一例临床废弃肝脏经常温机械灌注保存与修复报告

A case report on normothermic machine perfusion preservation and repair of a clinically discarded liver

摘要

目的 探讨常温机械灌注（NMP）在肝脏体外保存中的应用效果，为肝移植中的移植物保存及质量评估提供参考。 方法 对1例临床肝移植手术中切除的废肝进行35 ℃ NMP灌注，连接门静脉、肝动脉及胆管，监测血管压力、流量、胆汁生成量、温度及生化指标，24 h后进行病理学分析。 结果 NMP 24 h后，缺血区域减少，肝脏整体红润，胆汁生成增多。31 h后流量稳定在约2 600 mL·min^-1，乳酸水平10 h后下降，转氨酶32 h后呈下降趋势，白蛋白合成功能改善，血清白蛋白除以血清球蛋白（A/G）比值恢复。病理显示肝细胞形态部分恢复，水肿坏死减少，肝组织结构及微循环改善。 结论 NMP技术在48 h保存中可维持肝脏部分代谢及生理功能，修复热缺血损伤，维持肝脏质量，为移植器官评估及修复提供有效平台，具有临床应用潜力。

Abstract

Objective To investigate the efficacy of normothermic machine perfusion (NMP) in vivo liver preservation and provide a reference for graft preservation and quality assessment in liver transplantation. Methods A discarded liver from a clinical liver transplantation surgery was subjected to 35 ℃ NMP perfusion. The portal vein, hepatic artery, and bile duct were connected, and vascular pressure, flow rate, bile production, temperature, and biochemical parameters were monitored. Histopathological analysis was conducted after 24 hours. Results After 24 hours of NMP, ischemic areas were reduced, the liver appeared uniformly perfused and reddened, and bile production increased. After 31 hours, flow stabilized at approximately 2 600 mL·min^-1; lactate levels declined after 10 hours; and transaminase levels showed a downward trend after 32 hours. Albumin synthesis improved, and the serum albumin-to-globulin (A/G) ratio returned to normal. Pathological examination revealed partial hepatocyte morphological recovery, reduced edema and necrosis, and improved liver tissue structure and microcirculation. Conclusion NMP can sustain partial metabolic and physiological functions of the liver during 48-hour preservation, mitigate warm ischemic injury, and maintain liver quality. This technique provides an effective platform for organ assessment and repair, demonstrating potential for clinical application.

Graphical abstract

关键词

常温机械灌注 / 器官保存 / 扩大标准供体 / 缺血再灌注损伤

Key words

Normothermic Machine Perfusion / Organ Preservation / Expanded Standard Donors / Ischemia-Reperfusion Injury

肝移植是治愈终末期肝病的最终手段^［1］。然而，肝衰竭患者数量逐年增加和供体器官的相对短缺，导致多数患者在等待移植的过程中死亡^［2］。因此，使用扩大标准供体（expanded criteria donors，ECD），如患有糖尿病或高血压、高龄、高度肝脂肪变性、高钠血症和循环死亡后捐献（donation after circulatory death，DCD）等潜在健康问题的供体，可以有效扩大供体器官池，但这同时也带来了新的挑战^［3-4］。特别是DCD供体，其在移植前长期处于热缺血状态，在移植后复灌会经历缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）^［5］，增加移植后并发症的风险，如原发性移植物无功能（primary graft nonfunction，PNF），早期同种异体移植物功能障碍（early allograft dysfunction，EAD）和缺血性胆道病变（schemic-type biliary lesions，ITBLs）^［6-8］。

目前，静态冷保存（static cold storage，SCS）仍是器官体外保存的金标准，但长时间的低温保存会造成低温损伤，导致供体器官功能和活力难以评估^［9-10］，无法满足目前对边缘供体器官评估与修复的需要。常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）通过在接近生理温度的条件下，以循环方式将含有氧气和营养物质的灌注液灌注至肝脏，以维持器官的代谢活性和功能^［11-12］。不同于SCS，NMP模拟了器官体内的生理环境，不仅能在器官保存期间维持其生理功能，减少缺血再灌注损伤，还允许在移植前对器官进行功能评估和修复^［13］。NMP技术已在肝脏、肾脏、心脏等器官移植领域得到应用，并显示出提高边缘供体器官利用率和移植成功率的潜力^［14-18］。瑞士苏黎世大学医院ESHMUMINOV等^［19］将人肝在体外NMP保存长达1周，模拟移植后复灌发现NMP保存肝脏与SCS对照组肝功能无明显差异。LAU等^［16］为解决供体短缺问题，首先对劈离肝进行NMP，肝脏在体外保存最长达13 d。

目前国内关于NMP应用的报道相对较少，仅有少数中心尝试过采用NMP体外保存器官或肢体^［20-23］。因此，NMP技术在国内的全面推广仍需积累更多的保存器官证据和经验。本文报道了1例临床弃用的病肝，通过NMP技术体外保存48 h后，恢复了部分生理功能，并通过病理学证实了NMP在体外对废肝的修复作用，这为移植物离体保存和质量评估提供了进一步的数据支持。

1 方法与材料

1.1　肝脏来源

本研究经武汉大学中南医院医学伦理委员会科研项目伦理审批通过（审批号：2024120K），于2024年12月收集了1例于本院进行同种异体肝移植手术患者切除的弃肝，进行NMP实验。NMP过程中所使用灌注液来源于本例公民逝世后器官捐献者血液（700 mL）。

1.2　主要材料与设备

材料：UW液（威斯康星大学）、肝素、羟乙基淀粉、5%葡萄糖注射液（科伦）、复方氨基酸注射液（宜昌三峡制药有限公司）、哌拉西林钠舒巴坦钠（山东二叶制药有限公司）、甲泼尼龙琥珀酸钠、谷胱甘肽（双益健）、天晴甘美（正大天晴药业集团）和外泌体（TG3生物人工肝种源细胞的外泌体和MSC间充干细胞外泌体按3∶1复配液，仝干公司）。方法：手术获取病肝，经历20 min热缺血，取部分样本作为灌注前病理检测，后使用4 ℃ UW液从门静脉，肝动脉进行灌洗，至灌注液清亮，病肝保存于冰桶经历7 h冷缺血后，将肝动脉、门静脉和腔静脉连接灌注系统，胆管置管后外置，将肝素化血液于800 mL羟乙基淀粉中稀释后进行灌注，设置初始灌注压力30 mmHg，设置初始流量1 100 mL·min^-1，设置初始动脉氧分压180 mmHg，设置加热器35 ℃。在灌注0.5 h时依次加入哌拉西林钠舒巴坦钠1 g、甲泼尼龙琥珀酸钠500 mg、5%葡萄糖注射液100 mL、复方氨基酸注射液150 mL、谷胱甘肽0.6 g、天晴甘美50 mg和外泌体配置液5 mL。后续哌拉西林钠舒巴坦钠、复方氨基酸、5%葡萄糖、谷胱甘肽和天晴甘美相同剂量每24 h补充一次，药物作用见表1。于6、10、19、24、30、32、46 h时取样对血氧分压、电解质和代谢产物进行检测，于2、12、33、44 h时取样对肝生化指标进行检测，在灌注24 h时取灌注后样本病理，整个肝脏在灌注48 h后废弃处理。对样本进行蜡块包埋，后进行HE、TUNEL和免疫组化染色（赛维尔公司）。设备：蠕动泵、微血栓过滤器、加热水箱、膜式氧合器、压力检测系统、全自动血生化分析仪和白细胞过滤器。

2 结果

2.1　肝脏大体观

灌注系统在体外成功搭建，肝脏肉眼观：3 h时肝脏大部分充血红润，部分肝脏呈现黑色轻微缺血区（如图1A）。24 h时肝脏整体充血红润，缺血区明显减少（如图1B）。

2.2　肝脏压力、流量、胆汁生成量和温度

缓慢增加灌注压力和流量，在40 h肝门动脉血管压力达到76.5 mmHg，门静脉血管压在33 h时达到20 mmHg（图2A）。在22 h整体流量超过1 400 mL·min^-1，后续调整流量31 h后，流量维持在2 600~2 670 mL·min^-1（图2B），并且随着流量增加，胆汁生成量从最初6 h的10 mL恢复到70 h的280 mL（图2C）。这表明充分的灌注流量可能对胆汁生成有着正向作用，在整个灌注过程中保持温度在35 ℃左右（图2D）。

2.3　肝脏代谢状态和灌注液电解质检测

随着灌注时间增加，灌注液pH逐渐下降，在第30 h达到7.45（图3A）。动脉氧分压维持在160~180 mmHg左右，静脉分压在20 mmHg左右（图3B）。代谢废物乳酸在第10小时后呈现下降趋势，可能肝脏开始启动乳酸代谢功能（图3C）。在未进行干预条件下无机离子在一定范围内波动（图3D、3E）。

2.4　肝功能和生化指标检测

丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）在前11 h缓慢上升，在11~32 h上升速度较前增快，天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transferase，AST）在前32 h逐渐上升，这可能与灌注第1天远端轻微缺血区相关，在32 h后转氨酶开始出现下降趋势（图3F），胆红素在11 h后浓度呈现缓慢上升状态，可能与此时胆汁排泄上升相关（图3G），白蛋白也在11 h迅速上升，表明肝脏可能恢复蛋白合成功能，在11 h后，从之前A/G<0.1到35 h时A/G>1（图3H、3I）。

2.5　肝病理变化

相对于灌注前，经过24 h NMP处理之后，肝细胞坏死明显减轻，肝窦间隙内红细胞淤积明显减少，血管脉络系统清晰。具体变化如下：灌注前肝细胞广泛坏死，细胞形态丧失，细胞核崩解，伴随大量空泡形成，间质水肿，部分炎症细胞浸润，呈现组织结构严重受损的表现。灌注24 h后：肝组织结构明显较为完整，肝细胞形态有所恢复，水肿减轻，炎症细胞浸润变少，坏死区域减少，细胞核较为完整，提示肝细胞存活率提高，肝窦结构恢复，微循环灌注明显改善。废肝TUNEL染色显示较多散在绿色荧光信号，提示肝细胞凋亡水平较高。经NMP 24 h后，绿色荧光信号减少，提示肝细胞凋亡率降低。MPO染色显示：废弃肝脏有大量棕色阳性细胞，提示中性粒细胞浸润严重，炎症反应显著。经过NMP修复，棕色阳性细胞数量减少，炎症反应减轻。CD206免疫组化染色显示：灌注前阳性细胞数量较少，提示M2型巨噬细胞活性较低。灌注后，棕色阳性细胞（黑色箭头标示）明显增多，说明M2型巨噬细胞增加（图4）。

3 讨论

本研究通过NMP技术成功保存并部分恢复了临床废弃肝脏的功能，在体外维持48 h，优于之前国内报道12 h动物肝脏NMP的记录^［24］，证实了NMP在肝脏体外保存中的可行性与有效性。研究表明：与传统SCS相比，NMP能够模拟体内生理环境，维持器官代谢活性，减缓了损伤加重，并允许实时评估肝脏功能。本次实验结果中，胆汁生成、乳酸代谢及蛋白合成功能的恢复尤为突出，表明肝脏合成代谢功能启动；并且通过病理结果表明，NMP可以显著减少肝细胞凋亡和炎症反应，增加抗炎修复型巨噬细胞的数量，从而改善肝组织的病理状态。这进一步验证了NMP在肝脏保护和功能恢复中的潜在价值，提示NMP对于临床边缘供体器官的保存和功能评估具有重要应用前景。但本研究仍存在一定局限性，样本量较少，所得结果的普适性和准确性仍需通过大规模的实验验证，病理结果还需要完善，缺少电镜提示NMP前后组织内部的细微结构变化；另外NMP的关键参数，如灌注时间、灌注压力、氧分压和血流量等，还需要更多实验数据来确定最佳条件。系统的长时间平稳运行需专人看护，并且本次NMP缺乏移植后临床数据支持，此后，还需要进一步优化NMP实验。NMP在器官保存和移植领域取得显著进展。NMP已在早期DCD肝移植动物模型中证明可提升移植肝存活率和评估器官活力。RAVIKUMAR等^［25］开展的Ⅰ期临床试验和NASRALLA等^［26］的随机对照试验证实了NMP的安全性和有效性，显著降低供肝损伤和废弃率，但未显著改善胆管并发症。MERGENTAL等^［27］研究表明NMP能使高风险肝脏成功移植，但无法完全防止胆管狭窄。2022年，HANN等^［28］进一步证实NMP减少DCD肝移植不良并发症。随着新型技术不断涌现，如今开发的肝脏灌注仪能将离体肝脏保存长达1周，延长器官评估窗口。QUINTINI等^［29］利用NMP装置修复废弃肝脏，显著提高移植成功率。此外，国内郑少忆团队LU等^［30］构建的心脏NMP模型表明，加入褪黑素可改善缺血再灌注损伤，拓展了NMP在心脏移植领域的应用。何小顺团队ZHAO等^［31］研究出一种FXR激动剂的新型器官养护液配方。通过阻断NF-κB通路介导的炎症反应，在小鼠、DCD猪肝及人类废弃肝NMP模型中，FXR激动剂GW4064降低炎性因子释放，使废弃肝修复达临床移植标准。总的来看，NMP正逐渐成为改善器官质量、扩展供体来源的重要技术手段。

NMP为供肝的代谢和功能恢复创造了理想条件，减少了体外保存对供肝的损伤，同时为供肝体外评估及干预治疗提供了前提。通过多中心、大样本的临床研究，结合其他治疗手段^［32-34］（如基因编辑、间充质干细胞治疗及脱脂治疗等），NMP有望在临床中实现更广泛的应用，提高边缘供体器官的利用率，缓解供体短缺的问题。并且随着新兴学科发展，灌注液的不断改良，NMP有着更广阔的应用前景：华南理工大学研发出纳米级非晶硅酸盐红细胞对动物肝脏进行NMP具备良好的氧气输送能力、为跨物种输血提供了可能性^［35］；ZARNITZ等^［36］使用牛磺酸、无细胞和氧载体的灌注液对猪肾进行6 h NMP，实现了与红细胞灌注液相当的器官保存效果。综上所述，本研究为NMP技术在临床肝脏保存中提供了重要实验依据，展望了其在器官移植领域的广阔前景。

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基金资助

国家自然科学基金委员会面上项目(82370758)