香菇多糖通过ROS/NF-κB通路改善IL-1β诱导的软骨细胞基质降解

Lentinan ameliorates IL-1β-induced matrix degradation of chondrocytes via the ROS/NF-κB pathway

摘要

目的 探讨香菇多糖（LNT）对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的软骨细胞的作用及机制。 方法 采用CCK-8法检测不同浓度LNT（0、50、100、200、400和800 μg·mL^-1）处理24 h或72 h后对人软骨细胞活性的影响。随后将软骨细胞分为对照组、IL-1β组（10 ng·mL^-1）、LNT（100 μg·mL^-1）+IL-1β组和LNT（200 μg·mL^-1）+IL-1β组，EdU染色检测LNT对IL-1β处理后软骨细胞增殖水平；Western Blot检测软骨细胞基质金属蛋白酶13（MMP13）、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5（ADAMTS5）、Ⅱ型胶原蛋白α1链（Col2a1）和p-P65的蛋白表达；免疫荧光染色检测软骨细胞MMP13、Col2a1的蛋白表达及p-P65核转位；荧光探针DCFH-DA检测软骨细胞活性氧（ROS）的产生。 结果 低浓度LNT（50、100、200和400 μg·mL^-1）较对照组活性无显著性差异，而与LNT（400 μg·mL^-1）相比，LNT（800 μg·mL^-1）显著抑制软骨细胞活性（P<0.05）；此外，EdU染色显示LNT（200 μg·mL^-1）显著改善IL-1β诱导的增殖抑制（P<0.05）；另外，LNT能够显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞基质降解酶MMP13和ADAMTS5的蛋白表达，并促进软骨基质Col2a1的蛋白表达（P<0.05或P<0.01）；机制层面，IL-1β诱导的软骨细胞ROS的产生及p-P65核转位能被LNT显著抑制（P<0.05或P<0.01）。 结论 LNT通过抑制ROS/NF-κB信号通路，改善IL-1β诱导的软骨细胞增殖抑制及基质降解，为探索骨关节炎新的药物治疗策略提供实验依据。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of lentinan (LNT) on interleukin-1β (IL-1β)-induced chondrocytes. Methods The effect of different concentrations of LNT (0, 50, 100, 200, 400, and 800 μg·mL^-1) on the viability of human chondrocytes after 24 h or 72 h treatment was detected by CCK-8 assay. Chondrocytes were then divided into control group, IL-1β group (10 ng·mL^-1), LNT (100 μg·mL^-1) + IL-1β group and LNT (200 μg·mL^-1)+IL-1β group. EdU staining was used to detect the effect of LNT on chondrocyte proliferation after IL-1β treatment. Western Blot was used to detect the protein expression of matrix metalloproteinase 13 (MMP13), a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5 (ADAMTS5), collagen type Ⅱ alpha 1 chain (Col2a1) and p-P65 in chondrocytes. Immunofluorescence staining was used to detect the protein expression of MMP13, Col2a1 and the nuclear translocation of p-P65 in chondrocytes. Fluorescence probe DCFH-DA was used to detect the production of reactive oxygen species (ROS) in chondrocytes. Results There was no significant difference between the control group and low concentration of LNT (50, 100, 200, and 400 μg·mL^-1) in the activity of chondrocytes, but compared with LNT (400 μg·mL^-1), LNT (800 μg·mL^-1) significantly inhibited the activity of chondrocytes. In addition, EdU staining showed that LNT (200 μg·mL^-1) significantly weakened the inhibitory effect of proliferation induced by IL-1β (P<0.05). In addition, LNT could significantly inhibit the expression of matrix degrading enzymes MMP13 and ADAMTS5 induced by IL-1β, and promote the expression of Col2a1 in chondrocytes (P<0.05 or P<0.01). In terms of mechanism, the production of ROS and nuclear translocation of p-P65 induced by IL-1β could be significantly inhibited by LNT (P<0.05 or P<0.01). Conclusion LNT could attenuate the inhibitory effect of proliferation and matrix degradation induced by IL-1β by inhibiting ROS/NF-κB signal pathway, providing experimental evidence for exploring new drug treatment strategies for osteoarthritis.

Graphical abstract

关键词

骨关节炎 / 香菇多糖 / 软骨细胞 / 细胞外基质 / ROS/NF-κB信号通路

Key words

Osteoarthritis / Lentinan / Chondrocytes / Extracellular Matrix / ROS/NF-κB Signaling Pathway

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性退行性和致残性疾病，其病理特征表现为滑膜关节的慢性炎症^［1］。据统计，2021年40岁以上成年人中患有膝关节OA的比例超过22%，而全球大约有5亿人受到OA的影响，给社会医疗带来了巨大的负担^［2］。多种研究显示氧化应激和炎症在OA发生和进展中发挥重要的作用^［3-4］。在白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）诱导的OA样软骨细胞中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和环加氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等分解性代谢因子显著增加^［5］。过量产生的ROS和炎性介质通常会增加软骨基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶 5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS5）等基质降解酶的表达，从而导致软骨退变和OA的进展^［6］。因此，抑制滑膜关节的炎症和氧化应激可能是治疗OA的有效选择。

香菇多糖（lentinan，LNT）是一类特殊的β-葡聚糖，是从香菇中提取的最重要的生物活性化合物之一，具有抗氧化应激、抗炎、抗菌和免疫调节等药理活性^［7］。REN等^［8］研究表明LNT可以抑制循环血液中ROS和炎症介质的产生，从而增强机体的抗氧化能力。此外，LNT还可通过激活Nrf2提高抗氧化酶的活性，从而减少ROS的积累来减轻LPS诱导的乳腺上皮细胞氧化损伤^［9］。然而，LNT抗OA软骨细胞氧化应激及基质分解代谢的作用及其机制还未有报道。因此，本研究拟在细胞水平探究LNT对IL-1β诱导的软骨细胞增殖和基质降解的作用及其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1　主要试剂与设备

LNT（纯度96%，货号：S23110）购自上海源叶生物科技有限公司；重组人白细胞介素-1β（IL-1β，货号：PHC0814）和复合培养基DMEM/F12（货号：C11330500BT）购自美国Thermo Fisher公司，细胞计数试剂盒（CCK-8，货号：HY-K0301）购自美国MedChemexpress生物科技公司；胎牛血清（货号：F101-01）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；MMP13（货号：A11148）、ADAMTS5（货号：A2836）、GAPDH（货号：AC002）、Lamin B1（货号：AC057）和p-P65抗体（货号：AP0124）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；Ⅱ型胶原蛋白α1链（Col2a1）抗体（货号：GB11021）购自武汉赛维尔公司；Tanon5200化学发光成像仪（上海天能科技有限公司）；倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2　实验方法

1.2.1　软骨细胞培养及传代

将人软骨细胞系C28/I2（深圳华拓生物科技有限公司）接种于T25细胞培养瓶中，向培养瓶中加入3 mL DMEM/F12完全培养基。随后将培养瓶放入37 ℃培养箱中培养，待软骨细胞融合超过80%时，吸取培养液，加入3 mL PBS洗涤细胞一次，然后向培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶消化细胞。待细胞消化完成后，离心去上清，按照1∶3的比例进行细胞传代。

1.2.2　细胞活性检测

将软骨细胞接种于96孔培养板中，待细胞完全贴壁后，向培养板中加入不同浓度LNT（0、50、100、200、400、800 μg·mL^-1）处理24 h或72 h，吸取培养液，用PBS洗涤细胞一次，随后向每孔中加入100 μL含有CCK-8试剂的无血清培养基。待避光反应2 h后，将96孔板放置于酶标仪中，将波长设置为450 nm，检测相对应光密度（OD）值，并根据OD值计算相对增殖率。

1.2.3　EdU染色检测细胞增殖

将软骨细胞种植于6孔培养板中，待细胞贴壁后，向培养板中加入IL-1β（10 ng·mL^-1）诱导OA软骨细胞，随后加入LNT（200 μg·mL^-1）处理24 h。收获细胞，按照BeyoClick^TM EdU-594细胞增殖检测试剂盒说明书进行染色，并计算阳性细胞数。

1.2.4　Western Blot检测OA软骨细胞蛋白表达

软骨细胞经IL-1β和LNT（100和200 μg⋅mL^-1）共同孵育24 h。收获细胞并用预冷的PBS洗涤3次，然后加入含有PMSF和Cocktail的RIPA裂解液来提取细胞的总蛋白。待蛋白在PVDF膜上印迹后，将膜与一抗放入摇床并在4 ℃下孵育过夜，抗体稀释比为：Col2a1（1∶1 000）、MMP13（1∶1 000）和ADAMTS5（1∶1 000）。孵育完成后，将膜用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温条件下孵育1 h。随后，配制显影剂，将显影剂均匀覆盖PVDF膜上进行化学发光显影。最后用Image J软件计算蛋白的灰度值，并根据灰度值得出蛋白的相对表达量。细胞核蛋白提取需按照试剂盒说明书进行，以核蛋白Lamin B1为内参，p-P65（1∶1 000）为目的蛋白，按照上述步骤计算蛋白的相对表达量。

1.2.5　免疫荧光检测

软骨细胞按照上述干预后，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min。待用Triton X 100破膜15 min后，用3% BSA室温封闭1 h。随后将软骨细胞与一抗在4 ℃下孵育过夜，抗体稀释比为：Col2a1（1∶200）、MMP13（1∶200）和p-P65（1∶200）。待孵育完成后，向培养板中加入荧光二抗（CY3或FITC）室温孵育1 h。最后，加入DAPI复染核5 min后，于倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.2.6　ROS检测

待细胞干预后，配置ROS检测探针（按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA）。去除培养板中的培养液，向培养板中加入DCFH-DA于37 ℃培养箱中孵育20 min。最后用无血清培养基充分洗涤细胞后，在荧光显微镜下观察。

1.3　统计学分析

柱状图采用Graphpad Prism 8.0软件绘制。数据定量以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。采用t检验来进行两组间的比较，多组间的比较以One-way ANOVA检验进行。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1　LNT对软骨细胞活性的影响

LNT结构式见图1A。软骨细胞用LNT（0、50、100、200、400、800 μg·mL^-1）处理24 h或72 h，CCK-8检测显示：LNT（0、50、100、200、400 μg·mL^-1）较对照组无显著性差异，而与LNT（400 μg·mL^-1）相比，LNT（800 μg·mL^-1）处理24 h 或72 h均显著抑制软骨细胞活性（P<0.05，图1B和1C）。因此，选择LNT浓度100和200 μg·mL^-1进行后续实验。

2.2　LNT对OA软骨细胞增殖水平的影响

为了分析LNT对OA软骨细胞增殖的影响，软骨细胞用IL-1β干预后，予以LNT（200 μg·mL^-1）处理，采用EdU进行染色，结果显示：与对照组相比，IL-1β组显著减少EdU阳性细胞数（P<0.01），而与IL-1β组相比，LNT（200 μg·mL^-1）显著增加EdU阳性细胞数（P<0.05），见图2。这提示LNT能够促进OA软骨细胞增殖。

2.3　LNT对OA软骨细胞基质合成及降解酶表达水平的影响

将软骨细胞用IL-1β干预后，予以LNT（100和200 μg·mL^-1）处理，Western Blot检测显示：与对照组相比，IL-1β组基质降解酶MMP13和ADAMTS5的蛋白表达显著增加，而Col2a1蛋白表达显著降低；而给予LNT处理后，与IL-1β组相比，LNT显著减少MMP13和ADAMTS5的蛋白表达，并增加了Col2a1的蛋白表达（P<0.05或P<0.01；图3A、3B）。免疫细胞荧光显示：IL-1β组MMP13荧光强度较对照组增强，而Col2a1荧光强度减弱；而LNT处理后，MMP荧光强度较IL-1β组减弱，Col2a1荧光强度较IL-1β组增强（P<0.05或P<0.01；图3C~3F）。以上结果提示LNT能够抑制OA软骨细胞基质降解，促进基质合成。

2.4　LNT对OA软骨细胞ROS表达水平的影响

通过DCFH-DA染色显示：与对照组相比，IL-1β组DCFH-DA荧光强度显著增加，而LNT处理后，与IL-1β组相比，DCFH-DA荧光强度显著减弱（P<0.01，图4）。提示LNT能够显著抑制OA软骨细胞ROS的产生。

2.5　LNT对OA软骨细胞NF-κB信号通路的影响

在OA软骨细胞中，P65是NF-κB信号通路的主要活性组份，其磷酸化激活后的p-P65从细胞质转位至细胞核介导炎性介质及基质降解酶的表达。为了明确LNT对OA软骨细胞NF-κB信号通路的效应，本研究对p-P65进行了免疫荧光染色，结果显示：与对照组相比，IL-1β组p-P65在细胞核表达增加，而LNT处理后，与IL-1β组相比，p-P65在细胞核表达减少（图5A）。Western Blot检测结果显示，IL-1β组p-P65的蛋白表达较对照组显著增加（P<0.01），而LNT处理后，LNT组p-P65的蛋白表达较IL-1β组显著减少（P<0.05，图5B和5C）。以上结果提示，LNT可能通过抑制NF-κB信号通路抑制OA软骨细胞基质降解。

3 讨论

关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，而细胞外基质又由胶原和蛋白聚糖组成^［10］。在成人软骨中，软骨细胞的自我增殖能力较弱。当发生OA时，软骨细胞基质合成减少，而细胞外基质降解增加，导致软骨结构破坏^［11］。在本研究中，LNT浓度100和200 μg·mL^-1对软骨细胞活性无显著影响，表明该浓度对软骨细胞没有毒性作用。进一步对软骨细胞基质合成和降解检测发现，LNT可上调OA软骨细胞基质合成相关蛋白Col2a1的表达，降低基质降解相关蛋白MMP13和ADAMTS5的表达。提示LNT可通过促进基质合成和抑制其降解来减轻OA软骨细胞表型。

NF-κB信号通路在调节OA的炎症反应中至关重要^［12］。生理状态下，P65与I-κB蛋白结合于胞质中；当受到IL-1β等刺激时，I-κBα磷酸化降解，P65磷酸化后入核，促进MMP13、ADAMTS5等炎症及基质降解因子的表达^［13］。在本研究中，LNT显著抑制OA软骨细胞中P65的核转位，提示LNT通过调控NF-κB信号通路改善OA软骨细胞基质降解。

此外，氧化应激是OA的另一个典型病理变化^［14-15］。多项研究表明，抑制ROS水平可以减缓OA的进展。既往研究显示LNT在糖尿病诱导的胰岛β细胞功能障碍^［16］、脂多糖诱导的乳腺上皮细胞损伤^［9］及结肠炎^［7］中表现出抗氧化活性。因此，我们进一步检测了OA软骨细胞ROS水平，结果表明LNT能显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞ROS的产生。

NF-κB是氧化应激诱导的细胞活化的关键调节分子之一^［17］。研究^［18］显示，ROS可通过IκB和硫氧还蛋白还原酶相互作用进而激活NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体通路，诱导炎症反应的发生和加剧。SUN等^［19］的报道表明，阿魏酸可通过ROS/NF-κB轴调节小胶质细胞/巨噬细胞极化来缓解视网膜新生血管形成。ROS激活的NF-κB信号通路在OA的发生发展中发挥着重要作用。在本研究中，我们发现LNT降低了OA样软骨细胞的ROS水平，同时抑制了P65的核转位，表明LNT可能通过抑制ROS/NF-κB信号通路，改善IL-1β诱导软骨细胞基质合成减少及降解增强。

本研究的局限性有如下两点：1）未在动物水平证实LNT对软骨基质降解及基质合成的效应；2）未检测LNT对OA软骨细胞炎症介质如Cox-2和iNOS的影响。

综上所述，LNT可促进软骨细胞基质合成并抑制其在体外的降解，抑制OA软骨细胞炎症因子的表达，从而明显减轻OA软骨细胞表型。机制层面，LNT能够抑制OA软骨细胞ROS的产生及NF-κB信号通路的激活。因此，本研究为LNT作为治疗OA的一种潜在治疗药物提供了实验依据。

参考文献

[1] SHEN G J, ZHANG W H, TU Q M, et al. Bergamottin (Ber) ameliorates the progression of osteoarthritis via the Sirt1/NF‑κB pathway[J]. Front Pharmacol, 2024, 15: 1389786.

[2] QUICKE J G, CONAGHAN P G, CORP N, et al. Osteoarthritis year in review 2021: Epidemiology & therapy[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2022, 30(2): 196‑206.

[3] LIU L, LUO P, YANG M Y, et al. The role of oxidative stress in the development of knee osteoarthritis: A comprehensive research review[J]. Front Mol Biosci, 2022, 9: 1001212.

[4] CHEN H T, NI Q B, LI B, et al. Identification of differentially expressed genes in synovial tissue of osteoarthritis based on a more robust integrative analysis method[J]. Clin Rheumatol, 2021, 40(9): 3745‑3754.

[5] ZHANG Z, ZHANG N Z, LI M, et al. Sappanone a alleviates osteoarthritis progression by inhibiting chondrocyte ferroptosis via activating the SIRT1/Nrf2 signaling pathway[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2024, 397(11): 8759‑8770.

[6] CHEN H T, TU M, LIU S Y, et al. Dendrobine alleviates cellular senescence and osteoarthritis via the ROS/NF‑κB axis[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(3): 2365.

[7] YOU C Y, XING J F, SUN J Y, et al. Anti‑inflammatory and anti‑oxidant impacts of lentinan combined with probiotics in ulcerative colitis[J]. Mol Biotechnol, 2024, 66(10): 2778‑2791.

[8] REN Z Z, LIU W B, SONG X L, et al. Antioxidant and anti‑inflammation of enzymatic‑hydrolysis residue polysaccharides by Lentinula edodes [J]. Int J Biol Macromol, 2018, 120(Pt A): 811‑822.

[9] MENG M J, HUO R, WANG Y, et al. Lentinan inhibits oxidative stress and alleviates LPS‑induced inflammation and apoptosis of BMECs by activating the Nrf2 signaling pathway[J]. Int J Biol Macromol, 2022, 222(Pt B): 2375‑2391.

[10] CHEN B, WANG L, XIE D K, et al. Exploration and breakthrough in the mode of chondrocyte death–A potential new mechanism for osteoarthritis[J]. Biomed Pharmacother, 2024, 170: 115990.

[11] JIN J L, YU X F, HU Z C, et al. Isofraxidin targets the TLR4/MD‑2 axis to prevent osteoarthritis development[J]. Food Funct, 2018, 9(11): 5641‑5652.

[12] LEPETSOS P, PAPAVASSILIOU K A, PAPAVASSILIOU A G. Redox and NF‑κB signaling in osteoarthritis[J]. Free Radic Biol Med, 2019, 132: 90‑100.

[13] ZHOU S Q, SHI J Q, WEN H Y, et al. A chondroprotective effect of moracin on IL‑1β‑induced primary rat chondrocytes and an osteoarthritis rat model through Nrf2/HO‑1 and NF‑κB axes[J]. Food Funct, 2020, 11(9): 7935‑7945.

[14] PRADHAN B, NAYAK R, PATRA S, et al. Bioactive metabolites from marine algae as potent pharmacophores against oxidative stress‑associated human diseases: A comprehensive review[J]. Molecules,2020,26(1):37.

[15] SUN M M, BEIER F, PEST M A. Recent developments in emerging therapeutic targets of osteoarthritis[J]. Curr Opin Rheumatol, 2017, 29(1): 96‑102.

[16] ZHANG Y Q, MEI H L, SHAN W, et al. Lentinan protects pancreatic β cells from STZ‑induced damage[J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(10): 1803‑1812.

[17] LEZOUALC'H F, BEHL C. Transcription factor NF‑kappaB: Friend or foe of neurons?[J]. Mol Psychiatry, 1998, 3(1): 15‑20.

[18] HE Y J, LI Z, XU T, et al. Polystyrene nanoplastics deteriorate LPS‑modulated duodenal permeability and inflammation in mice via ROS drived‑NF‑κB/NLRP3 pathway[J]. Chemosphere, 2022, 307(Pt 1): 135662.

[19] SUN X W, MA L S, LI X, et al. Ferulic acid alleviates retinal neovascularization by modulating microglia/macrophage polarization through the ROS/NF‑κB axis[J]. Front Immunol, 2022, 13: 976729.

基金资助

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2042023kf0049)