基于ATF4/ACSL4信号通路探讨高盐诱导高血压血管内皮细胞铁死亡的机制

Mechanism of high salt induced ferroptosis in hypertensive vascular endothelial cells based on ATF4/ACSL4 signal pathway

摘要

目的 基于激活转录因子4（ATF4）/酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）信号通路探讨高盐（HS）诱导高血压血管内皮细胞铁死亡的机制。 方法 雄性C57/BL6小鼠随机分为4组：对照组、HS组、HS+铁抑制素‑1（Fer‑1）组和HS+甲磺酸去铁胺（DFO）组，每组12只。除对照组外，其余组喂养8%氯化钠12周。HS+Fer‑1组和HS+DFO组从第5周开始分别每日腹腔注射2 mg·kg^-1 Fer‑1或100 mg·kg^-1 DFO，连续治疗8周。评估小鼠心血管功能参数。分离小鼠心脏微血管内皮细胞（CMVECs）和心肌细胞（CMs），进行RNA序列分析。制备ATF4 siRNA（si‑ATF4）及其对照siRNA（si‑NC）转染CMVECs的条件培养基，用于CMs的培养。分别对处理过的CMs进行DHE染色、罗丹明标记鬼笔环肽染色和CCK‑8试验，以考察氧化应激、细胞肥大和增殖情况。 结果 与对照组相比，HS组血清生物标志物CK‑MB、ANP、BNP水平、心脏质量/体质量、左心室后壁厚度和左心室内径显著增加（P<0.05），射血分数和缩短分数显著降低（P<0.05）。HS+Fer‑1组和HS+DFO组显著逆转了HS诱导的心脏功能障碍参数和心肌肥厚（P<0.05）。RNA测序结果显示，内质网应激和ATF4表达在HS诱导的CMVECs中被显著激活。与对照组相比，HS组心脏组织中GPX4和xCT蛋白表达显著上调（P<0.05），ACSL4蛋白表达显著下调（P<0.05）。HS+Fer‑1组和HS+DFO组显著逆转了HS诱导的这些蛋白变化（P<0.05）。来自si‑ATF4转染的CMVECs的条件培养基显著促进了CMs的增殖、增加了CMs的大小和ROS生成（P<0.05）。 结论 铁死亡参与HS诱导的心脏毒性。CMVECs中ATF4具有心脏保护作用，其通过调节GPX4/ACSL4信号通路减轻脂质过氧化和铁死亡。

Abstract

Objective To explore the mechanism of high salt (HS) induced ferroptosis in hypertensive vascular endothelial cells based on the activation of transcription factor 4 (ATF4)/acyl coenzyme A synthetase 4 (ACSL4) signal pathway. Methods Male C57/BL6 mice were randomly divided into four groups: control group, HS group, HS+Fer‑1 group and HS+DFO group, with 12 mice in each group. Except the control group, the other groups were fed with 8% sodium chloride for 12 weeks. HS+Fer‑1 group and HS+DFO group received intraperitoneal injection of 2 mg·kg^-1 of ferrostatin‑1 (Fer‑1) or 100 mg·kg^-1 of deferoxamine mesylate (DFO) for 8 consecutive weeks from the 5th week. The cardiovascular function parameters of mice were evaluated. The mouse cardiac microvascular endothelial cells (CMVECs) and myocardial cells (CMs) were isolated and RNA sequencing was performed. The conditional medium for transfection of CMVECs with ATF4 siRNA (si‑ATF4) and its control siRNA (si‑NC) was prepared for the culture of CMs. DHE staining, rhodamine labeled ghost pen cyclic peptide staining and CCK‑8 test were performed on the treated CMs to investigate oxidative stress, cell size and proliferation. Results Compared with the control group, the levels of serum biomarkers CK‑MB, ANP, BNP, heart weight/body weight, left ventricular posterior wall thickness and left ventricular inner diameter in the HS group increased significantly (P<0.05), and ejection fraction and shortening fraction decreased significantly (P<0.05). HS+Fer‑1 group and HS+DFO group significantly reversed the parameters of HS induced cardiac dysfunction and myocardial hypertrophy (P<0.05). RNA sequencing results showed that ER stress and ATF4 expression were significantly activated in HS induced CMVECs. Compared with the control group, the expression of GPX4 and xCT protein in the heart tissue of HS group was significantly increased (P<0.05), and the expression of ACSL4 protein was significantly decreased (P<0.05). HS+Fer‑1 group and HS+DFO group significantly reversed these protein changes induced by HS (P<0.05). The conditioned medium of CMVECs transfected with si‑ATF4 significantly promoted the proliferation of CMs, increased the size of CMs and ROS production (P<0.05). Conclusion Ferroptosis is involved in HS induced cardiotoxicity. ATF4 in CMVECs has a cardioprotective effect, which can reduce lipid peroxidation and ferroptosis by regulating GPX4/ACSL4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

激活转录因子4 / 酰基辅酶A合成酶4 / 高盐诱导高血压 / 血管内皮细胞 / 铁死亡

Key words

Activating Transcription Factor 4 / Acyl CoA Synthetase 4 / High Salt Induced Hypertension / Vascular Endothelial Cells / Ferroptosis

高血压是许多心血管疾病的主要危险因素。慢性压力过载导致心肌肥厚和细胞外基质产生过多，最终表现为心脏顺应性降低和心力衰竭^［1］。导致病理性心脏重构易感性的潜在基因和途径在很大程度上仍不清楚，因此，进一步研究高血压性心脏疾病发病机制中涉及的新分子靶点非常必要。心脏微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMVECs）的炎症和功能障碍被认为是导致心脏重构的重要机制^［2］。此外，CMVECs分泌的因子可调节心脏功能，并对心脏重塑产生积极或消极的影响^［3］。铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化驱动的细胞死亡级联反应，已成为心血管疾病发展的关键机制^［4］。抑制铁死亡可通过减轻小鼠主动脉内皮细胞的脂质过氧化和内皮功能障碍来缓解动脉粥样硬化^［5］。这些结果提示，铁死亡可能是导致CMVECs炎症和功能障碍的关键机制。因此，负调控CMVECs铁死亡有利于高血压心脏重构的治疗。激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）是CREB/ATF家族的一员，在人体器官中广泛表达，可被激活以响应各种应激信号，如缺氧、内质网应激和氧化应激，从而调节细胞的适应功能^［6］。最近研究^［7‑8］发现，ATF4基因敲低使细胞对Erasin和RSL3诱导的铁死亡敏感。此外，还有研究^［9］报道ATF4可以防止血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠主动脉外膜成纤维细胞的凋亡和炎症，然而，ATF4在CMVECs铁死亡中的调节作用尚未明确。在本研究中，我们拟探讨ATF4在高盐（high salt，HS）诱导高血压条件下CMVECs铁死亡和心脏损伤中的作用和潜在机制。

1 材料与方法

1.1　实验动物及分组

雄性C57/BL6小鼠（8周，20~22 g）购自北京维通达生物技术有限公司。所有小鼠均在标准化条件下饲养（12 h光/暗循环，温度22~24 ℃，湿度35%~60%），可自由饮用食物和水。喂养1周后，将小鼠随机分为4组：对照组、HS组、HS+Fer‑1组和HS+DFO组，每组12只。对照组接受标准啮齿动物食物正常喂养12周，其余组喂养标准啮齿动物食物和8%氯化钠12周。从第5周开始，HS+Fer‑1组和HS+DFO组小鼠分别每日腹腔注射2 mg·kg^-1铁抑制素‑1（Fer‑1，购自美国Selleck公司，溶解在二甲基亚砜中，用0.9%氯化钠稀释至所需浓度）或100 mg·kg^-1甲磺酸去铁胺［DFO，购自陶术（上海）生化科技有限公司，用0.9%氯化钠稀释至所需浓度］，连续治疗8周。对照组和HS组则在相同时间注射等体积0.9%氯化钠。研究期间采用尾袖法无创测量小鼠收缩压（SBP）水平。

1.2　超声心动图

如前所述，给药前后，使用Vevo 2100系统（加拿大VisualSonics公司）对轻度麻醉的小鼠进行超声心动图检查^［10］。M型图像测量的相关参数包括收缩期左室后壁厚度（LVPWs）、收缩期左室前壁厚度（LVAWs）、左室舒张内径（LVIDd）、舒张期左室后壁厚度（LVPWd）、舒张期左室前壁厚度（LVAWd）、射血分数（EF）、缩短分数（FS）、每搏输出量（SV）、心输出量（CO）和左室质量。

1.3　血清心血管生物标志物的测定

给药后，从麻醉状态下的小鼠眼眶后静脉丛采集血样，通过离心分离（1 000  g、 15 min，4 ℃）。所有血清都存储在-80 ℃，直到分析。根据制造商的说明，分别使用心房钠尿肽（ANP）、脑钠肽（BNP） ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）和心肌肌酸激酶MB形式（CK‑MB） ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）测量CK‑MB、ANP和BNP水平。

1.4　心脏质量/体质量比值（HW/BW）和组织学测量

在超声心动图检查和采血后，在深度麻醉下处死颈椎脱位的小鼠。切除心脏，用10%氯化钾溶液阻止舒张末期，修剪多余的组织，轻轻擦拭心脏并称重，然后计算HW/BW。接下来，将心脏固定在4%多聚甲醛中，然后根据标准组织学方案进行脱水和石蜡包埋。切割5 μm切片并用HE染色。每个心脏约测量100~200个心肌细胞，使用Image J计算平均心肌细胞面积。

1.5　CMVECs和心肌细胞（cardiomyocytes，CMs）的分离和培养

从小鼠的心脏中分离和培养CMVECs^［11］。在37 ℃下，将小鼠心脏切除、切碎，并在0.1%胶原酶Ⅱ（美国Gibco公司）和0.125%胰蛋白酶（美国Gibco公司）的混合溶液中消化5 min，共6次。将消化后的产物收集在离心管中，用含有10%胎牛血清（FBS；美国HyClone公司）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；美国HyClone公司）停止消化，然后通过70 μm尼龙细胞过滤器过滤。收集细胞并将其置于含有10%FBS的内皮细胞培养基（美国Sciencell公司）培养瓶上，于37 ℃含5%CO₂的增湿培养箱中培养。从小鼠心脏中分离出CMs^［11］。第3~5代的CMVECs和CMs细胞均被剥夺血清24 h。然后，在AngⅡ（1 μmol·L^-1；美国Sigma‑Aldrich公司）暴露前24 h，对CMVECs分别进行ATF4过表达质粒（美国MedChemExpress公司）转染24 h、5 μmol·L^-1 Fer‑1处理1 h和50 ng·mL^-1重组人ACSL4（rhACSL4；美国MedChemExpress公司）处理1 h。

1.6　RNA测序和数据分析

分别从对照组和HS组小鼠心脏中分离CMVECs，采用TRIzol试剂［天根生化科技（北京）有限公司］提取总RNA。由上海吉凯基因医学科技股份有限公司进行RNA测序（RNA‑seq）。在生物分析仪2100（美国Agilent Technologies公司）评估RNA的质量和数量。使用NEBNext^®Ultra生成序列库，为Illumina^®（美国NEB公司）提供RNA库准备工具包。修复DNA末端，并添加“A”碱基。通过AMPure XP系统（美国Beckman Coulter公司）选择250~300 bp cDNA并纯化PCR产物。在Illumina Novaseq平台上对文库制剂进行测序。参考基因组和基因信息从NCBI数据库下载。Hisat2 v2.0.5用于将读数与参考基因组对齐。FeatureCounts v1.5.0‑p3用于计算映射到每个基因的读取数。然后根据基因长度计算每千碱基外显子每百万碱基序列的片段数（FPKM），并读取映射到该基因的计数，fold change（FC）表示为FPKM组间的倍变比率。使用带有原始计数的DESeq2 R包（1.16.1）进行差异表达分析。基因的P值通过Benjamini和Hochberg的方法进行调整，选择调整P值（P adj.）<0.05和绝对log₂FC>0作为差异表达基因（DEG），用于创建热图和火山图以及KEGG本体富集分析。对于KEGG富集分析，以P adj.<0.05为阈值来确定基因集的显著富集。

1.7　逆转录定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）

使用TRNzol试剂提取细胞RNA。使用NanoDrop2000测试总RNA的纯度和浓度。然后使用GoScript Reverse逆转录试剂盒［普洛麦格（北京）生物技术有限公司］将总RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green荧光试剂［普洛麦格（北京）生物技术有限公司］在Roche 480系统中进行实时PCR。GAPDH作为内参进行基因mRNA表达水平的相对定量分析。目标基因的引物对如下：ATF4，正向5′‑ATGAGCTCCTGAACAGCGAA‑3′和反向5′‑CTTGTCGTGGAACCCAT‑3′；GAPDH，正向5′‑GAGCATTCCAGGGCTAA‑3′，反向5′‑ACAGTGACGTTACAAACGAC‑3′；Grp78，正向5′‑CACCTTATTCCTGCGGT‑3′和反向5′‑GTGAAGGCCACATACGACGG‑3′；ANP，正向5′‑CTTCTCCATCACCCTG‑3′和反向5′‑CCTGTCAATCCTACCC‑3′；BNP，正向5′‑ACAAAAGAACACCCAA‑3′和反向5′‑TACAGCCCAAACGACT‑3′。

1.8　ATF4 siRNA转染CMVECs条件培养基的制备

分离的小鼠CMVECs在Opti MEM培养基（美国Gibco公司）中培养，并使用Lipofectamine 3000转染试剂（美国Invitrogen公司）转染。为了抑制ATF4的表达，将针对ATF4的特异性小干扰RNA（si‑ATF4，正义：CUUCGAUAAGAAGUAAUAGA；反义：UAUUAUAUCUCUUAUCGAAGAA）和阴性对照siRNAs（si‑NC）转染到CMVECs中48 h，浓度为50 nmol·L^-1。si‑ATF4和si‑NC均购自上海吉玛制药技术有限公司。进行PCR以确认siRNA敲除的效率。将si‑ATF4和si‑NC转染的CMVECs用AngⅡ处理24 h后，从中收集条件培养基，用于CMs的培养。分别对处理过的CMs进行二氢乙锭（DHE）、罗丹明标记鬼笔环肽染色和CCK‑8试验。

1.9　CCK‑8分析和铁分析

使用CCK‑8试剂盒（上海Beyotime公司）测量CMVECs和CMs的细胞活力。在含有10%FBS的96孔培养板中，每孔加入1 000个细胞（体积为100 μL）。处理后，将CCK‑8试剂（10 μL）添加到每个孔中，并在暗处培养2 h，然后使用多功能微孔板阅读器测量450 nm处的吸光度。使用铁分析试剂盒（英国Abcam公司）测量小鼠CMVECs的铁水平。收集样品并用冷PBS洗涤，然后在铁分析缓冲液中均质并离心。添加铁探针，并在黑暗中培养1 h。在多功能微孔板阅读器测量593 nm处的吸光度。

1.10　罗丹明标记鬼笔环肽染色

为了评估肥大变化，CMs用4%多聚甲醛固定，用0.1%Triton X‑100渗透，并用浓度为50 mg·mL^-1的罗丹明标记鬼笔环肽（美国Phallolidin Rho公司）染色30 min。细胞核在室温下用DAPI染色。使用IX51显微镜（日本Olympus公司）采集荧光图像。

1.11　Western Blot

检测铁死亡标记蛋白谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、xCT、酰基辅酶A合成酶4（long chain fatty acid CoA ligase 4，ACSL4）的表达。将心脏组织和细胞在RIPA裂解缓冲液（上海Beyotime公司）裂解30 min，然后将蛋白质与负载缓冲液混合并煮沸10 min。用SDS‑PAGE凝胶分离等量提取物（50 μg）并转移到硝化纤维素膜（美国Bio‑Rad公司）。用5%的脱脂奶粉封闭细胞膜2 h，然后在4 ℃下与抗GPX4（1∶1 000）、xCT （1∶1 000）、ACSL4（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000，均购自美国Proteintech公司）孵育过夜。第2日，用适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体（1∶10 000，美国Proteintech公司）在室温下孵育1 h。通过ChemiDoc XRS（美国Bio‑Rad公司）对斑点进行可视化和定量。用Image J软件分析斑点强度。

1.12　DHE染色

DHE荧光染色（上海Beyotime公司）用于检测细胞中活性氧（ROS）的水平。细胞在37 ℃的DHE（10 μmol·L^-1）中培养30 min，然后使用IX51显微镜（日本Olympus公司）采集荧光图像，并使用Image J软件计算探针的荧光强度。

1.13　数据处理

通过SPSS 25.0进行统计分析。数据表示为均数±标准差（x-±s）。使用单向方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行多组比较。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1　铁死亡参与HS诱导的心肌病

HS饮食后尾动脉压力的纵向变化如图1A所示。在所有组中观察到的基础收缩压水平具有可比性。与对照组相比，HS组每日给予HS饮食12周后，SBP明显增加（P<0.01）。与HS组相比，HS+Fer‑1组和HS+DFO组的收缩压分别从148.24 mmHg、146.77 mmHg降至130.96 mmHg、125.57 mmHg。与对照组相比，HS组血清CK‑MB、ANP、BNP水平、HW/BW、左心室后壁厚度和左心室内径均显著增加（P<0.05），心脏功能指标EF和FS显著降低（P<0.05）。HS+Fer‑1组和HS+DFO组显著逆转了HS诱导的心脏功能障碍参数（表1）。HE染色心脏切片的组织学分析证实了上述发现，HS组诱导心脏组织肥厚性改变，而Fer‑1、DFO显著降低了HS诱导的心肌肥厚（图1B）。综上所述，Fer‑1、DFO治疗对HS诱导的小鼠心脏功能障碍和肥大具有显著的保护作用，表明铁死亡参与了HS诱导的心肌病。

2.2　内质网应激和ATF4表达在HS诱导的CMVECs中显著激活

为了进一步明确潜在的分子机制，我们分别从对照组和HS组心脏中分离CMVECs，然后进行了RNA测序分析，火山图结果显示HS处理的CMVECs中有410个基因上调和137个基因下调（图2A~2B）。KEGG富集分析表明，内质网中的蛋白质加工（rno04141）是DEG最显著富集的途径（图2C）。在图2D中，我们列出了显著上调和下调基因（log₂FC>0.585），并发现ATF4是最显著的上调基因之一。为了验证RNA测序数据，研究对CMVECs进行qRT‑PCR分析，并确认HS处理显著上调了Grp78（内质网应激的常用标记）mRNA水平和ATF4 mRNA水平（P<0.01）（图2E）。

2.3　ATF4过表达通过调节GPX4/ACSL4信号传导阻断AngⅡ介导的CMVECs的铁死亡、氧化应激和增殖

ATF4过表达和Fer‑1显著逆转了AngⅡ诱导的培养CMVECs中细胞增殖水平（图3A）、MDA水平（图3B）和铁水平（图3C）的升高，而ATF4的保护作用部分被rhACSL4逆转。DHE测量结果显示，在AngⅡ的作用下，CMVECs中的ROS显著增加，这分别被ATF4和Fer‑1逆转（图3D）。此外，ATF4对ROS作用部分被rhACSL4的共治阻断。在AngⅡ刺激的CMVECs中，ATF4介导的GPX4和xCT蛋白表达显著下调（P<0.05），ACSL4蛋白表达显著上调（P<0.05），这分别被ATF4和Fer‑1逆转。与AngⅡ+ATF4组相比，AngⅡ+ATF4+rhACSL4组中GPX4和xCT蛋白表达显著上调（P<0.05），ACSL4蛋白表达显著下调（P<0.05）（图3E）。此外，体内结果显示，与对照组相比，HS组心脏组织中GPX4和xCT蛋白表达显著上调（P<0.05），ACSL4蛋白表达显著下调（P<0.05）。HS+Fer‑1组和HS+DFO组显著逆转了HS诱导的这些蛋白变化（图3F）。总之，这些数据表明，ATF4通过下调xCT、GPX4和ACSL4的表达水平，在减轻脂质过氧化和铁死亡方面起着重要作用。

2.4　ATF4基因敲除加重AngⅡ诱导的CMs增殖和氧化损伤

为了研究CMVECs中ATF4下调对CMs在AngⅡ刺激下的影响，我们使用从ATF4体外沉默CMVECs获得的条件培养基处理CMs。通过逆转录PCR证实siRNA成功介导CMVECs中的ATF4敲低（图4A）。CCK‑8分析显示，来自si‑ATF4转染的CMVECs的条件培养基显著促进了CMs的增殖（图4B）。此外，来自si‑ATF4转染的CMVECs的条件培养基显著促进肥大基因ANP、BNP的表达，增加了CMs大小和ROS生成（P<0.05）（图4C~4E）。这些结果表明，内皮细胞ATF4可能通过与CMs的相互作用抑制病理性心肌肥厚和ROS水平。

3 讨论

高盐饮食是导致心血管疾病的主要原因之一。约50%的高血压患者因盐敏感性而血压升高^［12］。在本研究中，小鼠长期服用8%的高盐饮食后，血压继续升高，这与之前的研究^［12］一致。众所周知，铁死亡是一种以铁超载为特征的受调节的细胞死亡形式，其特征在于脂质过氧化物的致死水平积累^［13］。高铁饮食导致严重的心脏损伤和肥厚性心肌病，Fer‑1可逆转这些疾病进展^［13］。此外，铁超载增加了AngⅡ诱导的心脏纤维化并促进新生内膜的形成^［14］。本研究表明，在高血压小鼠中，Fer‑1和DFO可以抑制心脏损伤，提示铁螯合治疗在预防或减少高血压相关的心脏毒性方面可能发挥作用。

心脏是一个高度结构化的器官，主要由心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞组成^［15］。越来越多的证据^［15］表明，自分泌和旁分泌机制在成人正常和衰竭心脏中起着重要的调节作用。CMVECs是成人心肌中最丰富的细胞类型^［2］。内质网（ER）含有细胞内最大的脂质库，YUAN等^［16］报道了脂质过氧化氢的积累主要发生在CMVECs的ER室。之前的一项研究^［17］发现，降铁抑制因子铁抑制素在ER中积累。我们的RNA测序数据显示，HS饮食激活CMVECs中内质网应激和未折叠蛋白反应。所观察到的铁中毒性心肌细胞的细胞质空泡化可能归因于内质网的广泛扩张，内质网体积的增加可被视为一种适应性细胞反应，旨在通过降低错误折叠蛋白的浓度并促进其利用，使细胞在压力下存活。与DODSON等^［18］的假设一致，我们推测内质网可能是脂质ROS的主要靶点，也是HS诱导的铁死亡的关键亚细胞位置，内质网也可能是治疗HS诱导铁死亡的一个有希望的靶点。

ATF4是未折叠蛋白反应的主要转录调控因子，负责应激补救和细胞存活^［19］。ATF4已被报道^［20］在调节肿瘤细胞敏感性方面发挥双重作用，而ATF4在CMVECs中的功能尚未阐明。在目前的研究中，我们发现ATF4表达是CMVECs中最显著上调的基因之一，ATF4保护CMVECs免受AngⅡ诱导的铁死亡，CMVECs中ATF4的下调促进了AngⅡ诱导的CMs的增殖和氧化应激的过度产生。ATF4表达下调与CMVECs的铁死亡相关，我们证实CMVECs中ATF4的下调加剧了AngⅡ诱导的CMs肥大和氧化应激。ATF4敲除对对照组无影响，这是一种非应激状态，因此证实了ATF4的经典作用，它是综合应激反应的调节剂^［20］。然而，本研究没有体内数据探讨CMVECs中ATF4下调对CMs的调节作用。未来需要更多的研究来探讨CMVECs中ATF4的特异性功能丧失是否会导致病理性心肌肥厚和纤维化。

我们进一步探讨了ATF4抑制铁死亡的机制。GPX4作为铁死亡的关键蛋白，其表达的缺陷被认为是铁沉积症的生物标志物^［21］。GPX4利用谷胱甘肽通过减少磷脂过氧化氢来抑制脂氧合酶介导的脂质过氧化。xCT是一种胱氨酸葡萄糖酯反转运蛋白，负责调节谷胱甘肽的产生^［22］。ACSL4通过优先催化多不饱和脂肪酸代谢和形成细胞脂质组成，参与调节降铁敏感性^［23］。据报道^［24］，ACSL4的激活有助于肠和脑I/R中的铁死亡介导的组织损伤。本研究结果表明，ATF4通过逆转AngⅡ介导的xCT、GPX4的下调和ACSL4上调而发挥其抗铁死亡作用。此外，ATF4对AngⅡ刺激的CMVECs表现出抗铁中毒和抗氧化作用，可被rhACSL4部分阻断。这些数据表明，CMVECs中ATF4通过调节GPX4/ACSL4信号通路减轻脂质过氧化和铁死亡。

综上所述，本研究揭示了铁死亡在HS诱导的心脏毒性中的关键作用，并确立了ATF4的心脏保护作用，其作用机制与调节GPX4/ACSL4信号通路介导的脂质过氧化和铁死亡有关。这些发现可以更好地理解HS诱导高血压心脏损伤的病理生理学基础，并为其预防或缓解提供新的线索。

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基金资助

湖北省卫生健康委员会科研项目(20221731)