纳米氧化锌/土霉素共暴露对抗生素抗性基因水平转移的影响

Effects of Nano-Zinc Oxide and Oxytetracycline co-Exposure on Horizontal Transfer of Antibiotic Resistance Genes

摘要

以抗生素抗性基因（ARGs）水平转移中的接合转移为例，研究了氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）与土霉素（OTC）共暴露对ARGs在属内和属间细菌中接合频率的影响，探讨了共暴露影响ARGs接合转移的机制。研究显示，1 mg/L ZnONPs和20 μg/L OTC共暴露分别使属内和属间细菌接合频率提高2.08倍和2.34倍，显著大于单独暴露；共暴露增加胞内活性氧生成、细胞膜通透性和胞外聚合物分泌，同时增加接合相关基因和降低负调控基因的表达。结果表明，纳米材料与抗生素共残留可能加剧环境中细菌耐药性传播的风险。

Abstract

Taking the conjugative transfer of antibiotic resistance genes (ARGs) as an example for horizontal gene transfer, the effects of zinc oxide nanoparticles (ZnONPs) and oxytetracycline (OTC) co-exposure on the ARGs conjugative transfer frequency within the same bacterial genus (intra-genus) and across different genera (inter-genus) were investigated. Further, the mechanisms by which co-exposure influences the conjugative transfer were explored. The results showed that the co-exposure of 1 mg/L ZnONPs and 20 μg/L OTC increased intra-genus and inter-genus conjugation frequencies by 2.08-fold and 2.34-fold, respectively, which was significantly higher than the individual exposures. The co-exposure elevated intracellular reactive oxygen species (ROS) generation, enhanced cell membrane permeability, promoted extracellular polymeric substance secretion, and upregulated conjugation-related genes while downregulating negative regulatory genes. These results indicate that the nanomaterials and antibiotics co-residue in environments may exacerbate the risk of bacterial resistance transmission.

Graphical abstract

0　 引 言

养殖行业中广泛使用抗生素防止细菌性疾病爆发，大量抗生素被混入饲料或直接投入水体。水体中抗生素的残留对其中的微生物造成选择压力，诱导耐药菌的出现以及微生物产生抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）^[1]。ARGs在环境中会通过垂直转移和水平转移进行扩散传播，在“同一健康”框架下，通过食物链传播最终会给人类健康带来风险^[2-3]。

近年来，纳米技术在养殖行业得到广泛应用。一些纳米材料能够增强动物对饲料营养元素的吸收，用作载体可以提高动物疫苗、兽药的效果^[4]。纳米氧化锌颗粒（ZnONPs）作为优质锌源，可替代传统的醋酸锌添加到饲料中，提高营养物消化吸收，促进养殖动物肠道健康和改善免疫功能，从而有效促进畜禽生长^[5]。但同时，纳米材料的环境残留对ARGs传播的影响也引起人们广泛关注，如环境相关浓度下的纳米银（AgNPs）促进了质粒携带的ARGs在细菌间的接合转移^[6]，ZnONPs使质粒携带的ARGs在大肠杆菌中的转化频率提高了1.5~1.8倍^[7]。

目前，有关纳米材料与抗生素在环境中共残留对ARGs水平转移影响研究还十分有限。基于此，本研究选用养殖业常用的土霉素（OTC）和ZnONPs，建立细菌属内和属间接合转移体系，探究其共暴露对接合转移的影响及机理。本文研究结果可望为抗生素和纳米材料在养殖中的合理应用以及ARGs的污染管控提供科学依据。

1　 实验部分

1.1　菌株、试剂和仪器

供体菌为含RP4质粒的大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α(RP4)，RP4质粒携带卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）和四环素（Tet）抗性基因；属内受体菌为携带链霉素（Str）抗性基因的E.coli HB101，属间受体菌为携带氯霉素（Chl）抗性基因的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida (P.putida)KT2440，受体菌携带的抗性基因均位于染色体上。以上3种菌株均购自北京百欧博伟生物技术公司。

实验所用的纳米ZnO颗粒（粒径30 nm，ZnONPs）、OTC、Kan、Str、Amp、Tet、Chl、碘化丙啶（PI）以及二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）均购自阿拉丁试剂公司；培养基成分中的琼脂粉购自BioFroxx公司，蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；蛋白定量采用碧云天公司提供的增强型BCA蛋白检测试剂盒；逆转录反应使用普洛麦格（北京）生物技术有限公司的GoScript™逆转录系统；细菌总RNA提取与质粒抽提分别使用天根生化科技（北京）公司的RNAprep Pure培养细菌RNA提取试剂盒和TIANprep Mini Plasmid Kit质粒提取试剂盒；Super Red核酸染料来自北京擎科生物科技有限公司；化学试剂均为分析纯。

实验所用仪器有C1000型PCR仪和Gel Doc XR+型凝胶成像仪（BIO-RAD公司）；Light Cycler 480 Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（Roche Scientific公司）；SpcctraMaxiD3型多功能酶标仪（美谷分子公司）；F-4700型荧光分光光度计（日本电子株式会社）；722N可见光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2　接合实验

将供体菌E.coli DH5α(RP4)在含100 mg/L Amp、40 mg/L Kan和20 mg/L Tet的液体LB培养基中于37 ℃、160 r/min条件下振荡培养18 h；属内受体菌E.coli HB101在含40 mg/L Str的液体LB培养基中培养14 h；属间受体菌P.putida KT2440在含50 mg/L Chl的液体LB培养基中培养18 h。以4 500 r/min转速离心收集菌体，使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次，将细菌重新悬浮于PBS中，调整其浓度至1×10⁸ CFU/mL。将等比例的供体菌株与受体菌株混合后，分别添加不同终浓度的OTC溶液（0、2、20、200 µg/L）以及1 mg/L ZnONPs溶液。混合体系在37 ℃条件下孵育8 h，取适量混合液用培养液稀释，分别涂布于以下筛选平板上：含Tet（20 mg/L）、Str（40 mg/L）、Kan（40 mg/L）和 Amp（100 mg/L）的属内接合子筛选平板；含Str（40 mg/L）的属内受体菌筛选平板；含Tet（20 mg/L）、Chl（50 mg/L）、Kan（40 mg/L）和Amp（100 mg/L）的属间接合子筛选平板；含Chl（50 mg/L）的属间受体菌筛选平板。上述体系于37 ℃培养48~72 h，对菌落进行计数。以加PBS的接合体系作为对照组，每个处理组做3个重复。将接合子（CFU/mL）与受体菌（CFU/mL）的菌落数之比定义为接合频率。

1.3　接合电泳验证实验

为验证RP4质粒成功转移，随机挑取属内和属间接合体系的供体、受体及接合子菌株中的单菌落，培养至对数期后，使用TIAN prep Mini Plasmid Kit试剂盒提取质粒DNA，通过PCR扩增RP4质粒特定片段（引物序列见表1）并进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统记录DNA条带。

1.4　细菌胞内活性氧测定

将浓度为1×10⁸ CFU/mL的供、受体菌分别与OTC和ZnONPs于37 ℃共培养4 h，随后将菌体离心并重悬于无菌水中，加入终浓度为50 μmol/L的DCFH-DA染料溶液，避光条件下于37 ℃孵育45 min，再次离心，并用PBS清洗两次以去除未结合的染料。使用激发波长450 nm、发射波长535 nm的条件检测细胞内荧光强度^[8]。以无菌水处理组作为阴性对照，每种处理设置3个生物学重复。

1.5　细菌细胞膜通透性测定

将培养至对数生长期的供体菌与受体菌离心收集后，使用0.9%NaCl溶液调整浓度至1.0×10⁸ CFU/mL，添加不同浓度的OTC与ZnONPs，于37 ℃孵育4 h后，加入终浓度为30 μmol/L的PI染料，并在避光条件下于室温孵育40 min。在激发波长535 nm、发射波长620 nm条件下测定荧光强度。以无菌水代替药物作为对照组，所有试验均进行3次生物重复。

1.6　细菌胞外聚合物测定

将对数期供体菌和受体菌，离心后收集菌体，用PBS调至浓度为1×10⁸ CFU/mL，加入OTC与ZnONPs，培养4 h。将上述菌悬液放入60 ℃的水浴锅中加热30 min，然后将菌液在5 000 r/min离心10 min，用0.22 μm滤膜过滤上清液，得到胞外聚合物（EPS）溶液^[9]。

采用硫酸-苯酚法测定EPS中多糖含量^[10]。将 1 mL EPS溶液与2 mL 6%苯酚混合，加入5 mL 98%浓硫酸，在90 ℃水浴锅中孵育20 min。冷却至室温，采用多功能酶标仪测定490 nm处光密度（OD）值。同时使用葡萄糖溶液按照相同步骤，进行多糖标准曲线的测定，每个处理进行3个生物学重复。

采用BCA法测定EPS的蛋白含量^[11]。取20 μL EPS溶液与200 μL BCA工作液充分混合，在37 ℃条件下孵育30 min，使用多功能酶标仪测定562 nm处的OD值。同时使用标准蛋白溶液按照相同步骤绘制蛋白标准曲线，每个处理进行3个生物学重复。

1.7　接合相关基因表达检测

在供体菌和两种受体菌中分别加入20 µg/L OTC、1 mg/L ZnONPs和1 mg/L ZnONPs+20 µg/L OTC（均为终浓度），培养8 h，收集菌体。提取细菌总RNA，在RNA的纯度和浓度达到要求后，立即将总RNA逆转录成cDNA，cDNA浓度在20~50 ng/μL即可。对cDNA进行实时逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）反应（引物序列见表2），反应条件与文献^[12]一致；利用2^{-ΔΔCt [13]}计算各处理组中接合相关基因的相对表达量，16S rRNA作为内参基因，每个处理进行3个生物学重复。

1.8　数据统计分析

采用 SPSS Statistics 26.0软件进行方差分析（ANOVA），用于评估各组间的显著性差异。统计结果中，“*”表示P<0.05，差异具有统计学意义；“**”表示P<0.01，为极显著差异；“ns”表示不存在显著差异。图片使用GraphPadPrism 9.5绘制。

2　 结果与讨论

2.1　ZnONPs/OTC共暴露对接合频率的影响

环境浓度（2~200 μg/L）的OTC和1 mg/L ZnONPs共暴露对属内和属间细菌接合频率的影响如图1所示。

图1(a)显示，在属内接合体系中，单独OTC处理时，对接合频率的影响随着浓度提升先增高后下降，OTC浓度为20 μg/L时，接合频率达到最大，为对照组的1.55倍。ZnONPs的加入使接合频率增大，且在OTC浓度为20 μg/L时达到最高，为对照组的2.08倍，分别是ZnONPs单独处理组和OTC单独处理组的1.32和1.34倍。图1(b)显示，ZnONPs/OTC对属间接合频率的影响与属内接合体系类似，但普遍低于属内的接合频率。20 μg/L OTC+1 mg/L ZnONPs共暴露时接合频率是对照组的2.34倍，分别是ZnONPs单独处理组和OTC单独处理组的1.42倍和1.28倍。图1(c)(d)显示，在属内受体菌E.coli HB101和属间受体菌P.putida KT2440中提取的质粒扩增后无条带，而不同处理组的接合子质粒扩增后在1 500~2 000 bp处有明显条带，证实了接合转移的发生。以上结果说明，ZnONPs/OTC共暴露促进属内和属间细菌的ARGs的接合转移；相对于单独暴露，在特定浓度下共暴露显著提高了接合转移水平。

Wang等^[14]研究发现，ZnONPs在0.1~10 mg/L能促进E.coli携带RP4耐药质粒向多种水体中自然存在菌群的接合转移，使接合频率最高达到对照组的8.3倍；Lin等^[15]的研究表明，OTC或3种重金属暴露以及OTC分别与3种重金属共暴露，都会促进外源ARGs向热带爪蟾肠道微生物菌群水平转移，是对照组1.07~1.28倍，共暴露组均大于单独OTC暴露组。本文研究结果与这些结果类似。

2.2　ZnONPs/OTC共暴露对细菌胞内活性氧的影响

外界压力会促进细菌细胞产生活性氧（ROS），当ROS水平超过细菌的抗氧化能力，会氧化脂质、蛋白质等生物大分子，从而破坏细菌细胞膜结构，影响ARGs的水平转移^[16]，如天然闪锌矿纳米颗粒通过提高细菌胞内ROS水平促进结核的发生^[17]。

图2为ZnONPs/OTC共暴露对供体菌和受体菌胞内ROS的影响。图2(a)显示，在OTC单独暴露下，荧光强度相对于对照组极显著增加，表明胞内ROS水平明显上升；加入ZnONPs后，胞内ROS水平在OTC浓度为20 μg/L时显著增加，分别是OTC和ZnONPs单独暴露时的1.02和1.15倍。由图2(b)(c)可知，对于两种受体菌，在20 μg/L OTC+1 mg/L ZnONPs共暴露时ROS水平显著高于单独暴露时的ROS水平。以上结果表明，在OTC浓度达到20 μg/L时，与ZnONPs共暴露，显著增加供、受体菌中胞内ROS水平，从而促进ARGs的接合转移。

2.3　ZnONPs/OTC共暴露对细菌细胞膜通透性的影响

细胞膜是细菌阻止外界物质包括DNA进入体内的屏障，当细胞膜通透性增加时，会促进ARGs在细菌间的水平转移^[18]。已有研究证实，细胞膜通透性的增加是纳米Fe₂O₃促进ARGs在P.putida KT2442向水体微生物菌群接合转移的重要机制^[19]。

图3为ZnONPs/OTC共暴露对接合供/受体菌细胞膜通透性的影响。如图3所示，对于供体菌，单独OTC暴露显著提高了细胞膜通透性，加入ZnONPs后没有显著改变膜通透性；两种受体菌暴露于20 μg/L OTC+1 mg/L ZnONPs时，其膜通透性显著高于两者单独暴露。以上结果说明，ZnONPs/OTC在特定浓度下共暴露通过增大细胞膜通透性影响ARGs的接合转移。

2.4　ZnONPs/OTC共暴露对细菌胞外聚合物影响

细菌分泌的EPS主要由多糖和蛋白质组成，EPS可以增加细菌细胞间交联，从而促进遗传物质的交换^[20]。纳米CeO₂能促进细菌胞外多糖的分泌，通过增加细胞间的接触，增强ARGs的水平转移^[21]。

图4显示了ZnONPs/OTC共暴露后细菌分泌EPS的变化。供体菌在20~200 μg/L OTC（图4(a)）、受体菌在2~200 μg/L OTC（图4(b)(c)）单独处理时，EPS水平均显著上升；ZnONPs的加入极显著地增加了OTC浓度为2和20 μg/L时供、受体菌的EPS水平。以上结果表明，ZnONPs/OTC共暴露会使供、受体菌产生更多EPS，从而促进ARGs的接合转移。

2.5　接合相关基因表达变化

为进一步研究ZnONPs/OTC共暴露促进ARGs接合转移的机制，测定了1 mg/L ZnONPs+20 μg/L OTC共处理后供、受体菌中与接合转移相关的接合调控基因、膜通透性相关基因、ROS和氧化应激相关基因以及DNA复制转移基因的表达水平。

如图5所示，在接合调控基因中，ZnONPs/OTC共暴露抑制供、受体菌株的接合负调控相关基因korA、korB和trbA的表达量，相对于单独暴露，在属间受体菌中抑制程度更高；ZnONPs/OTC共暴露使接合过程中第一步配对形成相关基因traF和trbBp在受体菌中均有不同程度增加，且trbBp基因在属内接合供、受体菌株中的表达量高于单独处理组。在细胞膜通透性相关基因中，共暴露使供体菌的ompF和ompA的表达量显著高于单独处理组，ompC在属内供、受体菌的表达水平明显高于单独暴露。与ROS和氧化应激反应相关的基因中，ZnONPs/OTC共暴露使供体菌的soxS、属内受体菌的oxyR、soxS和lexA和属间受体菌的lexA表达上升。供体菌和受体菌中多糖和蛋白分泌合成相关基因waaA和secD的表达量在ZnONPs/OTC共处理组均显著增加。共暴露还使DNA复制转移相关基因trfAP在属内接合供、受体菌中表达上升，使trfG在两种受体菌中表达均高于单独暴露。

以上结果表明，ZnONPs/OTC共暴露通过下调接合负调控基因的表达量，上调细胞膜通透性相关基因、ROS生成相关基因、多糖和蛋白合成分泌相关基因以及DNA复制转移相关基因的表达量，促进细菌间遗传物质的接合转移。

3　 结 语

本文通过测定ZnONPs与OTC共暴露对ARGs在属内和属间细菌中的接合频率以及共暴露后供、受体菌细胞膜通透性、ROS水平及接合相关基因的表达，探讨了共暴露对ARGs在细菌之间接合转移的影响及机制。结果表明，共暴露对ARGs接合转移的影响与浓度有关，在环境相关浓度的OTC（20 μg/L）和ZnONPs（1 mg/L）共暴露下，ARGs在属内和属间细菌间的接合转移明显增加，显著高于单独组分暴露。ZnONPs/OTC共暴露促进接合转移的机制主要包括促进供、受体菌胞内ROS生成、增大细胞膜通透性、增加细菌分泌EPS以及增加接合相关基因表达水平和降低接合负调控基因的表达量。本研究结果表明，环境中抗生素与纳米材料的共残留可能加剧ARGs的水平传播风险。因此，在水产养殖等行业使用纳米材料作为添加剂时，应充分关注其与抗生素共残留可能引发的抗生素耐药性传播问题，以降低潜在的生态与公共健康风险。

参考文献

[1] MADDAMSETTI R， YAO Y， WANG T， et al. Duplicated antibiotic resistance genes reveal ongoing selection and horizontal gene transfer in bacteria［J］. Nature Communications， 2024， 15（1）： 1449. DOI：10.1038/s41467-024-45638-9 .

[2] ZHAO C D， SUYAMUD B， YUAN Y， et al. Effect of non-antibiotic factors on conjugative transfer of antibiotic resistance genes in aquaculture water［J］. Journal of Hazardous Materials， 2025， 483： 136701. DOI：10.1016/j.jhazmat.2024.136701 .

[3] WANG C， SONG Y Z， LIANG J X， et al. Antibiotic resistance genes are transferred from manure-contaminated water bodies to the gut microbiota of animals through the food chain［J］. Environmental Pollution， 2024， 363： 125087. DOI：10.1016/j.envpol.2024.125087 .

[4] VIJAYARAM S， TSIGKOU K， ZUORRO A， et al. Inorganic nanoparticles for use in aquaculture［J］. Reviews in Aquaculture， 2023， 15（4）： 1600-1617. DOI：10.1111/raq.12803 .

[5] YAQUB A， NASIR M， KAMRAN M， et al. Immunomodulation， fish health and resistance to staphylococcus aureus of Nile tilapia （oreochromis niloticus）fed diet supplemented with zinc oxide nanoparticles and zinc acetate［J］. Biological Trace Element Research， 2023， 201（10）： 4912-4925. DOI：10.1007/s12011-023-03571-w .

[6] LU J， WANG Y， JIN M， et al. Both silver ions and silver nanoparticles facilitate the horizontal transfer of plasmid-mediated antibiotic resistance genes［J］. Water Research， 2020， 169： 115229. DOI：10.1016/j.watres.2019.115229 .

[7] MARKOWICZ A， BORYMSKI S， ADAMEK A， et al. The influence of ZnO nanoparticles on horizontal transfer of resistance genes in lab and soil conditions［J］. Environmental Research， 2023， 223： 115420. DOI：10.1016/j.envres.2023.115420 .

[8] ZHANG Y， LI W J， WU Y S， et al. Chitosan oligosaccharide accelerates the dissemination of antibiotic resistance genes through promoting conjugative plasmid transfer［J］. Journal of Hazardous Materials， 2024， 469： 133922. DOI：10.1016/j.jhazmat.2024.133922 .

[9] ZHENG J R， WANG S F， GONG Q， et al. Fate of antibiotic resistance genes and EPS defence mechanisms during simultaneous denitrification and methanogenesis， coupled with the biodegradation of multiple antibiotics under zinc stress［J］. Water Research， 2024， 261： 121996. DOI：10.1016/j.watres.2024.121996 .

[10] LIU X M， LI Y， TANG J C， et al. Nano-and microplastics aided by extracellular polymeric substances facilitate the conjugative transfer of antibiotic resistance genes in bacteria［J］. ACS ES&T Water， 2022， 2（12）： 2528-2537. DOI：10.1021/acsestwater.2c00330 .

[11] LI Y， WANG J， LI B Y， et al. Response of extracellular polymeric substances and microbial community structures on resistance genes expression in wastewater treatment containing copper oxide nanoparticles and humic acid［J］. Bioresource Technology， 2021， 340： 125741. DOI：10.1016/j.biortech.2021.125741 .

[12] HAN Y， YIN L H， LU Z， et al. Size and surface charge of Ag particles influence the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via transformation［J］. Journal of Environmental Chemical Engineering， 2023， 11（5）： 111087. DOI：10.1016/j.jece.2023.111087 .

[13] JAVANMARD S H， VASEGHI G， GHASEMI A， et al. Therapeutic inhibition of microRNA-21（miR-21） using locked-nucleic acid （LNA）-anti-miR and its effects on the biological behaviors of melanoma cancer cells in preclinical studies［J］. Cancer Cell International， 2020， 20（1）： 384. DOI：10.1186/s12935-020-01394-6 .

[14] WANG X L， YANG F X， ZHAO J， et al. Bacterial exposure to ZnO nanoparticles facilitates horizontal transfer of antibiotic resistance genes［J］. NanoImpact， 2018， 10：61-67. DOI：10.1016/j.impact.2017.11.006 .

[15] LIN X J， ZHANG C N， HAN R Q， et al. Oxytetracycline and heavy metals promote the migration of resistance genes in the intestinal microbiome by plasmid transfer［J］. The ISME Journal， 2023， 17（11）： 2003-2013. DOI：10.1038/s41396-023-01514-w .

[16] WANG H Q， XU Y T， LIANG Z D， et al. Charged nanoplastics differentially affect the conjugative transfer of antibiotic resistance genes［J］. Environmental Science： Nano， 2023， 10（9）： 2273-2285. DOI：10.1039/d3en00229b .

[17] LI G Y， CHEN X F， YIN H L， et al. Natural sphalerite nanoparticles can accelerate horizontal transfer of plasmid-mediated antibiotic-resistance genes［J］. Environment International， 2020， 136： 105497. DOI：10.1016/j.envint.2020.105497 .

[18] WANG T T， XU Y X， LING W T， et al. Dissemination of antibiotic resistance genes is regulated by iron oxides： Insight into the influence on bacterial transformation［J］. Environment International， 2024， 185： 108499. DOI：10.1016/j.envint.2024.108499 .

[19] PU Q， FAN X T， SUN A Q， et al. Co-effect of cadmium and iron oxide nanoparticles on plasmid-mediated conjugative transfer of antibiotic resistance genes［J］. Environment International， 2021， 152： 106453. DOI：10.1016/j.envint.2021.106453 .

[20] WU Z C， KANG J， MAO L Y， et al. Deciphering bioprocess responses in organic phosphorus mineralization to different antibiotic stresses： Interaction mechanisms mediated by microbial succession and extracellular polymeric substances and regulatory patterns［J］. Bioresource Technology， 2025， 417： 131874. DOI：10.1016/j.biortech.2024.131874 .

[21] YU K Q， CHEN F R， YUE L， et al.CeO₂ nanoparticles regulate the propagation of antibiotic resistance genes by altering cellular contact and plasmid transfer［J］. Environmental Science & Technology， 2020， 54（16）： 10012-10021. DOI：10.1021/acs.est.0c01870 .