PRIM2潜在预后和免疫生物标志物价值的泛癌分析

Pan-cancer analysis of potential prognostic and immunobiomarker value for PRIM2

摘要

目的 通过泛癌分析，探究DNA引物酶亚基2（PRIM2）在肿瘤预后和免疫浸润中的作用。 方法 从UCSC Xena网站下载PRIM2的表达和临床数据。通过GEPIA和TIMER2数据库，研究PRIM2在肿瘤与正常组织中的表达差异，以及与免疫细胞浸润、免疫检查点基因、错配修复（MMR）和DNA甲基化的关联。使用R语言分析PRIM2与不同肿瘤的肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）和免疫评分之间的关系。利用LinkedOmics数据库研究基因的共表达和PRIM2的富集分析。分子生物学实验采用了Western印迹分析、细胞活力分析、集落形成试验、Transwell迁移和EdU染色等方法。 结果 PRIM2在大多数肿瘤中高表达，与生存预后呈负相关。PRIM2的表达与肿瘤微环境（TME）、TMB、MSI和MMR等免疫相关因素密切相关。分子生物学实验证实，PRIM2能促进胶质母细胞瘤的增殖和迁移。 结论 PRIM2影响各种肿瘤患者的预后。同时，PRIM2与不同肿瘤的免疫浸润和免疫治疗反应有很强的相关性。

Abstract

Objective To explore the role of DNA primase subunit 2 (PRIM2) in tumor prognosis and immune infiltration by pan-cancer analysis. Methods PRIM2 gene expression and clinical data were downloaded from the UCSC Xena website. The differences in PRIM2 expression were examined in tumor versus normal tissues and associations with immune cell infiltration, immune checkpoint genes, mismatch repair (MMR), and DNA methylation-related genes using the GEPIA and TIMER2 database. The association of PRIM2 with tumor mutational burden （TMB）, microsatellite instability （MSI）, and immune scores of different tumors were analyzed by R language. The LinkedOmics database was used to investigate co-expression of genes and enrichment analysis of PRIM2. Molecular biology experiments were performed by using Western Blot analysis, cell viability analysis, colony formation assays, Transwell migration, and EdU staining. Results PRIM2 is highly expressed in most tumors and negatively correlates with survival prognosis. PRIM2 expression is strongly correlated with immune-related factors such as tumor microenvironment (TME), TMB, MSI, and MMR. Molecular biology experiments confirm that PRIM2 promotes the proliferation and migration of glioblastomas. Conclusion PRIM2 affects the prognosis of various cancer patients. Meanwhile, PRIM2 has a strong correlation with immune infiltration and immune therapy response in different tumors.

Graphical abstract

关键词

泛癌分析 / PRIM2 / 预后 / 免疫浸润 / 胶质母细胞瘤

Key words

Pan-Cancer Analysis / PRIM2 / Prognosis / Immune Infiltration / Glioblastoma

免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断疗法，正逐渐成为临床治疗肿瘤的有力策略^［1］。研究^［2］表明，免疫检查点抑制剂可显著改善预后，并增强患者对各类肿瘤的抵抗力。我们通过泛癌分析来寻找肿瘤组织新的生物学标志物，提高各种恶性肿瘤的诊断和改善预后。

DNA引物酶亚基2（DNA primase subunit 2,PRIM2）是DNA引物酶的一个大亚基，在调节DNA损伤修复、转录和细胞增殖方面发挥着重要功能^［3］。研究^［4-5］发现，PRIM2与肿瘤的恶性增殖和抗凋亡有关。

本研究通过泛癌分析和体外分子实验探讨PRIM2在肿瘤的预后和免疫学价值（如免疫浸润等）。在胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）中进行分子实验，以进一步验证PRIM2的作用。探讨PRIM2是否可以作为一种重要的生物标志物，预测各种癌症的预后，以及作为肿瘤免疫疗法的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1　数据收集和处理

我们从UCSC Xena网站（https：//xena.ucsc.edu/）下载了RNA测序数据和相关临床信息。接着，通过PERL软件从TCGA（https：//tcga.xenahubs.net）提取并转换了PRIM2表达数据，以便进行后续的分析。

1.2　PRIM2基因表达分析

TIMER2数据库（http：//timer.cistrome.org/）用于分析TCGA数据库中不同肿瘤组织和正常组织中PRIM2表达水平的差异。此外，GEPIA2数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）进一步用于分析TCGA和GTEx数据库中不同肿瘤组织与正常组织中PRIM2表达的差异。P<0.05被认为差异具有统计学意义。使用R软件中的“plyr”“reshape2”和“ggpubr”软件包分析不同肿瘤中PRIM2 mRNA的表达水平。

1.3　PRIM2的免疫浸润分析

使用R语言的“fmsb”软件包分析PRIM2表达与肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden，TMB）和微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）的相关性。通过TISIDE数据库分析了PRIM2表达与三种免疫调节剂（免疫抑制、免疫刺激和MHC分子）之间的关系。

1.4　PRIM2表达和错配修复基因突变及DNA甲基化分析

错配修复（Mismatch Repair，MMR）基因包括EPCAM、PMS2、MSH1、MSH2和MLH6。DNA甲基化相关基因包括DNMT1、DNMT3L、DNMT3A和DNMT3B。TIMER2数据库分析PRIM2和MMR基因与DNA甲基转移酶基因表达水平的相关性。

1.5　探索胶质瘤中的PRIM2共表达基因

LinkedOmics数据库（http：//www.linkedomics.org/）用于探索胶质瘤中与PRIM2共表达基因。并且进一步探索PRIM2在胶质瘤中的基因本体生物过程（GO_BP）和KEGG通路。

1.6　细胞培养和转染

我们从上海生化与细胞生物学研究所获得了人类GBM细胞系（U87和U251）。细胞在37 ℃和5%CO₂的培养箱中培养，培养基为高糖DMEM（Gibco，美国），添加1%青霉素/链霉素（Servicebio，武汉）和10%胎牛血清（FBS）（Gibco，美国）。过表达质粒pCDNA3.1-Flag-PRIM2由苗岭生物（武汉）有限公司构建。用Lipofectamine3000试剂转染U87和U251。

1.7　Western印迹分析

在含有蛋白酶磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解细胞30 min，然后在4 ℃收集细胞样本。等量蛋白质经SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到PVDF膜（Millipore，德国）上。使用5%BSA封闭膜，并在4 ℃下与一抗孵育过夜。随后，用对应的二抗孵育1 h。

1.8　细胞活力实验和克隆形成实验

细胞活力用CCK-8试剂盒（Servicebio，中国）检测。每孔加入CCK‑8试剂和DMEM完全培养基的混合物，然后将96孔板置于细胞培养箱中培养2 h。使用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度。选取U87和U251细胞，以每孔1 000个细胞的密度均匀种植在6孔板中，然后进行转染，每3~4 d更换一次培养基，持续约2周，以形成明显的单细胞集落。

1.9　Transwell分析和EdU染色分析

将转染的U87和U251接种到用无血清培养基的24孔板的上腔，在下腔中加入含血清培养基，并在培养箱中放置2 d。然后用结晶紫染色并用倒置显微镜拍照。EdU染色是使用EdU细胞增殖试剂盒（BeyoClick™，中国）。将U87和U251细胞接种到6孔板中，然后进行转染。细胞样品与EdU试剂一起孵育，并在荧光显微镜下拍照。

1.10　数据分析

使用GraphPadPrism 8.0软件进行统计分析。独立样本t检验用于比较两组之间的差异。单因素方差分析用于比较三组或更多组之间的差异，如果方差分析结果显著，则使用对数秩检验分析组间差异。

2 结果

2.1　不同肿瘤和正常组织中PRIM2表达水平和生存预后分析

我们利用TIMER2数据库研究PRIM2在正常组织和肿瘤组织中的表达水平。结果表明，PRIM2在多数肿瘤类型中的表达明显升高，包括BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PEAD、STAD和UCEC（图1A）。然而，PRIM2在KIRC、SKCM和THCA中的表达水平较低。图1B显示了PRIM2在33种癌症中的mRNA表达水平。利用GEPIA平台将TCGA与GTEx数据库中的数据整合分析，PRIM2在DLBC、LGG、PAAD、SARC、TGCT、THYM、USC中的表达也明显偏高（图1C和1D）。这些差异可能是不同数据库收集方法不同造成的。同时，基于TISIDE平台，我们分析了PRIM2与肿瘤分期或分级的相关性。在9种癌症中，PRIM2的表达与肿瘤分期或分级呈正相关（图1E、1F），包括UCEC、PAAD、LIHC、LGG、KIRC、HNSC、CESC、KICH和KIPRP，然而，在SKCM和OV中呈负相关。

2.2　癌症中的免疫浸润水平分析

基于TIMER2平台分析PRIM2与肿瘤免疫浸润的相关性。结果显示，在多数肿瘤中，PRIM2表达与CD8⁺ T细胞浸润水平呈正相关（图2A）。在BLCA、THYM、UVM和LUAD中，PRIM2表达水平与CD8⁺ T细胞浸润水平呈显著正相关（图2B）。并且多数肿瘤的PRIM2表达与中性粒细胞明显正相关（图2C），图2D显示了中性粒细胞免疫浸润相关性最高的前4位。此外，除了KIRC和PRAD，PRIM2的表达水平与髓源性抑制细胞（MDSC）呈正相关（图2E），图2F中显示了相关性最强的前4种肿瘤。

2.3　PRIM2表达与免疫检查点基因和免疫调节剂之间的相关性

为了进一步探讨PRIM2与免疫浸润的关系，我们通过共表达分析，研究PRIM2表达与免疫检查点基因的关联。结果显示，除TNFRS14和TMIGD2外，PRIM2在大多数肿瘤中的表达与免疫检查点基因呈显著正相关（图3A）。此外，我们通过TISIDB数据库探讨了免疫调节剂与PRIM2的关系。结果表明，在33种肿瘤中，PRIM2的表达与免疫调节剂（包括免疫刺激因子、免疫抑制因子和MHC分子）呈负相关（图3B~3D）。

2.4　TMB、MSI、MMR和DNA甲基化

此外，我们还探索了PRIM2表达与TMB、MSI、MMR和甲基化之间的关系。在ESCA、LIHC、READ、SARC、STAD、UCEC中，PRIM2的表达与MSI呈正相关，但在DLBC、LGG、LUAD中呈负相关（图3E）。在ACC、BLCA、BRCA、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、MESO、OV、PAAD、SARC、SKCM、STAD、UCEC中，PRIM2表达与TMB呈正相关，但在PRAD、THYM中呈负相关（图3F）。在多数肿瘤中，PRIM2的表达与MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）的表达密切相关（图3G）。并且，PRIM2的表达与DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的表达呈显著正相关（图3H）。

2.5　GBM中的PRIM2共表达基因

我们通过LinkedOmics平台分析PRIM2在GBM中的共表达基因。在GBM中，PRIM2的共表达基因如火山图所示（图4A），与PRIM2正相关和负相关的前50个基因如热图所示（图4B、4C）。我们还对PRIM2共表达基因进行了GO（生物过程）和KEGG分析。

KEGG结果显示，PRIM2的共表达基因涉及细胞周期，错配修复，NOD样受体信号通路，TNF信号通路，趋化因子信号通路和FcgammaR介导的吞噬作用（图4D）。GO结果显示，PRIM2的共表达基因参与细胞周期G₂/M期转变、细胞周期检查点、细胞周期的调控、T细胞活化、免疫反应调节信号通路、干扰素-γ的反应和白细胞-细胞黏附和吞噬（图4E）。上述结果表明，PRIM2可能在调控GBM的免疫反应和增殖中发挥重要作用。

2.6　GBM中PRIM2的表达分析

为了证实PRIM2在胶质瘤细胞中的功能，我们在U87和U251细胞中构建了Flag-PRIM2质粒，以验证PRIM2的功能。蛋白印迹分析验证了PRIM2过表达的效果（图5A、5B）。EdU试验结果表明，PRIM2过表达能显著促进细胞增殖（图5C、5D）。Transwell试验表明，PRIM2过表达可促进细胞迁移能力（图5E、5F）。过表达PRIM2的U87和U251细胞活力明显增强（图6A、6B）。集落形成实验表明，过表达PRIM2的U87和U251细胞的集落形成明显增加（图6C~6F）。这些实验结果表明，PRIM2过表达会促进GBM的增殖。

3 讨论

我们通过对PRIM2进行泛癌分析，探索其对肿瘤患者临床预后的影响，并探讨PRIM2免疫相关因素之间的潜在关联。结果表明，PRIM2在大多数肿瘤中的表达水平显著升高，并且高表达的PRIM2与患者的不良预后密切相关。PRIM2的表达与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）、免疫检查点基因和免疫调节剂紧密相关。我们还发现，在大多数肿瘤类型中，PRIM2的表达与TMB、MSI、MMR呈正相关，但与DNA甲基化呈负相关。此外，我们还探讨了PRIM2在GBM共表达基因的GO和KEGG分析，并通过分子实验验证了PRIM2在胶质瘤中的促肿瘤增殖和侵袭性迁移作用。

TME为免疫疗法的选择提供指导，并对治疗效果和临床结局产生重要影响^［6］。在TME中，CD8⁺ T细胞是抗肿瘤免疫细胞，但MDSC具有抑制T细胞免疫反应的促肿瘤功能，中性粒细胞也在促进肿瘤发生方面发挥作用^［7-8］。我们的结果显示，在多数肿瘤中，PRIM2的表达与CD8⁺ T细胞浸润相关，并且与中性粒细胞和髓源性抑制性细胞浸润呈显著正相关。这表明PRIM2可能通过与免疫浸润相互作用，促进了肿瘤的进展。我们进一步探讨了免疫检查点基因与PRIM2表达的相关性。结果显示，大多数免疫检查点基因与PRIM2的表达呈显著正相关。这表明，免疫检查点阻断治疗可能对PRIM2高表达的患者具有更好的疗效。

TMB、MSI和MMR是评估免疫疗法反应的生物标志物，也与免疫疗法的敏感性密切相关^［9-10］。免疫检查点阻断（ICB）疗法是新型免疫疗法的一种，尤其适用于对化疗不敏感的患者^［11］。TMB得分越低，预示着对ICB疗法的反应越差^［12］。高频TMB有助于形成新抗原，使肿瘤获得更强的免疫原性，从而改善患者的无进展生存期^{［9， 13］}，也可以增加对免疫检查点阻断疗法的敏感性^［14］。在我们的研究中，14个肿瘤与TMB呈显著正相关，6个肿瘤与MSI呈显著正相关，大多数肿瘤与MMR呈极强正相关。这表明，PRIM2的高表达可能会对肿瘤患者的TMB、MSI和MMR产生影响，从而影响患者对免疫疗法的反应。

DNA甲基化修饰是一种DNA表观遗传修饰形式，通过改变DNA稳定性和构象抑制基因表达^［15-16］。我们研究发现，DNA甲基转移酶在大多数肿瘤中高表达，而PRIM2的甲基化水平与其表达量显著负相关。据报道^［15-16］，启动子区域的高甲基化会导致肿瘤抑制基因沉默或失活。

我们还分析了GBM中PRIM2的共表达基因，发现这些基因与GBM的免疫反应和细胞增殖密切相关；通过一系列分子实验，证实PRIM2能显著促进胶质瘤细胞的增殖和迁移。

综上所述，我们通过对PRIM2进行泛癌分析，表明PRIM2有望作为监测肿瘤预后的生物标志物以及免疫治疗的潜在靶点。然而，PRIM2在各种肿瘤中的免疫反应机制仍需进一步研究。

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基金资助

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