缺血性心肌病中关键m6A RNA修饰调控因子的表达模式及其自噬调控作用

Expression patterns of key m6A RNA modification regulators and associated autophagy regulation in ischemic cardiomyopathy

摘要

目的 探究m6A修饰在缺血性心肌病（ICM）中的表达模式、调控机制及其与自噬的关联。 方法 下载基因表达综合数据库（GEO）中GSE57338数据集，筛选差异表达的m6A RNA修饰调控因子（m6A‑RMRs），并采用ROC曲线评估其诊断效能。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定与m6A‑RMRs显著相关的模块。从HAMdb、HMDB和GSEA数据库获取候选自噬相关基因（Candidate‑ARGs），进一步鉴定m6A RNA修饰相关自噬基因（m6A‑RMARGs）。通过基因交集分析、富集分析和蛋白质互作（PPI）网络筛选关键基因，并构建心肌缺氧模型验证其表达。 结果 共筛选出15个差异表达的m6A‑RMRs，其中7个（METTL14、FMR1、VIRMA、WTAP、YTHDC1、ZC3H13、FTO）的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）>0.7。WGCNA分析显示，MEturquoise模块与m6A RNA修饰显著相关，其自噬相关基因富集于“自噬”“mTOR信号通路”“细胞凋亡”等通路。进一步验证表明，CCL2、DIRAS3、NAMPT和STAT3被鉴定为ICM的潜在生物标志物。 结论 CCL2、DIRAS3、NAMPT和STAT3可能参与ICM的自噬及m6A修饰机制，干扰这些基因或为潜在的治疗策略。

Abstract

Objective To investigate the regulatory mechanisms of m6A modification and its association with autophagy in ischemic cardiomyopathy (ICM). Methods The mRNA microarray dataset GSE57338 was downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database. Differentially expressed m6A RNA modification regulators (m6A‑RMRs) were screened, and their diagnostic efficacy was evaluated using receiver operating characteristic (ROC) curves. Weighted gene co‑expression network analysis (WGCNA) was employed to identify modules significantly associated with m6A‑RMRs. Candidate autophagy‑related genes (Candidate‑ARGs) were obtained from the HAMdb, HMDB, and GSEA databases, and m6A modification‑related autophagy genes (m6A‑RMARGs) were further identified. Key genes were screened through gene intersection analysis, enrichment analysis, and protein‑protein interaction (PPI) network analysis. A myocardial hypoxia model was constructed to validate the expression of key genes. Results A total of 15 differentially expressed m6A‑RMRs were identified, among which 7 genes (METTL14, FMR1, VIRMA, WTAP, YTHDC1, ZC3H13, and FTO) exhibited an area under the curve (AUC)>0.7. WGCNA analysis revealed that the MEturquoise module was significantly associated with m6A RNA modification, and its autophagy‑related genes were enriched in pathways such as "autophagy", "mTOR signaling pathway", and "apoptosis". Further validation identified CCL2, DIRAS3, NAMPT, and STAT3 as potential biomarkers for ICM. Conclusion CCL2, DIRAS3, NAMPT, and STAT3 may participate in autophagy and m6A modification mechanisms in ICM, and targeting these genes could represent a potential therapeutic strategy.

Graphical abstract

关键词

缺血性心肌病 / m6A / 自噬 / WGCNA

Key words

Ischemic Cardiomyopathy / m6A / Autophagy / WGCNA

缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy，ICM）以左心室扩张和收缩功能障碍为特征，由长期心肌缺血或梗死后纤维化引发，是全球心血管疾病的主要死因之一^［1‑2］。尽管目前已有多种治疗手段，如药物治疗、介入治疗等，但其疗效仍然有限，因此，探索ICM的分子机制和潜在靶点，寻找改善ICM患者预后的治疗策略尤为迫切。

N6‑甲基腺苷（（N6‑methyladenosine，m6A）修饰作为关键表观遗传调控机制，发挥基因表达、RNA剪接、RNA稳定性等作用^［3‑4］。研究^［5‑7］表明，m6A修饰通过调控特定基因的表达，参与心肌细胞的增殖、凋亡以及重塑过程。自噬作为细胞内一种重要的降解机制，能够维持细胞稳态、清除损伤细胞器并调节能量平衡^［8］。近年来的研究^［9‑10］发现，自噬既能保护心肌细胞免受压力损伤，也可能通过调节心肌细胞的生存状态影响ICM的进程。此外，研究^［11］表明，m6A修饰可能调控自噬，但二者在ICM中的相互作用尚未阐明，本研究旨在通过生物信息学方法，探索m6A修饰与自噬在ICM中的关系，识别出潜在的关键基因，为ICM机制研究和靶向治疗提供新依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

AC16细胞购自北纳生物（河南信阳）；胰酶、DMEM培养基、胎牛血清均购自Gibco公司；RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞公司；逆转录试剂盒及qPCR试剂盒均购自上海翌圣公司。

1.2 数据收集与获取

从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载ICM数据集GSE57338（含95例患者及136例对照心肌组织）。采用R语言“Limma”包筛选ICM组与对照组的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），设定阈值|log₂FC|>0.5且P<0.05，其中FC为差异倍数（fold change）。

1.3 m6A RNA修饰调控因子鉴定

检索文献共纳入21个m6A RNA修饰调控因子（RNA modification regulators，m6A‑RMRs）。根据其在数据集中的表达水平，筛选出15个显著差异表达的m6A‑RMRs。

1.4 预测价值评估

采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估m6A‑RMRs对ICM患者的预测效能，绘制ROC曲线并计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。AUC>0.7提示模型具有良好预测能力。

1.5 共表达网络构建

利用R语言“WGCNA”包构建共表达网络，剔除离群样本后选择β=6作为无标度拓扑模型的软阈值；将邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵（TOM），基于TOM相异性度量将mRNA划分为不同模块（最小模块基因数=30，合并高度=0.25）；采用Pearson相关分析模块特征值与m6A‑RMRs的相关性，筛选相关性最强的模块作为ICM关键基因模块，并进行功能富集。

1.6 功能富集分析

利用DAVID 6.8（http：//david.ncifcrf.gov/）对关键模块基因进行GO/KEGG富集分析，显著性阈值设为P<0.05。

1.7 蛋白相互作用分析

将m6A‑RMRs导入STRING数据库，构建蛋白质‑蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，设定节点连接度≥7为筛选阈值，通过Cytoscape 3.9.0可视化。

1.8 细胞培养和处理

细胞培养于含有10%胎牛血清的培养基中，为了模拟缺氧条件，细胞在无血清的培养基中培养24 h，培养条件为5%CO₂、1%O₂和94%N₂，以常氧状态的细胞作为对照组。

1.9 qRT-PCR检测

采用RNA提取试剂盒提取心肌细胞RNA，然后根据试剂盒说明书合成cDNA，逆转录产物cDNA则按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行qPCR扩增。以GAPDH为内对照，用2^-ΔΔCt 法计算基因表达量。引物信息见表1。

1.10 统计学分析

采用R 4.1.0和Graphpad Prism 9软件分析数据并绘图。非正态数据采用Mann‑Whitney U检验，相关性分析用Pearson法，ROC曲线评估诊断效能，显著性标准为P<0.05。

2 结果

2.1　m6A‑RMRs在ICM中的表达

本研究分析了GSE57338数据集中ICM与正常样本的m6A‑RMRs表达。结果显示，15个m6A‑RMRs（METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、VIRMA、ZC3H13、RBM15B、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF3、FMR1、LRPPRC、FTO和ALKBH5）存在差异表达（图1A、1B）。其中，FMR1和ZC3H13正相关性最高（r=0.64）（图1C）。然后以|log₂FC|>0.5和P<0.05为阈值，筛选出436个DEGs（图1D）。

2.2　m6A‑RMRs在ICM中的诊断价值

ROC曲线确定METTL14、VIRMA、ZC3H13、YTHDC1、FMR1、FTO和WTAP在ICM中具有较高的诊断价值，其AUC>0.7（图2）。

2.3　WGCNA鉴定m6A‑RMRs相关基因

WGCNA识别了30个共表达模块，且其与7个m6A‑RMRs的相关性被评估（图3A、3B）。MEturquoise模块与m6A调控因子（ZC3H13、FTO）显著相关（图3C、3D），共包含2 468个mRNA。这些与m6A‑RMRs相关的mRNA被定义为m6A‑RMRs相关基因（m6A‑RMRGs）。

2.4　m6A‑RMARGs功能富集分析与PPI网络构建

从HAMdb（http：//hamdb.scbdd.com/）、HMD（https：//hmdb.ca/）及GSEA（http：//www.gsea-msigdb.org/）共获取681个候选自噬相关基因（candidate autophagy‑related genes，Candidate‑ARGs），与m6A‑RMRGs交集筛选出m6A修饰相关自噬基因（m6A modification‑related autophagy genes，m6A‑RMARGs）（图4A）。GO分析显示：m6A‑RMARGs的生物过程主要集中于分解代谢过程及自噬调控等（图4B）；细胞组分主要集中在细胞器膜等（图4C）；分子功能主要集中在催化活性及酶结合等（图4D）；KEGG分析中，m6A‑RMARGs主要富集于自噬‑动物及mTOR信号通路等通路（图4E）。将m6A‑RMARGs导入在线数据库String，构建PPI网络（41节点，307边）（图4F）。

2.5　预测在ICM中关键的m6A‑RMARGs

为探索与ICM中m6A‑RMARGs的关键作用，通过把m6A‑RMARGs与ICM中DEGs相交，筛选出核心基因CCL2、DIRAS3、NAMPT及STAT3（图5A）。基于GSE57338数据集验证显示，上述基因在ICM中差异表达显著（图5B~5E），且ROC曲线分析证实其对ICM具有显著预测价值（AUC>0.75，图5F~5I）。

2.6　qRT‑PCR验证关键基因的表达

为探究缺氧对ARGs的影响，我们检测了AC16细胞缺氧模型与正常心肌细胞的BNP水平（图6A），并验证CCL2、DIRAS3、NAMPT、STAT3的表达。结果显示，这4个基因在缺氧条件下均呈现显著差异表达（图6B~6E）。同时，验证的7个m6A‑RMRs中，METTL14、FMR1、WTAP及ZC3H13表达有显著差异（图6F~6I）。

3 讨论

随着冠心病发病率上升，ICM对人类健康的威胁加剧^［12］。然而，ICM的机制尚未完全阐明，自噬和m6A修饰可能也参与了其发病过程。研究^{［13‑14］}发现，缺氧/复氧心肌细胞中m6A修饰上调伴随自噬抑制，提示m6A修饰与自噬可能存在关联。因此，本研究进一步探索了ICM中m6A修饰与自噬的相互作用。

本研究对关键模块m6A‑RMARGs进行KEGG/GO分析，这些基因富集于自噬调控、分解代谢及mTOR通路等方面。通过Cytoscape构建PPI网络，将DEGs、模块基因和自噬基因取交集筛选出关键基因（CCL2、DIRAS3、NAMPT、STAT3）。AC16缺氧模型证实，上述基因及m6A调控因子（FMR1、METTL14、WTAP、ZC3H13）均差异表达，提示这些基因有作为ICM机制研究与治疗靶点的潜力。

在ICM中与自噬相关的关键基因中，趋化因子2（CCL2）通过与其受体CCR2结合，在心血管疾病中也发挥重要作用，研究^［15］表明巨噬细胞通过冠状动脉疾病巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）/CCL2/CCR2促进小鼠从再灌注损伤到心脏纤维化的转变。DIRAS3是一种母源印记的肿瘤抑制基因，能够诱导自噬基因的表达，其对自噬的调控作用被广泛研究^{［16‑17］}。NAMPT是哺乳动物NAD补救途径中的一种胞质限速酶。研究^［18］表明，NAMPT的下调会导致主动脉缩窄模型中线粒体功能障碍和心脏功能障碍。STAT3是STAT蛋白家族的成员，当STAT3过表达时，心肌缺血/再灌注后的梗死面积显著减少，对缺血心肌具有一定的保护作用^［19］。上述基因的差异表达为ICM机制研究提供了潜在靶点。

此外，本研究发现ZC3H13与关键基因模块高度相关。ZC3H13是一种编码锌指蛋白，它在m6A RNA甲基化调控中起重要作用。心肌缺血时m6A甲基化上调伴随自噬流抑制和细胞凋亡增强，提示ZC3H13‑WTAP复合体可能通过促进m6A抑制心脏自噬^{［20‑21］}。FMR1由脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）基因编码。研究^［22］表明，FMR1敲除的小鼠铁积累，加重心脏负荷，可能作为心血管系统的保护因子。我们的研究中AC16缺氧模型中FMR1低表达与预测结果一致，因此FMR1也可能是潜在的生物标志物。

综上所述，本研究通过对m6A修饰因子及自噬相关基因的深入分析，揭示其在ICM中的潜在作用及其相互调控机制。此外CCL2、DIRAS3、NAMPT、STAT3等关键基因被筛选，这些基因不仅可能参与ICM的发生和发展，还具有作为潜在生物标志物的价值。未来的研究可以进一步验证这些基因在临床样本中的表达和功能，探索其作为ICM早期诊断和治疗靶点的可行性。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82370696)

武汉大学中南医院转化医学及交叉学科研究联合基金(ZNJC202308)