每100 mg大脑组织加入1.0 mL甲酰胺溶液，冷冻研磨匀浆，37 ℃孵育48 h，匀浆，离心（18 360g，20 min），取上清液于620 nm波长处测定光密度值，按照EB标准曲线计算EB含量，通过大脑内EB含量反映血脑屏障通透性。

绘制EB标准曲线：精确称取1.00 mg EB标准品溶解至10 mL甲酰胺溶液中，得到100 μg/mL EB原液，并稀释为50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3、0.390 6 μg/mL共8个浓度，于620 nm测定光密度（OD）值，绘制标准曲线。

1.7　数据处理

采用SPSS.19.0统计软件进行方差分析和正态分布分析，数据以平均数±标准差（mean±SD）表示，P<0.01表示极显著水平，P<0.05表示显著水平。

2　 结果与分析

2.1　槟榔碱对小鼠运动耐力的影响

运动耐力是反映动物疲劳的直接指标，负重游泳是测定小鼠运动耐力的常用方法。图3显示，各处理组小鼠游泳力竭时间均大于游泳对照组（均值138.5±14.7）s，且除灌胃+非敏化组外的3个处理组均显著大于游泳对照组（P<0.05）；2个敏化组小鼠的游泳力竭时间均极显著大于2个非敏化组（P<0.01）；口腔缓释给药组小鼠游泳力竭时间均大于灌胃给药组，其中口腔缓释+敏化组极显著大于灌胃+敏化组（P<0.01）。各组游泳力竭时间由大到小顺序为：口腔缓释+敏化、灌胃+敏化、口腔缓释+非敏化、灌胃+非敏化、游泳对照组。根据游泳对照组的游泳力竭时间，后续实验的游泳时间设置为138 s。

2.2　槟榔碱对血液中代谢产物和Hb的影响

2.2.1　对血乳酸的影响

剧烈运动使机体缺氧并引起肌糖原发生糖酵解，产生的乳酸大量积累，会导致肌肉收缩力下降^[18]。因此，BLA积累是运动性疲劳的一个重要指标。表1显示，游泳使小鼠血乳酸浓度升高，各组小鼠BLA含量均极显著高于安静对照组（P<0.01）；各处理组均抑制了BLA浓度的升高，且除灌胃+非敏化组外的其他处理组BLA浓度均极显著低于游泳对照组（P<0.01）；敏化组均极显著低于相同给药方式的非敏化组（P<0.01）；口腔缓释+敏化组极显著低于相同敏化条件的灌胃给药组（P<0.01）。

2.2.2　对血液中丙二醛的影响

剧烈运动使机体缺氧引起脂质过氧化反应生成MDA^[19]。MDA可促进自由基产生，降低机体的工作能力^[20]，因此MDA水平也是反映机体疲劳的一个重要指标。表1显示，游泳小鼠血液中的MDA含量均显著高于安静对照组（P<0.05）；各处理组均抑制了MDA浓度的升高，其中口腔缓释+敏化组抑制效果最佳，其值显著低于其他3个处理（P<0.05）；2个敏化组的MDA水平极显著低于2个非敏化组（P<0.01）；口腔缓释+敏化组MDA水平显著低于相同敏化条件的灌胃给药组（P<0.05），但是对非敏化小鼠的效果不明显。

2.2.3　对血液中尿素氮的影响

机体剧烈运动时蛋白质加速分解导致其代谢终产物BUN水平升高，因此，BUN可作为机体疲劳的敏感指标^[21]。表1显示，与安静组比较，游泳的小鼠BUN水平均升高，除口腔缓释+敏化外，其他各处理及游泳对照均极显著高于安静组；与游泳对照组比较，各处理均不同程度抑制了BUN水平的升高，其值均低于游泳对照；与非敏化组比较，相同给药方式的敏化组均显著低于对应的非敏化组（P<0.05）；比较不同的给药方式发现，口腔缓释给药的敏化小鼠BUN水平极显著低于灌胃给药（P<0.01），但对非敏化组的BUN水平影响不显著(P>0.05)。

2.2.4　对血红蛋白的影响

Hb是氧运输的重要载体，剧烈运动导致的组织缺氧可引起Hb水平的降低，因此Hb水平也是衡量耐力的一个重要参数^[22，23]。表1显示，各游泳小鼠Hb水平均呈现降低的情况，其中游泳对照组极显著低于安静对照组（P<0.01）；各处理均抑制了Hb水平的降低；2个敏化组抑制效果明显，其Hb水平均显著高于对应的非敏化组（P<0.05）；口腔缓释+敏化组极显著高于灌胃+敏化组（P<0.01），但对非敏化小鼠的Hb水平影响不显著(P>0.05)。

2.3　槟榔碱对肌糖原、肝糖原及肌肉、肝脏中MDA的影响

机体剧烈运动时，肌糖原首先发生糖酵解供能致使其含量降低，然后工作肌摄取血糖引起肝糖原分解，肌糖原和肝糖原过量消耗引起中枢神经系统供能不足，发生机体疲劳现象^[15]。因此，作为能量物质的肌糖原和肝糖原水平与机体疲劳程度密切相关，是反映机体疲劳的重要指标。此外，MDA在肝脏和肌肉中的积累也影响机体疲劳。

2.3.1　对肌糖原和工作肌中MDA的影响

图4(a)显示，各游泳组肌糖原水平均极显著低于安静对照组（P<0.01）；各处理组均抑制了肌糖原的降低，其中口腔缓释+敏化组的肌糖原水平极显著高于游泳对照（P<0.01）；各敏化组肌糖原水平均高于非敏化组，且口腔缓释+敏化组肌糖原水平极显著高于2个非敏化组（P<0.01）；口腔缓释+敏化组肌糖原水平极显著高于灌胃给药+敏化组（P<0.01），但口腔缓释给药对非敏化小鼠的影响不显著(P>0.05)。图4 (b)显示，与安静对照组比较，各游泳组工作肌中的MDA水平均升高；与游泳对照组比较，4个处理组均缓解了MDA的积累，抑制了MDA水平的升高，其中口腔缓释+敏化组对MDA水平升高的抑制作用最强，其值显著低于游泳对照组（P<0.01）；口腔缓释+敏化组工作肌中的MDA水平极显著低于口腔缓释+非敏化组（P<0.01），但敏化处理对灌胃给药处理的小鼠影响不显著(P>0.05)；口腔缓释给药仅对敏化组小鼠影响较大（P<0.01），对非敏化组小鼠影响不明显(P>0.05)。由上述结果可知，槟榔碱能有效抑制敏化小鼠肌糖原的降低和工作肌膜脂过氧化作用，对小鼠疲劳有一定缓解作用。

2.3.2　对肝糖原和肝脏中MDA的影响

图5(a)显示，游泳运动不同程度地降低了小鼠的肝糖原水平，游泳对照组肝糖原水平最低；4个处理组均抑制了肝糖原水平的降低，其中口腔缓释+敏化组抑制效果最明显，其肝糖原水平极显著高于其他参与游泳运动的各组（P<0.01），且其值接近安静对照组（P>0.05），其次为灌胃+敏化组；2个敏化组肝糖原水平均极显著高于2个非敏化组（P<0.01）；相同的敏化/非敏化条件下，口腔缓释给药抑制肝糖原降低的作用优于灌胃给药（P<0.01）。

图5(b)显示，游泳运动不同程度地导致了MDA在肝脏中的积累，游泳对照组积累最严重；4个处理组均抑制了MDA的积累，其中口腔缓释+敏化组抑制效果最佳，其次为灌胃+敏化组，再次为口腔缓释+非敏化组，灌胃+非敏化组抑制效果最差。相同的敏化/非敏化条件下，口腔缓释给药抑制MDA积累的效果优于灌胃给药，但差异均不显著(P>0.05)。

以上数据表明敏化和口腔缓释给药可抑制肝脏中MDA的积累，缓解了游泳小鼠的机体疲劳。

2.4　槟榔碱对神经递质水平的影响

中枢神经递质失衡是导致机体疲劳的另一个重要因素。运动引起的神经递质5-HT和DA等浓度的变化会导致疲劳的发生^[9]，大脑内5-HT与DA的质量分数比值（w_5-HT/w_DA）与疲劳程度呈正相关^[24]。

2.4.1　对5-HT水平的影响

5-HT亦称血清素，是一种单胺类抑制性神经递质，可调节情绪、认知和社交能力^[25]。图6显示了槟榔碱对大脑和血液中5-HT浓度的影响。图6（a）显示，各游泳组大脑内5-HT水平均有不同程度升高，4个处理组均对5-HT水平的升高有抑制作用。4个处理组大脑内5-HT水平均极显著低于游泳对照（P<0.01），且敏化组大脑内5-HT水平均低于非敏化组，口腔缓释+敏化组大脑内5-HT水平显著低于非敏化组（P<0.05）；口腔缓释给药的敏化组小鼠大脑内5-HT水平显著低于灌胃给药的敏化组（P<0.05），但不同给药方式对非敏化组小鼠的影响不显著(P>0.05)。图6（b）显示，所有组的小鼠血液中5-HT水平差异均不显著(P>0.05)，5-HT水平由高到低顺序为：口腔缓释+敏化组、灌胃+敏化组、口腔缓释+非敏化组、灌胃+非敏化组、游泳对照组、安静对照组。比较4个处理小鼠大脑内和血液中的5-HT水平变化发现，口腔缓释+敏化组大脑内5-HT浓度降低而血液中5-HT浓度却升高，推测5-HT浓度的变化可能与血脑屏障通透性有一定的关系。

2.4.2　对DA水平的影响

DA是促进机体兴奋的神经递质，也具有扩张血管作用。DA可通过改变肺血管张力调节缺氧时肺毛细血管血容量，提高血液氧运输能力^[16，26]。图7显示了槟榔碱对大脑和血液中DA浓度的影响。图7（a）显示，各游泳组小鼠大脑内DA水平均极显著低于安静对照组（P<0.01）；各处理组大脑内DA水平均高于游泳对照组，其中口腔缓释+敏化组与之差异达到极显著水平（P<0.01）；敏化组DA水平均高于非敏化组；口腔缓释给药的敏化小鼠大脑内DA水平极显著高于灌胃给药的敏化小鼠（P<0.01），但不同给药方式对非敏化小鼠影响不明显(P>0.05)。图7（b）显示，各游泳组小鼠血液中DA水平均略高于安静对照组，所有6组小鼠之间差异均不显著（P>0.05）。分析认为，运动小鼠血液中DA水平升高可能与机体需要DA扩张肺血管促进氧运输有关，其机制需要进一步研究。

2.4.3　对w_5-HT/w_DA值的影响

神经递质之间存在复杂的协同和拮抗作用，中枢疲劳是多种神经递质共同作用的结果。w_5-HT/w_DA值是影响中枢疲劳的重要参数，低比值有利于机体兴奋，高比值导致机体疲劳^[27]。图8显示，各游泳组小鼠大脑内w_5-HT/w_DA值均高于安静对照组，表明游泳小鼠出现不同程度的疲劳现象；各处理组大脑内w_5-HT/w_DA值均低于游泳对照组，说明各处理缓解了小鼠疲劳；2个敏化组大脑内w_5-HT/w_DA值均低于非敏化组；口腔缓释+敏化组大脑内w_5-HT/w_DA值极显著低于灌胃+敏化组（P<0.01），但不同给药方式对非敏化小鼠的影响并不明显（P>0.05）。

2.5　槟榔碱对小鼠血脑屏障通透性的影响

血脑屏障通透性是维持脑微环境平衡的动态结构，在稳定中枢神经系统中扮演重要角色^[28]，只有血脑屏障通透性增加时EB才能穿越血脑屏障。图9显示，各处理组大脑内EB水平均高于安静组，而游泳对照组略低于安静对照，但不具有统计学意义（P>0.05），说明游泳运动并没有明显改变血脑屏障的通透性，各处理却不同程度地增加了血脑屏障通透性；各处理组大脑内EB水平均高于游泳对照组，且除灌胃+非敏化组外的3个处理组达到极显著差异水平（P<0.01）；2个敏化组均高于非敏化组；在相同的敏化/非敏化条件下，口腔缓释给药组均显著高于对应的灌胃给药组（P<0.05）。

3　 讨论与结论

疲劳是动物的一种自我保护机制，其综合表现为耐力下降甚至力竭，因此耐力可以作为评价疲劳的一个综合性指标。耐力通常用游泳力竭时间进行量化。本研究表明，槟榔碱可有效延长小鼠游泳力竭时间，且槟榔碱口腔缓释给药和行为敏化处理有利于延长小鼠游泳力竭时间。机体疲劳是一个复杂的生理生化过程，疲劳理论认为代谢产物堆积、Hb水平下降、能量物质耗竭和中枢神经递质失衡等是机体疲劳的主要原因^[10]。根据本文研究结果，槟榔碱可有效降低代谢产物的积累、抑制Hb水平降低、缓解能量物质耗竭、抑制中枢神经递质失衡并提高血脑屏障通透性。

1） 降低代谢产物积累。代谢产物积累是机体疲劳的一个重要因素。剧烈运动引发的糖原糖酵解反应造成BLA积累^[29]，使肌肉收缩力下降^[18]；剧烈运动时缺氧引发的脂质过氧化反应，破坏细胞膜生理功能，降低机体的工作能力 ^[19]。脂质过氧化反应的终产物MDA能够促进自由基产生^[20]，进一步降低其工作能力^[30]。另外，剧烈运动还会促进氨基酸和蛋白质的分解代谢，导致BUN积累^[31]。本研究发现槟榔碱通过口腔缓释给药能有效降低血液中BLA、MDA和BUN的积累以及肌肉和肝脏中MDA的积累。根据报道，槟榔碱能促进机体释放NO^[32]，而NO是血管张力的主要调节剂，可舒张血管^[33]，促进血液流动^[34]。因此，推测槟榔碱是通过增强机体释放NO，舒张血管，增加血流量，有效缓解机体缺氧，从而减弱因缺氧而引发的糖酵解和脂质过氧化反应，降低BLA和MDA的积累。槟榔碱增强机体释放NO而引起血管舒张的机理可能与Pan等^[35]报道蜂王浆通过增加NO的产生而引起血管舒张的机理相似。此外，槟榔碱抑制BUN水平的升高可能也与NO血管舒张有关，血管舒张提高了血流量，使机体排出BUN的速率增大，从而减少了BUN的积累。

2） 抑制Hb水平降低。本文实验数据显示，槟榔碱可显著抑制因剧烈运动引起的Hb水平的降低。根据报道^[23]，机体剧烈运动会引起红细胞载氧量增加，胞内氧分压升高，造成细胞膜损伤，甚至红细胞被破坏，红细胞的Hb被重新利用。因此，推测该结果也与NO血管舒张有关，槟榔碱通过增强机体释放NO，缓解机体缺氧，显著抑制细胞内氧分压升高，减弱红细胞的破坏，从而抑制Hb水平的降低。

3） 缓解能量物质耗竭。本研究发现，槟榔碱通过口腔缓释给药抑制剧烈运动小鼠肌糖原和肝糖原的降低。Dasgupta等^[36]报道槟榔碱能够提高小鼠糖原水平。因此，推测是由于槟榔碱提高了糖原水平，使游泳小鼠有充足的糖原可以利用，从而缓解了能量物质糖原的耗竭。

4） 抑制中枢神经递质失衡。槟榔碱是毒蕈碱和烟碱乙酰胆碱受体的部分激动剂，对中枢神经系统产生多种作用^[3]。实验数据显示，槟榔碱通过口腔缓释给药可有效抑制敏化小鼠大脑内5-HT和DA浓度的变化，并抑制w_5-HT/w_DA值的升高，说明槟榔碱具有稳定中枢神经递质平衡的作用。关于槟榔碱稳定中枢神经递质的平衡与毒蕈碱、烟碱乙酰胆碱受体的相关性及作用机制，还有待进一步探索。

5） 提高血脑屏障通透性。血脑屏障是脑组织和血液之间的一道对物质进出具有高度选择性的生理屏障，可避免脑遭受有害的血源性、内源性和外源性物质的侵害。一些化合物如人参皂苷、谷氨酸和冰片等，可提高血脑屏障通透性，增强血脑屏障通透性^[28]。本研究发现，槟榔碱可增强血脑屏障通透性，敏化处理和口腔缓释给药方式均有利于提高槟榔碱调控血脑屏障通透性的性能。结合槟榔碱对5-HT水平影响的数据发现，当小鼠大脑内5-HT浓度降低时血液中5-HT浓度反而升高，且其趋势与槟榔碱调控血脑屏障通透性的趋势基本一致，说明大脑和血液中5-HT浓度的变化与血脑屏障通透性相关。分析认为，槟榔碱抗疲劳机理可能是通过增强血脑屏障通透性，促使大脑内5-HT扩散到血液中，使大脑内5-HT水平降低，从而减弱5-HT对机体兴奋的抑制作用，即促使机体兴奋。但是，大脑内和血液中DA的变化并没有表现出相似的趋势，其机制仍需要进一步探索。

综上所述，槟榔碱通过降低代谢产物的积累、抑制Hb水平降低、缓解能量物质耗竭、抑制中枢神经递质失衡和提高血脑屏障通透性等活性发挥抗疲劳作用，行为敏化处理和口腔缓释给药有利于提高槟榔碱的抗疲劳作用效果。本研究有望为研发高效抗疲劳的槟榔碱新产品提供理论支撑。

参考文献

[1] CHEN X X， HE Y Z， DENG Y R. Chemical composition， pharmacological， and toxicological effects of betel nut［J］. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine， 2021： 1808081. DOI： 10.1155/2021/1808081 .

[2] PENG W， LIU Y J， WU N， et al. Areca catechu L. （Arecaceae）： A review of its traditional uses， botany， phytochemistry， pharmacology and toxicology［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2015， 164： 340-356. DOI： 10.1016/j.jep.2015.02.010 .

[3] VOLGIN A D， BASHIRZADE A， AMSTISLAVSKAYA T G， et al. DARK classics in chemical neuroscience： Arecoline［J］. ACS Chemical Neuroscience， 2019， 10（5）： 2176-2185. DOI： 10.1021/acschemneuro.8b00711 .

[4] PAPKE R L， BHATTACHARYYA I， HATSUKAMI D K， et al. Betel nut （areca） and smokeless tobacco use in Myanmar［J］. Substance Use & Misuse， 2020， 55（9）： 1385-1394. DOI： 10.1080/10826084.2019.1624774 .

[5] LECHNER M， BREEZE C E， VAZ F， et al. Betel nut chewing in high-income countries-lack of awareness and regulation［J］. The Lancet Oncology， 2019， 20（2）： 181-183. DOI：10.1016/s1470-2045（18）30911-2 .

[6] GUPTA A K， TULSYAN S， THAKUR N， et al. Chemistry， metabolism and pharmacology of carcinogenic alkaloids present in areca nut and factors affecting their concentration［J］. Regulatory Toxicology and Pharmacology， 2020， 110： 104548. DOI： 10.1016/j.yrtph.2019.104548 .

[7] MARQUES M M， BELAND F A， LACHENMEIER D W， et al. Carcinogenicity of acrolein， crotonaldehyde， and arecoline［J］. The Lancet Oncology， 2021， 22（1）： 19-20. DOI： 10.1016/S1470-2045（20）30727-0 .

[8] LIU Y J， PENG W， HU M B， et al. The pharmacology， toxicology and potential applications of arecoline： A review［J］. Pharmaceutical Biology， 2016， 54（11）： 2753-2760. DOI： 10.3109/13880209.2016.1160251 .

[9] MEEUSEN R， WATSON P. Amino acids and the brain： Do they play a role in “central fatigue”［J］. International Journal of Sport Nutrition and Exercise Metabolism， 2007， 17（s1）： S37-S46. DOI： 10.1123/ijsnem.17.s1.s37 .

[10] HU M H， HAN M X， ZHANG H， et al. Curcumin （CUMINUP60®） mitigates exercise fatigue through regulating PI3K/Akt/AMPK/mTOR pathway in mice［J］. Aging， 2023， 15（6）： 2308-2320. DOI： 10.18632/aging.204614 .

[11] LIU S W， MENG F N， ZHANG D， et al. Lonicera caerulea berry polyphenols extract alleviates exercise fatigue in mice by reducing oxidative stress， inflammation， skeletal muscle cell apoptosis， and by increasing cell proliferation［J］. Frontiers in Nutrition， 2022， 9： 853225. DOI： 10.3389/fnut.2022.853225 .

[12] MEEUSEN R， ROELANDS B. Fatigue： Is it all neurochemistry？［J］. European Journal of Sport Science， 2018， 18（1）： 37-46. DOI： 10.1080/17461391.2017.1296890 .

[13] 姚敏， 吴宁， 宋睿， 等. 大麻二酚对甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化及条件性位置偏爱的影响［J］. 中国药理学与毒理学杂志， 2023， 37（1）： 14-23. DOI： 10.3867/j.issn.1000-3002.2023.01.002 .

[14] YAO M， WU N， SONG R， et al. Effect of cannabidiol on behavioral sensitization and conditioned place preference induced by methamphetamine in mice［J］. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology， 2023， 37（1）： 14-23. DOI： 10.3867/j.issn.1000-3002.2023.01.002（Ch ）.

[15] 刘书伟， 王燕， 都二霞， 等. L-抗坏血酸对槟榔处理小鼠抗疲劳作用协同增效研究［J］. 食品科技， 2016， 41（9）： 112-116. DOI： 10.13684/j.cnki.spkj.2016.09.022 .

[16] LIU S W， WANG Y， DU E X， et al. Synergies of L-ascorbic acid and betelnut in mice’s anti-fatigue［J］. Food Science and Technology， 2016， 41（9）： 112-116. DOI： 10.13684/j.cnki.spkj.2016.09.022（Ch ）.

[17] 郭云聪. 薏苡仁油对过度运动大鼠的抗疲劳作用及免疫功能改善效果的研究［J］. 家畜生态学报， 2023， 44（5）： 59-64.

[18] GUO Y C. Anti-fatigue and immune function improvement of coix seed oil on excessive exercise rats［J］. Journal of Domestic Animal Ecology， 2023， 44（5）： 59-64 （Ch）.

[19] 余煊. 基于脑内5-HT探讨太子神悦抗抑郁的作用机制［D］. 北京： 清华大学， 2017.

[20] YU X. Explore the mechanism of anti-depressant TZ based on 5-HT in the brain［D］.Beijing： Tsinghua University， 2017 （Ch）.

[21] 郑文旭， 张保朝， 李富慧， 等. 补阳还五汤对线栓大鼠模型脑损伤和血脑屏障通透性的影响［J］. 中西医结合心脑血管病杂志， 2023， 21（2）： 276-282. DOI： 10.12102/j.issn.1672-1349.2023.02.014 .

[22] ZHENG W X， ZHANG B C， LI F H， et al. Effects of Buyang Huanwu Decoction on brain injury and blood brain barrier permeability in MCAO rats［J］. Chinese Journal of Integrative Medicine on Cardio-Cerebrovascular Disease， 2023， 21（2）： 276-282. DOI： 10.12102/j.issn.1672-1349.2023.02.014（Ch ）.

[23] GANG R， NAGARAJAN S M， ANANDHAN P. Mechanism of the effect of traditional Chinese medicine fumigation on blood lactic acid in exercise body［J］. Journal of Ambient Intelligence and Humanized Computing， 2021， 12（3）： 3295-3301. DOI： 10.1007/s12652-020-02356-6 .

[24] ZHU Y， GONG P， WANG J， et al. Amplification of lipid peroxidation by regulating cell membrane unsaturation to enhance chemodynamic therapy［J］. Angewandte Chemie International Edition， 2023， 62（12）： e202218407. DOI： 10.1002/anie.202218407 .

[25] AKBARI B， NAJAFI F， BAHMAEI M， et al. Modeling and optimization of malondialdehyde （MDA） absorbance behavior through response surface methodology （RSM） and artificial intelligence network （AIN）： An endeavor to estimate lipid peroxidation by determination of MDA［J］. Journal of Chemometrics， 2023， 37（4）： e3468. DOI： 10.1002/cem.3468 .

[26] COQUEIRO A Y， RAIZEL R， BONVINI A， et al. Effects of glutamine and alanine supplementation on central fatigue markers in rats submitted to resistance training［J］. Nutrients， 2018， 10（2）： 119. DOI： 10.3390/nu10020119 .

[27] CAI R L， YANG M H， SHI Y， et al. Antifatigue activity of phenylethanoid-rich extract from Cistanche deserticola ［J］. Phytotherapy Research， 2010， 24（2）： 313-315. DOI： 10.1002/ptr.2927 .

[28] 张军. 槐米、Vc对小鼠某些生化指标及运动能力影响的实验研究［D］. 西安： 陕西师范大学， 2001.

[29] ZHANG J. Experimental study on the effects of Flos·Sophorae and Vc on some biochemical targets and exercise performance in mice［D］. Xi’an： Shaanxi Normal University， 2001 （Ch）.

[30] LEITE L H R， RODRIGUES A G， SOARES D D， et al. Central fatigue induced by losartan involves brain serotonin and dopamine content［J］. Medicine and Science in Sports and Exercise， 2010， 42（8）： 1469-1476. DOI： 10.1249/MSS.0b013e3181d03d36 .

[31] JANG S， PARK I， CHOI M， et al. Impact of the circadian nuclear receptor REV-ERBα in dorsal raphe 5-HT neurons on social interaction behavior， especially social preference［J］. Experimental & Molecular Medicine， 2023， 55（8）： 1806-1819. DOI： 10.1038/s12276-023-01052-7 .

[32] MICHAELCHUK W W， TEDJASAPUTRA V， BRYAN T L， et al. The effect of dopamine on pulmonary diffusing capacity and capillary blood volume responses to exercise in young healthy humans［J］. Experimental Physiology， 2019， 104（12）： 1952-1962. DOI： 10.1113/EP088056 .

[33] MEEUSEN R， ROELANDS B. Central fatigue and neurotransmitters， can thermoregulation be manipulated？［J］. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports， 2010， 20： 19-28. DOI： 10.1111/j.1600-0838.2010.01205.x .

[34] ZHAO Y B， GAN L， REN L， et al. Factors influencing the blood-brain barrier permeability［J］. Brain Research， 2022， 1788： 147937. DOI： 10.1016/j.brainres.2022.147937 .

[35] DING J F， LI Y Y， XU J J， et al. Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation［J］. Food Hydrocolloids， 2011， 25（5）： 1350-1353. DOI： 10.1016/j.foodhyd.2010.12.013 .

[36] GASCHLER M M， STOCKWELL B R. Lipid peroxidation in cell death［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2017， 482（3）： 419-425. DOI： 10.1016/j.bbrc.2016.10.086 .

[37] ZHU M J， ZHU H Z， DING X M， et al. Analysis of the anti-fatigue activity of polysaccharides from Spirulina platensis： Role of central 5-hydroxytryptamine mechanisms［J］. Food & Function， 2020， 11（2）： 1826-1834. DOI： 10.1039/c9fo02804h .

[38] WU C Y， LIN W R， JENG C J， et al. Arecoline increases the production of nitric oxide and post-translational S-nitrosoproteome in endothelial cells［J］. Current Proteomics， 2020， 17（3）： 172-179.DOI： 10.2174/1570164617666191003112053 .

[39] DRAGHICI A E， ELY M R， HAMNER J W， et al. Nitric oxide-mediated vasodilation in human bone［J］. Microcirculation， 2024， 31（2）： e12842. DOI： 10.1111/micc.12842 .

[40] GHIMIRE K， ALTMANN H M， STRAUB A C， et al. Nitric oxide： What’s new to NO？［J］. American Journal of Physiology-Cell Physiology， 2017， 312（3）： C254-C262. DOI： 10.1152/ajpcell.00315.2016 .

[41] PAN Y M， RONG Y L， YOU M M， et al. Royal jelly causes hypotension and vasodilation induced by increasing nitric oxide production［J］. Food Science & Nutrition， 2019， 7（4）： 1361-1370. DOI： 10.1002/fsn3.970 .

[42] DASGUPTA R， SAHA I， RAY P P， et al. Arecoline plays dual role on adrenal function and glucose-glycogen homeostasis under thermal stress in mice［J］. Archives of Physiology and Biochemistry， 2020， 126（3）： 214-224. DOI： 10.1080/13813455.2018.1508238 .

基金资助

海南省科技专项(ZDYF2022XDNY172)

海南省自然科学基金(321RC589)

海南省自然科学基金(423MS052)

海南省教育厅重点项目(Hnjg2023ZD-38)

海南热带海洋学院科研启动项目(RHDRC202007)