基于生物信息学分析TP63在乳腺癌中的表达及预后意义

Expression and prognostic significance of TP63 in breast cancer based on bioinformatics analysis

摘要

目的 探索肿瘤蛋白63（TP63）在乳腺癌（BRCA）中的表达，分析其预后价值并为BRCA患者的治疗决策作出贡献。 方法 利用TCGA、GSE93601和HPA数据库分析BRCA组织中TP63 mRNA和蛋白质表达水平，并分析其与临床病理特征的关系。通过Kaplan‑Meier生存分析及单因素和多因素Cox回归分析探究TP63表达对BRCA患者预后的影响。使用Limma包分析TP63高表达组和低表达组的差异表达基因并采用富集分析预测BRCA中TP63相关的功能和通路。使用SMART、cBioPortal和MethSurv工具研究BRCA中TP63 DNA甲基化状态。采用CIBERSORT算法研究BRCA中免疫细胞浸润水平与TP63表达的相关性。采用Spearman相关性分析评估TP63表达与DNA甲基化相关基因及免疫相关生物标志物表达的相关性。 结果 TP63表达在BRCA中显著降低，并且与不良病理特征和不良预后相关。富集分析显示TP63参与细胞因子‑细胞因子受体相互作用、紧密连接、激素信号通路、白细胞经内皮层迁移和细胞黏附分子等过程。TP63低表达可能与胞嘧啶‑磷酸‑鸟嘌呤（CpG）甲基化增强相关。分析TCGA转录组数据发现，TP63高表达组的免疫细胞浸润和免疫相关生物标志物表达增加，这可能表明高表达组对免疫疗法的反应更为有利。 结论 TP63在BRCA组织中低表达，有望作为独立预测BRCA预后的生物标志物，协助BRCA患者的诊断和治疗决策。

Abstract

Objective To explore the expression of tumor protein 63 (TP63) in breast cancer (BRCA), and to study its prognostic value and contribution to the treatment decisions of BRCA patients. Methods The expression levels of TP63 mRNA and protein in BRCA tissues were analyzed by using data from TCGA, GSE93601, and HPA databases, and their relationship with clinicopathological characteristics was examined. The effect of TP63 expression on the prognosis of BRCA patients was investigated using Kaplan-Meier survival analysis and univariate and multivariate Cox regression analysis. Differentially expressed genes between the TP63 high-expression group and the low-expression group were analyzed using the Limma package, and enrichment analysis was used to predict TP63-related functions and pathways in BRCA. SMART, cBioPortal and MethSurv tools were used to study the DNA methylation status of TP63 in BRCA. The CIBERSORT algorithm was used to study the correlation between the level of immune cell infiltration and TP63 expression in BRCA. Spearman correlation analysis was used to evaluate the correlation between TP63 expression and the expression of DNA methylation‑related genes and immune-related biomarkers. Results TP63 expression was significantly reduced in BRCA and was associated with adverse pathological features and poor prognosis. Enrichment analysis showed that TP63 was involved in cytokine‑cytokine receptor interaction, tight junction, hormone signaling, leukocyte transendothelial migration, and cell adhesion molecules. Low TP63 expression may be associated with enhanced cytosine‑phosphate‑guanine (CpG) methylation. Analysis of the transcriptome data from TCGA revealed that the immune cell infiltration and immune related biomarker expression in the TP63 high expression group increased, which may indicate that the high expression group has a more favorable response to immunotherapy. Conclusion TP63 is lowly expressed in BRCA tissues and is expected to serve as an independent biomarker for predicting BRCA prognosis, assisting in the diagnosis and treatment decisions of BRCA patients.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / TP63 / 预后标志物 / 生物信息学 / 甲基化 / 免疫浸润分析

Key words

Breast Cancer / TP63 / Prognostic Marker / Bioinformatics / Methylation / Immune Infiltration Analysis

根据2022年全球癌症统计数据^［1］显示，乳腺癌（breast cancer，BRCA）是女性最常见的癌症类型，也是癌症相关死亡的主要原因。根据《CSCO乳腺癌诊疗指南2024》^［2］将乳腺癌分为人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性、三阴性、激素受体（hormone receptor，HR）阳性和HER2低表达四类。不同分类的乳腺癌都有较为成熟的治疗方案^［3］，分子理解的进步也促成了新的免疫疗法和靶向治疗的应用，显著改善了乳腺癌患者的预后^［4‑6］，已发现越来越多乳腺癌预后和治疗的分子靶点^［7‑8］。然而，乳腺癌是具有高度异质性的疾病，每个患者都有不同的个体特征，因此患有相同亚型乳腺癌的患者对治疗的反应具有个体差异。乳腺癌耐药性是乳腺癌治疗面临的重大挑战。因此，新的生物标志物不仅对于改进诊断是必要的，而且对于改善患者对治疗的反应和预后也是必要的^［9］。

肿瘤蛋白63（tumor protein 63，TP63）是p53转录因子家族的一员，由位于染色体3q28的TP63基因编码。TP63与发育和分化、增殖、干细胞维持、衰老和细胞凋亡等多种生物学功能有关。TP63通常表达于乳腺系统的肌上皮细胞层^［10］。TP63基因编码多种亚型的蛋白质，主要包括TAp63和ΔNp63两类。由于这两类蛋白质的作用相反，TP63基因在乳腺癌中发挥的作用难以阐明。目前的研究^{［11‑13］}普遍认为TAp63作为肿瘤和转移抑制因子在乳腺癌中发挥抗肿瘤作用，而ΔNp63作为致癌因子参与乳腺癌的转移和干性维持^{［14‑17］}。此外，研究^［18］发现ΔNp63α参与白细胞介素‑1β（interleukin‑1β，IL‑1β）诱导的乳腺癌细胞顺铂耐药。有研究^［19］表明，TP63表达下调与BRCA患者的无复发生存期和无转移生存期较差有关。因此，本研究旨在探索TP63表达，分析其预后价值，并为BRCA患者的治疗决策作出贡献。

1 材料与方法

1.1　数据收集

BRCA组织及癌旁组织的转录组数据以及对应的临床病理参数和随访数据来自癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）。用于验证的BRCA数据集从基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取^［20］，访问编号为GSE93601。人类蛋白质图谱（the Human Protein Atlas，HPA）数据库（https：//www.proteinatlas.org/）提供了BRCA组织（32例）和癌旁组织（9例）的免疫组织化学染色图像和蛋白质组学数据^［21］。

1.2　RNA和蛋白表达分析

首先，本研究使用TIMER（tumor immune estimation resource）^［22］评估多种恶性肿瘤的肿瘤和正常组织中TP63的差异表达。随后，对TCGA‑BRCA数据集和GSE93601数据集进行单基因的差异分析，以确认BRCA中TP63的mRNA表达水平。使用Wilcoxon秩和检验确定显著性水平，P<0.05表示有统计学意义。受试者工作特征（ROC）曲线及其曲线下面积（AUC）评估了TP63表达在区分乳腺癌组织和正常组织方面的准确性。此外，利用HPA数据库的正常和肿瘤组织样本的免疫组织化学染色图像和数据，证实TP63的蛋白质表达水平。R软件（4.4.2版）进行统计分析，ggplot2包（3.5.1版）将结果可视化。

1.3　临床病理特征和预后分析

首先，整理TCGA‑BRCA数据集的临床信息，删除含有未知信息的样本及随访期少于30 d的样本，最后获得789例具有完整临床信息的乳腺癌患者样本。随后，使用卡方检验和Fisher确切概率法分析了TP63 mRNA表达与BRCA各种临床病理特征之间的关系。通过Kaplan‑Meier方法进行了总生存期（overall survival，OS）分析。使用survminer包（0.5.0版）中的surv_cutpoint函数寻找最佳截断值进行分组，ggsurvplot函数绘制生存曲线。最后，应用单因素和多因素Cox回归模型分析影响BRCA患者OS的可能危险因素。使用R软件（4.4.2版）完成统计分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

1.4　功能和通路富集分析

根据生存分析的最佳截断值将BRCA患者分为TP63低和高表达组。利用Limma包（3.62.1版）评估这两组之间基因表达的差异。将差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的阈值设置为伪发现率（false discovery rate，FDR）<0.05和倍数变化（fold change，FC）>2，即|log₂FC|>1。生成一个火山图来可视化显著过表达和低表达的基因。此外，还运用pheatmap包（1.0.12版）绘制了一个热图来显示前50个上调和下调的基因。随后，使用ClusterProfiler包（4.14.4版）进行京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析和基因本体论（gene ontology，GO）富集分析。如果P<0.05，则认为该通路被富集。

1.5　免疫细胞浸润分析

使用CIBERSORT（Cell-type Identification by Estimating Relative Subsets of RNA Transcripts）算法评估了BRCA组织中22种免疫细胞的浸润状态。采用Spearman相关性分析以确定TP63表达水平与免疫细胞浸润状态间的关联。此外，绘制提琴图展示TP63低和高表达组的BRCA微环境中各种免疫细胞的比例。

1.6　免疫相关生物标志物分析

采用Spearman相关性分析以确定TP63表达水平与免疫相关生物标志物间的关系。其中，程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death 1，PDCD1/PD‑1）、程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，CD274/PD‑L1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T‑lymphocyte associated protein 4，CTLA4）和淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activating 3，LAG3）是与肿瘤免疫逃逸相关的重要免疫检查点标志物^［23］；T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）、T细胞免疫球蛋白黏蛋白‑3（T cell immunoglobulin and mucin domain‑containing protein 3，TIM3/HAVCR2）、LAYN（layilin）和CXC基序趋化因子3（C‑X‑C motif chemokine ligand 3，CXCL3）是T细胞耗竭标志物；干扰素γ（interferon gamma， IFN‑γ）、白细胞介素2（interleukin 2，IL‑2）、颗粒酶B（granzyme B，GZMB）和穿孔素1（perforin 1，PRF1）是T细胞效应功能标志物。此外，本研究还分析了这些基因在TP63低和高表达组中的差异表达。

1.7　表观遗传修饰分析

首先，通过SMART^［24］分析了多种恶性肿瘤的肿瘤和正常组织中TP63的CpG聚集甲基化值。随后，Spearman相关分析了TP63基因与DNA甲基化相关基因之间的关系，包括DNA甲基转移酶（DNA methyltrans‑ferases， DNMTs）家族成员DNMT1/3A/3B、tRNA天冬氨酸甲基转移酶（tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1）、TET蛋白（Ten‑eleven translocation，TET）家族成员TET1‑3、甲基CpG结合结构域（methyl‑CpG‑binding domain，MBD）家族成员MBD1‑4和甲基化CpG结合蛋白‑2（methyl‑CpG‑binding protein 2，MECP2）^［25］。此外，本研究还分析了这些基因在TP63低和高表达组中的差异表达，然后使用cBioPortal（cBio Cancer Genomics Portal）数据库^［26］分析了BRCA中TP63表达与TP63甲基化的相关性。散点图显示BRCA中每个样本的TP63表达和甲基化水平。最后，基于MethSurv观察了TCGA‑BRCA队列的TP63 DNA中多个探针的甲基化状态^［27］。

1.8　列线图的构建和评估

在多因素Cox回归分析的基础上建立基于独立预后因素的列线图。然后，使用Calibration校准曲线来评估列线图的性能。此外，使用一致性指数（Concordance Index，C‑index）来衡量预测和观察到的生存概率之间的差异。

2 结果

2.1　TP63表达水平在BRCA中显著降低

TIMER评估了TP63在多种恶性肿瘤和相应正常组织中的差异表达。结果发现，与相应的正常组织相比，BRCA组织中的TP63表达显著降低（P<0.001，图1A）。此外，使用TCGA‑BRCA数据集，在RNA水平上分析了肿瘤和正常组织TP63的差异（图1B）及配对差异分析（图1C），进一步验证了上述结果。GSE93601（n=1 110）数据集证实BRCA组织中的TP63表达下调（P<0.000 1，图1D）。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明，BRCA患者的TP63基因表达在预测疾病存在方面表现出高水平的准确性（图1B~1D）。然后，分析HPA数据库中的BRCA组织和正常乳腺组织中的免疫组织化学染色图像后发现，在9例正常乳腺组织中，肌上皮细胞或腺细胞高表达TP63蛋白，数量为>75%；而在32例乳腺癌组织中，15例未检测到TP63蛋白，14例低表达和3例中等强度的表达（图1E）。总之，乳腺癌组织中的TP63蛋白表达低于正常乳腺组织，这与RNA水平的结果一致。

2.2　TP63低表达与BRCA的多种临床病理特征和不良预后相关

进一步分析BRCA中TP63 mRNA表达和临床病理特征的关系，结果显示，年龄、种族、病理分期和T分期是TP63表达的影响因素（表1）。Kaplan‑Meier法用于评估TP63表达水平与BRCA预后之间的关联。结果显示，与TP63高表达组相比，TP63低表达组的BRCA患者OS较差（P=0.000 14，图2）。为了更全面地了解BRCA患者的预后指标，我们采用了单因素和多因素Cox回归分析（表2）。单因素Cox回归分析的结果显示，年龄、T分期、N分期、M分期和TP63表达与乳腺癌患者的OS相关。多因素Cox回归分析进一步证实，TP63表达、N1分期、N2分期、N3分期、M1分期和年龄是BRCA患者OS的独立预后因素。

2.3　TP63相关差异表达基因的功能富集分析

为了研究TP63低和高表达组之间的转录组差异，我们使用TCGA‑BRCA数据集分析了两组中的差异表达基因。结果显示，与TP63低表达组相比，TP63高表达组有346个基因上调，61个基因下调（图3A）（见图S1，手机扫描本文OSID可查看）。对所有DEGs进行KEGG和GO富集分析。KEGG分析结果显示，差异基因主要富集在神经活性配体‑受体相互作用、细胞因子‑细胞因子受体相互作用、紧密连接、激素信号通路、白细胞经内皮层迁移和细胞黏附分子等相关通路中（图3B）。GO富集分析的结果包括生物学过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三个方面。在BP相关的分析中，差异基因主要富集在体液免疫反应、表皮发育、抗菌体液反应、细胞外基质组织和细胞外结构组织等。在CC相关的分析中，差异基因主要富集在含胶原的细胞外基质、免疫球蛋白复合物、血液微粒、顶端连接复合体和角化套膜等。在MF相关的富集分析中，差异基因主要富集在糖胺聚糖结合、G蛋白偶联受体结合、细胞因子活性和细胞外基质结构成分等（图3C）。

2.4　TP63表达水平与BRCA中多种免疫细胞的浸润相关

结果显示，TP63表达水平与初始B细胞（R=0.40，P<0.000 1）、浆细胞（R=0.26，P<0.000 1）、CD8⁺ T细胞（R=0.14，P=0.005 3）、静息CD4⁺记忆T细胞（R=0.22，P<0.000 1）、单核细胞（R=0.21，P<0.000 1）、静息树突状细胞（R=0.25，P<0.000 1）和静息肥大细胞（R=0.20，P<0.000 1）呈正相关，而与M0巨噬细胞（R=-0.36，P<0.000 1）和M2巨噬细胞（R=-0.18，P=0.000 3）呈负相关（图4A）。此外，TP63低和高表达组中初始B细胞、浆细胞、CD8⁺ T细胞、静息CD4⁺记忆T细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息树突状细胞和静息肥大细胞的肿瘤浸润水平与Spearman分析结果一致（图4B）。我们发现，与TP63低表达组相比，TP63高表达组的BRCA中浸润的CD8⁺ T细胞和M1型巨噬细胞增多，而M2型巨噬细胞减少，这可能是TP63高表达组患者预后较好的原因之一。

2.5　TP63表达与BRCA中的免疫相关标志物相关

在BRCA中，TP63表达与LAYN（R=0.42，P<0.000 1）表达呈正相关，而与其他免疫相关标志物的相关性不强（图S2，手机扫描本文OSID可见）。我们进一步分析了TP63低和高表达组中免疫相关标志物的差异表达。结果显示，除LAG3和HAVCR2，其他免疫相关标志物在TP63高表达组中均上调（见图S3，可扫描本文OSID二维码查看）。TP63高表达组的患者可能对PD‑1/PD‑L1和CTLA4阻断疗法具有更良好的反应性。

2.6　BRCA中TP63表达下调与DNA甲基化修饰有关

BRCA组织中TP63的CpG聚集甲基化水平显著高于正常组织（P<0.000 1，图5A）。随后，我们分析了BRCA中与DNA甲基化相关酶的表达与TP63基因表达之间的相关性，结果显示这些基因表达与TP63表达的相关性很弱（见图S4A，可扫描本文OSID二维码查看）。本研究进一步分析了DNA甲基化相关基因在TP63低和高表达组中的差异表达，结果显示TP63高表达组的DNMT3B下调而MECP2上调（见图S4B，可扫描本文OSID二维码查看）。然而，这并不能直接反映TP63表达与TP63甲基化的相关性。因此，本研究使用cBioPortal工具分析了两个乳腺癌数据集中TP63表达与TP63甲基化的关系，发现二者呈负相关（图5B）。然后，采用MethSurv工具分析BRCA中TP63 DNA甲基化水平。结果显示，TP63 DNA序列中大多数甲基化位点在BRCA中是高甲基化的（图S5，手机扫描本文OSID可见）。

2.7　构建并评估基于独立预后因素的列线图

为预测BRCA患者的预后，本研究构建了整合TP63表达和独立临床危险因素（年龄、N分期和M分期）的列线图。较高的总分与较差的预后相关（图6A）。此外，采用C‑index（0.742，95%CI：0.689~0.795）和Calibration校准曲线评估列线图预测性能（图6B~6D）。结果表明TP63作为影响BRCA患者预后的独立因素起着至关重要的作用。

3 讨论

BRCA是女性最常见的癌症类型和癌症相关死亡的主要原因。尽管BRCA的治疗已经有比较成熟的方案，但是肿瘤的异质性和患者的个体差异严重影响治疗效果。因此，仍然需要进一步寻找新的生物标志物，从而为BRCA的治疗提供新思路。TP63是一种转录因子，属于TP53家族成员，主要编码TAp63和ΔNp63两种亚型的蛋白质。既往研究^{［12‑13］}表明TAp63是一种肿瘤和转移抑制因子，TAp63缺失使小鼠和人的乳腺上皮细胞转化为肿瘤起始细胞并且导致小鼠BRCA发生远处转移。此外，靶向IL13Rα2激活了IL13‑STAT6‑TP63信号轴，从而抑制BRCA细胞的迁移和肺转移^［19］。而ΔNp63作为致癌因子在BRCA中发挥促肿瘤作用。从原发肿瘤到肿瘤播散再到远处转移的过程中存在ΔNp63的振荡表达。有研究^［28］在基因工程BRCA原位小鼠模型中调节了BRCA转移过程中ΔNp63的表达（即最初表达ΔNp63，然后沉默ΔNp63，然后重新表达ΔNp63），发现ΔNp63的振荡表达是BRCA有效转移并定植于肺部所必需的。此外，ΔNp63在BRCA的转移播散、干性维持和顺铂耐药方面发挥重要作用^{［15‑18］}。TAp63和ΔNp63具有相反的功能，因此，TP63基因在BRCA中的作用值得进行全面的研究和进一步的探索。本研究希望通过联合多个肿瘤数据库进一步挖掘TP63在BRCA中的表达，分析其预后价值并为BRCA患者的治疗决策作出贡献。

本研究发现BRCA中TP63表达异常下调，且高表达患者预后显著改善。单因素和多因素Cox回归分析证实TP63是BRCA患者OS的独立预后因素。转录组分析揭示407个TP63相关DEGs，富集分析提示其通过调控多个生物学过程及通路影响肿瘤进程。肿瘤微环境中的免疫细胞浸润与肿瘤发生发展密切相关，是预测BRCA患者预后的重要因素^［29］。免疫浸润分析的结果表明高水平的TP63可能通过调节BRCA中浸润的免疫细胞数量来影响BRCA的预后。此外，发现TP63高表达组中部分免疫相关标志物表达上调。这些发现支持TP63在BRCA中的潜在抑制作用。基因失调可以由多种机制引起，但DNA甲基化修饰是与致癌作用密切相关的关键机制^［25］。本研究结果发现DNA甲基化可能是调节TP63表达的重要机制，但这只是一个假设，需要进行研究和验证。

综上所述，本研究揭示了BRCA中的TP63表达谱以及TP63下调与BRCA患者较差的预后存在显著关联。我们研究了BRCA中TP63低表达的潜在机制，发现TP63的下调可能与TP63 DNA高甲基化有关。此外，本研究观察到TP63低表达对免疫细胞浸润的负面影响。以高免疫浸润和免疫检查点表达为特征的TP63高表达组可能决定对PD‑1/PD‑L1和CTLA4阻断疗法的反应更有利。总之，本研究结果表明TP63表达可用于预测BRCA的预后。尽管如此，本研究仍有不足之处。首先，研究只涉及两个数据集，这限制了患者群体的多样性并导致选择偏倚。其次，使用的数据缺少BRCA患者的分子分型和治疗方案的信息，这可能会影响其预后和TP63表达，需要在后续研究中补充大样本量的临床数据进一步分析。最后，TP63影响BRCA发生发展的确切机制仍不清楚，需要进一步研究以揭示TP63发挥作用的潜在机制。

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基金资助

湖北省自然科学基金创新发展联合基金(2024AFD426)

武汉大学中南医院科技创新培育基金(CXPY2023049)

湖北省卫健委科研项目(ZYYCC2023005)