石蒜碱改善原代心肌成纤维细胞纤维化

Lycorine attenuates fibrosis in primary cardiac fibroblasts

摘要

目的 通过建立体外心肌成纤维细胞的纤维化模型，探究石蒜碱对大鼠心肌成纤维细胞纤维化影响。 方法 通过体外提取及培养大鼠原代心肌成纤维细胞，使用血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）在0、6、12、24、36 h在不同时间段诱导大鼠原代心肌成纤维细胞，探究最佳刺激时间，建立细胞纤维化模型；石蒜碱与大鼠原代心肌成纤维细胞共同培养，Werstern Blot检测COL1A1、α‑SMA纤维化相关标志物及Wnt3A、β‑catenin水平。 结果 AngⅡ对大鼠原代心肌成纤维细胞水平影响随作用时间的增加而增大，在24 h后达到峰值；石蒜碱可改善AngⅡ诱导大鼠原代心肌成纤维细胞纤维化水平，COL1A1、α‑SMA纤维化相关标志物及Wnt3A、β‑catenin表达显著降低。 结论 石蒜碱可通过Wnt1/β‑catenin信号通路改善AngⅡ诱导大鼠原代心肌成纤维细胞纤维化。

Abstract

Objective To investigate the effects of lycorine on cardiac fibroblast fibrosis by establishing an in vitro myocardial fibrosis model. Methods Primary rat cardiac fibroblasts were isolated and cultured in vitro. Angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) was applied for different times (0, 6, 12, 24, and 36 hours) to determine the optimal stimulation duration for fibrosis induction. Subsequently, lycorine was co‑cultured with the fibroblasts. Western Blot was performed to assess the expression levels of fibrosis‑related markers (COL1A1 and α‑SMA) and key components of the Wnt/β‑catenin pathway (Wnt3A and β‑catenin). Results The profibrotic effects of Ang Ⅱ increased in a time‑dependent manner, peaking at 24 hours. Lycorine significantly attenuated Ang Ⅱ‑induced fibrosis, as evidenced by significantly reduced expression of COL1A1, α‑SMA, Wnt3A, and β‑catenin. Conclusion Lycorine ameliorates Ang Ⅱ‑induced fibrosis in rat primary cardiac fibroblasts via the Wnt/β‑catenin signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

石蒜碱 / 原代心肌成纤维细胞 / 心肌纤维化 / Wnt/β‑catenin信号通路 / 治疗

Key words

Lycorine / Primary Cardiac Fibroblasts / Myocardial Fibrosis / Wnt/β‑Catenin Signaling Pathway / Therapy

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是心肌成纤维细胞过度增殖，并向肌成纤维细胞转化，使包括胶原在内的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在心肌间质大量沉积，致使心肌僵硬度增加、顺应性下降、心肌收缩力降低的一种病理重构^［1-2］。研究^［3-4］表明，心肌纤维化可导致房颤、心律失常、心衰等多种心血管疾病发生，是心脏疾病发生、心脏功能恶化的重要病理基础。当前针对心肌纤维化治疗主要聚焦于肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）抑制剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-dependent glucose transporters 2，SGLT2）抑制剂等药物控制病因方面，多为广谱抗纤维化，缺乏特异性靶点和个体化靶向治疗^［5］。探寻有效控制心肌纤维化的治疗手段，突破靶点特异性不足及逆转成熟纤维化等瓶颈，对心脏疾病的防治及患者生活质量提高具有重要意义，是目前研究热点^［6］。石蒜碱（lycorine，LYC）是一种从天然药物石蒜属植物鳞茎中分离得到的一种异喹啉生物碱^［7］。2020年，SCHIMMEL等^［8］的文章中，石蒜碱首次被提出可能对心肌纤维化起作用，但是该文章并未对其抗纤维化及作用及机制作具体研究。既往研究^［9］表明，Wnt/β‑catenin信号通路是心肌纤维化病理进程中的关键调控轴，参与心肌纤维化的进展。本研究通过建立血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）诱导大鼠原代心肌成纤维细胞纤维化模型，初步探究石蒜碱对大鼠原代心肌成纤维细胞纤维化的影响以及对Wnt/β‑Catenin信号通路的调控机制。

1 材料与方法

1.1　实验药物及试剂

石蒜碱（S‑103，成都瑞芬思德丹生物科技有限公司）、Wnt3A重组蛋白（HY‑P70453A，美国MedChemexpress生物科技公司）、Ang Ⅱ（A9525，美国Sigma‑Aldrich公司）均按标准保存；一抗胶原蛋白Ⅰ（COL1A1，72076）、Wnt3A（C64F2）、β‑catenin（9562）均购自美国Cell Signaling Technology公司；α‑平滑肌肌动蛋白（α‑SMA，A17910）、GAPDH（A19056）、二抗HRP标记山羊抗兔IgG（AS014）均购自武汉ABclonal公司；RIPA强裂解液（P0013B）、一抗稀释液（P0023A）、ECL化学发光试剂盒（P0018AM）均购自上海碧云天生物技术公司。

1.2　实验仪器及耗材

超净工作台（苏州净化设备有限公司）；BX51正置光学显微镜（日本Olympus公司）；蛋白分析系统（含垂直电泳仪、电转槽及化学发光成像仪，美国BIO‑RAD公司）；恒温CO₂细胞培养箱（德国Binder公司）；细胞培养皿/板（美国康宁公司）。

1.3　实验原代心肌成纤维细胞提取

取1~3日龄SPF级SD乳鼠（湖北省实验动物研究中心），75%乙醇浸泡消毒1 min后处死。取心脏组织，预冷磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗3次清除残留血细胞及结缔组织。转移至无菌培养皿，剪切成1 mm³组织块，PBS轻柔吹打后静置1 min，洗涤2~3次去除红细胞。加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃恒温水浴锅中消化15 min，10% FBS‑DMEM培养基终止消化。细胞悬液经1 000 g离心5 min，完全培养基重悬后依次过150 μm、75 μm细胞筛，离心后接种于多聚赖氨酸包被培养瓶，37 ℃、5% CO₂培养箱预培养1~2 h。通过差速贴壁法弃悬浮心肌细胞，保留贴壁成纤维细胞并换液继续培养。

1.4　纤维化细胞模型建立及分组

提取原代心肌成纤维细胞后，取第2~3代原代心肌成纤维细胞，饥饿12 h后，加入10 μmol·L^-1 AngⅡ诱导，分别于0、6、12、24、36 h后收集细胞样本，通过Western Blot检测纤维化相关蛋白表达水平确定最佳刺激时间；在成功摸索最佳时间及建立纤维化模型基础上，设置0、0.25、0.5、1、5 μmol·L^-1不同浓度梯度LYC刺激细胞24 h后进行蛋白和RNA提取，检测纤维化水平变化，确定最佳作用浓度；血管紧张素Ⅱ和LYC采用最适作用浓度，使用Wnt3A重组蛋白共刺激原代心肌成纤维细胞，检测纤维化通路蛋白水平变化。

1.5　蛋白免疫印迹Western Blot检测

实验细胞中加入预冷RIPA强裂解液，冰上裂解收集上清。经BCA法定量，以5×SDS上样缓冲液等体积稀释，95 ℃金属浴变性，进行电泳、转膜、5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入实验一抗，4 ℃孵育过夜；TBST漂洗后，加入HRP标记二抗室温孵育1 h后，ECL显影，ImageJ 1.53软件分析条带灰度值（目标蛋白/GADPH灰度比值标准化），计算蛋白相对表达量。

1.6　实时荧光定量PCR检测

使用TRIzol试剂提取心脏成纤维细胞RNA，超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。取1 μg总RNA反转录合成cDNA。使用合成cDNA加入引物进行qRT‑PCR扩增反应。目的基因mRNA相对表达量以2^-ΔΔCt 法计算，经内参基因GAPDH标准化。

1.7　统计学方法

使用GraphPad Prism 9.0分析实验数据。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，经Shapiro‑Wilk检验确认数据符合正态分布后，采用单因素方差分析（One‑way ANOVA）及Tukey's多重比较检验评估组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　AngⅡ诱导大鼠原代成纤维细胞纤维化

结果显示，Ang Ⅱ干预后，COL1A1及α‑SMA蛋白表达量升高，24 h较0 h组显著升高（P<0.01），提示AngⅡ诱导大鼠原代成纤维细胞纤维化且24 h刺激效果最佳（图1）。

2.2　LYC缓解纤维化相关COL1A1及α‑SMA蛋白下调

使用最佳刺激浓度Ang Ⅱ（10 μmol·L^-1）构建成纤维细胞的纤维化模型，AngⅡ和LYC共同培养细胞24 h后，免疫印迹分析结果显示，加入1 μmol·L^-1 LYC培养细胞24 h后，蛋白COL1A1及α‑SMA的表达改善最明显（P<0.01）（图2A、2B）。

2.3　LYC可缓解纤维化相关COL1A1及α‑SMA mRNA下调

使用最佳刺激浓度Ang Ⅱ（10 μmol·L^-1）构建成纤维细胞的纤维化模型后加入LYC（1 μmol·L^-1）共同培养细胞24 h后，提取RNA做免疫印迹分析。结果显示，LYC能够有效抑制细胞纤维化指标（COL1A1及α‑SMA mRNA）上调（P<0.01）（图3）。

2.4　LYC可抑制Wnt/β‑catenin信号通路

结果显示，Ang Ⅱ刺激显著激活心肌成纤维细胞Wnt/β‑catenin信号轴：Wnt3A、β‑catenin表达较对照组显著升高（P<0.05）。加入LYC干预可显著逆转上述效应，Wnt3A、β‑catenin蛋白与Ang Ⅱ刺激组相比显著下调（P<0.01）。以上研究表明，LYC可抑制Wnt/β‑catenin通路激活，见图4。

2.5　Wnt3A重组蛋白激活Wnt/β‑catenin信号通路减弱石蒜碱的治疗作用

结果显示，Wnt3A重组蛋白（100 ng·mL^-1）刺激可激活Wnt下游β‑catenin表达上调，较对照组显著升高（P<0.01），且蛋白COL1A1及α‑SMA的表达上调。以上研究表明，Wnt3A重组蛋白激活Wnt/β‑catenin信号通路减弱石蒜碱的治疗作用，见图5。

3 讨论

心肌纤维化作为病理性心脏重构的核心驱动因素，与心力衰竭及恶性心律失常的发生发展密切相关^［10］。临床队列研究^［11］证实，心肌纤维化程度与患者不良预后显著正相关。近年来，基于促纤维化分子机制研究的突破，新型靶向治疗策略快速发展，涵盖小分子抑制剂、RNA干扰技术及细胞疗法^［12］。上述疗法目前仍处于临床前研究或早期临床试验阶段，在长期安全性及逆转成熟纤维化的有效性方面存在一定局限性^［13］。因此，探究具有多靶点调控特性的中药及其活性成分成为抗纤维化药物研发的新焦点。

石蒜碱（C₁₆H₁₇NO₄）是一种异喹啉类生物碱，主要存在于石蒜科植物（如石蒜、水仙）的鳞茎中，具有广泛的药理活性，尤其在抗肿瘤、抗病毒、抗炎和神经系统调节方面备受关注^［14］。本研究通过构建AngⅡ诱导的大鼠原代心肌成纤维细胞纤维化模型，研究结果显示LYC可明显下调纤维化指标COL1A1及α‑SMA蛋白表达，证明LYC可发挥抗纤维化作用。

Wnt/β‑catenin通路是调控心肌纤维化的核心信号轴之一，在此过程中扮演关键角色^［15］。已有研究^［16］证实，AngⅡ可通过激活Wnt配体促进β‑catenin核转位，驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。本研究表明，AngⅡ刺激可显著激活心肌成纤维细胞中Wnt/β‑catenin信号轴，促进纤维化标志物COL1A1和α‑SMA的表达，而LYC可抑制上述效应，降低Wnt1A、β‑catenin相关蛋白表达。使用Wnt3A重组蛋白可逆转LYC对β‑catenin、COL1A1及α‑SMA蛋白下调作用，激活Wnt/β‑catenin信号通路，消除LYC的治疗作用。

综上所述，LYC可改善AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞纤维化，可能与靶向抑制Wnt/β‑catenin信号通路密切相关。这一发现可能为心肌纤维化的分子机制研究提供了新证据及开发高选择性抗纤维化药物提供了新策略。但LYC其临床转化及应用面临多重挑战（如毒性风险、药代动力学缺陷、多靶点效应复杂性），未来将重点进行结构修饰、精准递送系统相关研究，通过跨学科策略优化以平衡疗效与安全性。

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基金资助

湖北省自然科学基金资助项目(WJ2023M061)