甲状腺功能减退与增殖性糖尿病视网膜病变风险及免疫细胞中介作用的孟德尔随机化分析

Mendelian randomization analysis of the association between hypothyroidism and the risk of proliferative diabetic retinopathy and the mediating role of immune cells

摘要

目的 探讨甲状腺功能减退症（甲减）与增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）之间的因果关系，并进一步分析免疫细胞在其中的中介作用。 方法 研究采用孟德尔随机化方法，利用来自芬兰数据库的PDR全基因组关联分析数据和UK Biobank数据库的甲减数据，结合731种免疫细胞表型的基因数据进行分析。 结果 甲减显著增加了PDR的风险，逆方差加权法（IVW）分析结果为OR=26.64，P<0.001。通过MR-Egger检验和MR-PRESSO检验，确认了结果的稳健性。中介分析发现，CD28 on CD28⁺ CD45RA⁺ CD8⁺ T细胞和HLA DR on CD14⁺单核细胞在甲减与PDR之间具有部分中介作用，其中介效应比分别为10.67%和18.83%。 结论 本研究通过孟德尔随机化方法揭示了甲减与PDR的因果关系，并指出了免疫细胞在这一过程中的潜在中介作用，为糖尿病视网膜病变的预防和治疗提供了新的策略。

Abstract

Objective To explore the causal relationship between hypothyroidism and proliferative diabetic retinopathy (PDR) and further analyze the mediating role of immune cells in this process. Methods A Mendelian randomization approach was used, utilizing genome-wide association study (GWAS) data for PDR from the Finnish database and hypothyroidism data from the UK Biobank database. Additionally, gene data for 731 immune cell phenotypes were analyzed. Results Hypothyroidism significantly increased the risk of PDR, with an inverse variance weighted (IVW) analysis result of OR=26.64, P<0.001. The robustness of the results was confirmed through MR-Egger and MR-PRESSO tests. Mediation analysis revealed that CD28 on CD28⁺ CD45RA⁺ CD8⁺ T cells and HLA-DR on CD14⁺ monocytes had a partial mediating effect between hypothyroidism and PDR, with mediation effect ratios of 10.67% and 18.83%, respectively. Conclusion This study revealed the causal relationship between hypothyroidism and PDR using the Mendelian randomization method and identified the potential mediating role of immune cells in this process, providing new strategies for the prevention and treatment of diabetic retinopathy.

Graphical abstract

关键词

甲状腺功能减退症 / 增殖性糖尿病视网膜病变 / 孟德尔随机化 / 中介分析

Key words

Hypothyroidism / Proliferative Diabetic Retinopathy / Mendelian Randomization / Mediation Analysis

增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）是糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的一种晚期并发症，可导致失明^［1］。其特征是血管通透性增加、视网膜缺血水肿以及新生血管形成^［2］。据估计，全球糖尿病人群中DR的患病率为22.27%，而威胁视力的DR（包括PDR和糖尿病性黄斑水肿）的患病率估计为6.17%^［3］。

流行病学研究^［4］表明PDR发生与甲状腺功能减退症（hypothyroidism，简称甲减）有关。然而这些流行病学中，可能受一些混杂因素、观察周期短等因素的影响^［5］。一种新的科学研究方法——孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析可以从因果关系角度推断甲减与PDR的因果关系。其原理是利用与暴露因素具有较强的遗传工具变量来探讨他们的关系^［6］。目前，尚不清楚甲减与PDR之间的中介因素。免疫细胞可能在这个过程中具有重要作用^［7］。因此，此研究拟使用MR分析探索甲减与PDR风险之间的因果关系，并使用两步法MR分析探讨731种免疫细胞表型的中介作用。

1 资料与方法

1.1　资料来源

从芬兰数据库获取PDR的全基因组关联分析汇总数据，其中包括8 681例PDR患者和204 208例对照。甲减的汇总数据来源于UK Biobank数据库（https：//www.nealelab.is/uk-biobank），其中包括病例16 376人和对照320 783。731种免疫细胞表型数据则来源于GWAS目录，GWAS ID范围从GCST90001391到GCST90002121，包含3 757名欧洲个体的研究数据。

1.2　工具变量筛选

工具变量——单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）应满足MR三个假设，分别为：关联性假设、独立性假设和排他性假设^［8］。第一，筛选条件均设为P<5×10^-8，以明确遗传工具变量具有显著的统计学意义。第二，连锁不平衡系数R²设置为0.001，区域宽度设为10 000 kb，以确保所选的SNP位点相互独立，并减少多效性的影响。第三，应用孟德尔随机化多效性残差和离群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）、MR-Egger检验来监测潜在的水平多效性效应并通过中介分析来验证排他性假设。最后，为了避免弱的工具变量的偏差，使用F统计量评估工具变量的强度，将F<10定义为弱工具变量并进行排除。

1.3　统计学分析

我们采用两样本MR方法进行探索甲减与PDR发生风险的因果关系。主要使用逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）进行结果报告。风险关系以OR值及95%CI表示，P<0.05表示具有统计学意义。为了明确甲减与PDR之间的因果方向，进行反向MR验证，以消除反向因果关系。此外，使用两步法MR进一步评估了731种免疫细胞表达水平在甲减与PDR的中介作用。暴露因素与结局相关性设为β₀，暴露与中介相关性为β₁，中介与结局相关性设为β₂，中介效应比=β₁×β₂/β₀。使用散点图、漏斗图、MR-PRESSO检验、MR-Egger检验、Cochran Q检验和留一法分析进行敏感性分析。本研究分析均在R 4.4.0软件中进行。

2 结果

2.1　甲状腺功能减退与增殖性糖尿病视网膜病变的因果关系

79个显著的遗传工具变量被筛选确定为甲状腺功能减退的工具变量进行MR分析。MR结果显示，甲状腺功能减退会增加增殖性糖尿病视网膜病变的风险。IVW方法显示其效应值为3.282，OR为26.64，P<0.001。其余方法的OR值均大于1，且均具有统计学意义，详见图1。

通过对散点图和漏斗图的观察，表明工具变量的选择相对平衡，如图2所示，无明显偏倚。留一法检验结果显示，去除任意一个SNP后，其他SNP的分析结果仍位于无效线的右侧，说明去除任意一个SNP不会对结果产生显著影响。

如表1所示，MR-Egger检验显示P>0.05，提示不存在明显的水平多效性。尽管MR-PRESSO检验发现了多效性问题（P<0.001）并识别了四个离群值（rs6679677、rs2736191、rs76518703、rs7768109），但结果在移除离群值后依然保持相对稳定（P=0.777）。这表明分析结果是相对稳健可靠的。Cochran Q检验显示P<0.001，提示存在异质性。因此，本研究重点关注IVW模型，以更准确地估计结果。

在这项研究中，反向分析即检测PDR是否会增加甲减的风险时确定了9个SNP作为工具变量。如图3所示，IVW方法并未发现显著关联。

2.2　中介分析结果

在探索甲减对731种免疫细胞表型的因果关系时，我们筛选到了4种显著相关的细胞表型。如表2所示，使用IVW方法分析，显示甲减对CD28 on CD28⁺ CD45RA⁺ CD8⁺ T细胞（CD28在CD28⁺ CD45RA⁺ CD8⁺ T细胞上的表达）的效应值为2.519（P=0.037），提示甲减与该表型呈正相关。对HLA DR on CD14⁺ 单核细胞（HLA DR在CD14⁺单核细胞上的表达）的效应值为1.781（P=0.021），表明甲减可能增加CD14⁺单核细胞中HLA DR表达的水平。而甲减对HLA DR on CD14^- CD16^-的效应值为-1.651（P=0.036），对HLA DR on CD33⁺ HLA DR⁺ CD14^-的效应值为-2.238（P=0.027），提示甲减与这两种免疫表型呈负相关。

对上述四种免疫细胞表型对PDR的因果关系进一步进行MR分析，确定CD28 on CD28⁺ CD45RA⁺ CD8⁺ T细胞和HLA DR on CD14⁺ 单核细胞表型对PDR的发生风险方向一致，且显示会增加PDR风险。如表3所示，效应值分别为0.139（P=0.001），0.347（P=0.001）。这些结果可能表明，这两种免疫细胞表型可能会增加PDR的发生风险。剩余两种免疫细胞由于β₁与β₀方向不一致，未进行中介分析。

在中介分析中，CD28 on CD28⁺ CD45RA⁺ CD8⁺ T细胞表型的中介效应为0.350，而HLA DR on CD14⁺单核细胞表型的中介效应为0.618。如图4，中介效应比分别为10.67%和18.83%。这些结果表明，在甲状腺功能减退与PDR风险的因果关系中循环免疫细胞表型只起到部分中介作用。

（下转第353页）

参考文献

[1] MARTINEZ-ZAPATA M J, SALVADOR I, MARTÍ-CARVAJAL A J, et al. Anti-vascular endothelial growth factor for proliferative diabetic retinopathy[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2023, 3(3): CD008721.

[2] AI X, YU P, LUO L, et al. Berberis dictyophylla F. inhibits angiogenesis and apoptosis of diabetic retinopathy via suppressing HIF-1α/VEGF/DLL-4/Notch-1 pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2022, 296: 115453.

[3] LIN K Y, HSIH W H, Lin Y B, et al. Update in the epidemiology, risk factors, screening, and treatment of diabetic retinopathy[J]. J Diabetes Investig, 2021, 12(8): 1322-1325.

[4] HEIDARI Z, ASADZADEH R. Subclinical hypothyroidism is a risk factor for diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Med J Islam Repub Iran, 2021, 35: 186.

[5] DENG Y, PAN W. Model checking via testing for direct effects in Mendelian mandomization and transcriptome-wide association studies[J]. PLoS Comput Biol, 2021, 17(8): e1009266.

[6] BADSHA M B, FU A Q. Learning causal biological networks with the principle of Mendelian randomization[J]. Front Genet, 2019, 10: 460.

[7] LI J, NIU Q, WU A, et al. Causal relationship between circulating immune cells and the risk of type 2 diabetes: A Mendelian randomization study[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2023, 14: 1210415.

[8] LI S, WANG Q, TAN X, et al. Effect of neonatal and adult sepsis on inflammation-related diseases in multiple physiological systems: A Mendelian randomization study[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2023, 14: 1215751.

[9] WU J, YUE S, GENG J, et al. Relationship between diabetic retinopathy and subclinical hypothyroidism: A meta-analysis[J]. Sci Rep, 2015, 5: 12212.

[10] LIN D, QIN R, GUO L. Thyroid stimulating hormone aggravates diabetic retinopathy through the mitochondrial apoptotic pathway[J]. J Cell Physiol, 2022, 237(1): 868-880.

[11] HEIDARI Z, ASADZADEH R. Subclinical hypothyroidism is a risk factor for diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Med J Islam Repub Iran, 2021, 35: 186.

[12] QI Q, ZHANG Q M, LI C J, et al. Association of thyroid-stimulating hormone levels with microvascular complications in type 2 diabetes patients[J]. Med Sci Monit, 2017, 23: 2715-2720.

[13] BAPPUTTY R, SAPA H, MASARU M, et al. Diabetes modulates iodothyronine deiodinase 2 expression in the mouse retina: A role for thyroid hormone in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2023, 64(15): 3.

[14] VARGAS-URICOECHEA H. Molecular mechanisms in autoimmune thyroid disease[J]. Cells, 2023, 12(6): 918.

[15] ASKENASY N. Mechanisms of diabetic autoimmunity: Ⅱ–is diabetes a central or peripheral disorder of effector and regulatory cells?[J]. Immunol Res, 2016, 64(1): 36-43.

[16] El-SEHRAWY A A, ELKHAMISY E M, BADAWI A E, et al. Subclinical hypothyroidism in patients with diabetic retinopathy: Role of vascular endothelial growth factor[J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2022, 22(5): 502-509.

[17] BOWDEN J, HOLMES M V. Meta-analysis and mendelian randomization: A review[J]. Res Synth Methods, 2019, 10(4): 486-496.

[18] MANCINI A, DI SEGNI C, RAIMONDO S, et al. Thyroid hormones, oxidative stress, and inflammation[J]. Mediators Inflamm, 2016, 2016: 6757154.