辣椒活性成分二氢辣椒素通过LKB1/AMPK通路增强自噬改善高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤

Bioactive component of Capsicum annuumL., dihydrocapsaicin, enhances autophagy through the LKB1/AMPK pathway to improve high-glucose-induced damage to H9C2 cardiomyocytes

摘要

目的 探讨辣椒治疗糖尿病心肌病（DCM）的核心成分、关键靶点和潜在机制，选取辣椒活性成分进行细胞实验验证。 方法 采用中医系统药理学（TCMSP）来获取辣椒的活性成分和靶点。同时，使用GeneCards数据库检索DCM的相关靶点。维恩图用于获取交叉点靶标。使用Cytoscape软件构建“草本‐成分‐靶点”网络并确定核心靶点。使用DAVID数据库和metascape在线网站进行GO和KEGG通路富集分析，并进一步探讨辣椒改善DCM的机制,并选取辣椒活性成分二氢辣椒素（DHC）进行细胞实验验证。H9C2心肌细胞经5.5 mmol·L^-1D‐葡萄糖（D‐glu）刺激为正常糖对照组，以60 mmol·L^-1D‐glu刺激为高糖组，以10 μmol·L^-1 DHC进行干预。采用mRFP‐GFP‐LC3双荧光系统检测自噬流，RT‐qPCR检测Beclin1、P62、AMPK和LKB1的 mRNA表达水平，Western Blot检测Beclin1、P62、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ、p‐AMPK、AMPK和LKB1的蛋白表达水平。 结果 TP53、AKT1、MAPK1等是关键候选靶点，与多种通路包括雌激素信号通路、LKB1通路等显著相关。这表明辣椒对抗DCM的潜在机制可能主要与细胞凋亡和自噬相关。体外实验结果表明，DHC处理显著降低了高糖导致的H9C2细胞的凋亡率，并且增强了细胞自噬。 结论 辣椒活性成分DHC通过调节细胞凋亡和自噬途径在改善糖尿病心肌病方面作出了重大贡献，这为未来的研究奠定了基础并提供了创新思路。

Abstract

Objective To investigate the core components, key targets, and potential mechanisms of Capsicum annuumL.(Capsicum) in the treatment of diabetic cardiomyopathy (DCM), and to validate the bioactive components through cell experiments. Methods Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP) was used to obtain the active ingredients and targets of Capsicum. Also, GeneCards database was used to retrieve relevant targets of DCM. Venn diagram was used to obtain intersection targets. Cytoscape software was used to construct “herb‐ingredient‐target” networks and identify core targets. The DAVID database and Metascape online platform were applied for Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis to further investigate the mechanisms by which Capsicum ameliorates DCM. The active Capsicum component dihydrocapsaicin (DHC) was selected for cellular experimental validation. H9C2 cells were stimulated with 5.5 mmol·L^-1D‐glucose as a normal‐glucose control group, and 60 mmol·L^-1D‐glucose as a high‐glucose group, and treated with 10 μmol·L^-1 DHC. The mRFP‐GFP‐LC3 dual fluorescence system was used to detect autophagic flux, RT‐qPCR was used to detect the mRNA expression levels of Beclin1, P62, AMPK, and LKB1, and Western blot was used to detect the protein expression levels of Beclin1, P62, LC3 Ⅰ and LC3 Ⅱ, p‐AMPK, AMPK, and LKB1, respectively. Results The results showed that TP53, AKT1, and MAPK1 were the key candidate targets, which were significantly associated with various pathways including estrogen signaling pathway and LKB1 pathway. This suggests that the potential mechanism of Capsicum against DCM may be mainly related to apoptosis and autophagy. The results of in vitro experiments showed that DHC treatment significantly reduced the apoptosis rate of H9C2 cells induced by high glucose and enhanced cellular autophagy. Conclusion The significant contribution of DHC in ameliorating DCM by modulating apoptosis and autophagy pathways lays the foundation and provides innovative ideas for future research.

Graphical abstract

关键词

辣椒 / 二氢辣椒素 / 糖尿病心肌病 / LKB1/AMPK通路 / 网络药理学 / 药理机制

Key words

Capsicum annuumL. / Dihydrocapsaicin / Diabetic Cardiomyopathy / LKB1/AMPK Pathway / Network Pharmacology / Pharmacological Mechanisms

糖尿病患病人数为4.63亿，约占世界人口的9.3%，目前已成为全球性健康问题^［1］。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy， DCM）是糖尿病的严重并发症之一，糖尿病患者发生不良心血管事件的风险是非糖尿病患者的3~5倍^［2］。尽管DCM引起了极大的关注，且新的治疗方法不断开发，但仍然缺乏有效的治疗策略。因此，探索和靶向与DCM相关的信号通路成为治疗DCM的热点和难点。

辣椒（Capsicum annuumL.），作为一种调味料，近年来在医药领域展现出了巨大的潜力。大量研究^［3‐5］显示，相较于饮食清淡的人群，习惯食用辣椒的人群身体更健康，寿命更长。一项对4 387篇共纳入564 748名成人的Meta分析显示，食用辣椒的人群心血管疾病（CVD）死亡率降低了约12%^［6］。《药检》中记载，辣椒能“祛风行血、散寒解郁、导滞、止泻、擦癣”。辣椒素、二氢辣椒素（dihydrocapsaicin，DHC）是辣椒中含量较高且特有的辣椒碱类物质，也是辣椒发挥生物活性的关键物质，具有抗炎、抗菌、改善血液循环等生物活性。例如，辣椒素可能通过激活TRPV1改善内皮依赖性血管舒张并预防高血压^［7］，并且可以减少血管脂质积累减轻动脉粥样硬化^［8］。既往研究^［9］已经表明DHC可以通过PPARγ/LXRα途径显著减少动脉粥样硬化斑块的形成，但针对DHC改善DCM的研究比较缺乏。同时，尽管DHC和辣椒素均是辣椒中的主要活性化合物，但是DHC比辣椒素有更高的生物利用度，更具有临床应用价值。

本研究采用网络药理学方法研究辣椒、靶点和疾病之间的关系。通过参考相关文献^［10-11］，采用高葡萄糖诱导H9C2心肌细胞建立糖尿病心肌病体外模型，并通过细胞实验对辣椒活性成分DHC改善糖尿病心肌损伤的机制进行验证，以期为辣椒改善DCM的进一步开发和临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1　主要药物、试剂与仪器

主要实验材料（厂商）如下：二氢辣椒碱（源叶）；D‐葡萄糖（Servicebio）；甘露醇（阿拉丁）；低糖DMEM培养基（Servicebio）；CCK‐8（Abbkine）；cDNA反转录试剂盒和Real‐time PCR试剂盒（艾科瑞）；PCR引物（捷瑞引物）；TRIzol（Ambion）；兔抗GAPDH（Proteintech）；兔抗Beclin 1、兔抗P62、兔抗LC3、兔抗AMPK、兔抗P‐AMPK及兔抗LKB1（Proteintech）；CO₂培养箱；荧光定量PCR仪（Thermo Quantstudio 7 Pro）；自动化学发光图像分析系统。

1.2　主要方法

1.2.1　辣椒有效成分、靶点和DCM相关基因的获取

利用中医系统药理学（TCMSP）平台（https：//tcmsp‐e.com/tcmsp.php）筛选辣椒有效活性成分及靶基因，在检索框中输入“辣椒”作为关键词，选择Ingredients，根据药物代谢动力学特征设置筛选条件为：生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18。利用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得辣椒活性成分的Canonical SMILES号并在Swiss Target Prediction输入，限定物种为“Homo sapiens”，进行靶点预测。以Probability>0.1为筛选标准，筛选辣椒有效成分的靶点。用关键词“Diabetic Cardiomyopathy”在Genecards（https：//www.genecards.org/）数据库中搜索疾病相关靶标，按照相关性分数进行筛选，获取DCM相关基因。将辣椒活性化合物的作用靶点与DCM相关作用靶点导入在线网站Venny 2.1.0，绘制Venn图，筛选出辣椒-糖尿病心肌病共同靶点。

1.2.2　关键靶点蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)构建

将辣椒与糖尿病心肌病共同靶基因导入STRING数据库（https：//cn.string‐db.org/），选择物种“Homo sapiens‐SEARCH”，得到辣椒与糖尿病心肌病核心靶点tsv文件。将核心靶点tsv文件导入到Cytoscape 3.6.0软件中，利用GentiScaPe 2.2插件计算Degree，Closeness和Betweenness值，根据Degree，Closeness和Betweenness值排序将PPI网络图进行可视化处理。

1.2.3　基因本体论（GO）和通路富集分析

使用DAVID数据库对与辣椒和糖尿病心肌病相关的靶标进行GO功能富集分析，利用Metascape在线网站进行通路富集分析。选取GO分析结果中富集程度最高的前10条绘制富集气泡图。选取通路分析结果中富集程度最高的前20条通路进行可视化。

1.2.4　高糖诱导H9C2细胞自噬模型的构建

长势良好的H9C2心肌细胞用胰酶消化后，按每孔约10 000个细胞密度接种于96孔板中，细胞贴壁后分别给予5.5、10、20、30、40、50、60、80 mmol·L^-1的D‐葡萄糖（D‐glu），培养48 h后进行CCK‐8检测细胞活力。n=5，重复3次实验。

1.2.5　辣椒主要有效活性成分DHC对H9C2细胞活性的影响

H9C2心肌细胞以含10%胎牛血清（FBS）、5.5 mmol·L^-1D‐glu的DMEM培养基培养，取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔10 000个，培养过夜后分别加入含不同浓度（10、15、20、25 μmol·L^-1）的DHC和60 mmol·L^-1D‐glu及等渗甘露（Man）溶液100 μL，于培养箱中孵育细胞48 h后使用CCK‐8检测细胞活力。n=3，重复3次实验。

1.2.6　DHC对高糖环境下H9C2活性的影响

H9C2心肌细胞以含10% FBS、5.5 mmol·L^-1D‐glu的DMEM培养基培养，取对数生长期的H9C2细胞接种于96孔板中，每孔10 000个，培养过夜后分别加入5.5 mmol·L^-1D‐葡萄糖（正常糖对照组，CN组）、等渗甘露溶液（Man组）、60 mmol·L^-1D‐葡萄糖液（高糖组，HG组）、10 μmol·L^-1二氢辣椒素溶液（DHC组）及60 mmol·L^-1D‐葡萄糖液+10 μmol·L^-1二氢辣椒素溶液（HG+DHC组）100 μL，于培养箱中孵育细胞48 h后使用CCK‐8检测细胞活力。每组设6个复孔，重复3次实验。

1.2.7　稳定表达自噬双标慢病毒（mRFP‐eGFP‐LC3）的H9C2细胞的构建及自噬情况观察

mRFP‐GFP‐LC3双荧光自噬指示剂系统是自噬评估中使用的常用工具。H9C2心肌细胞以每皿1×10⁵个细胞接种于共聚焦小皿，在相关条件下培养48 h，然后根据制造商的说明用mRFP‐EGFP‐LC3慢病毒（海星生物）处理H9C2细胞后，于激光共聚焦荧光显微镜下观察红色和绿色LC3的荧光点变化，随机选取一个视野下所有细胞进行拍照，分析自噬变化。

1.2.8　定量实时聚合酶链反应

使用RNA提取试剂盒提取总RNA。使用试剂盒进行cDNA制备，最后采用实时荧光定量PCR检测自噬相关mRNA P62和Beclin 1的表达水平，以及通路相关mRNA AMPK和LKB1的mRNA相对表达量，引物序列如表1所示。作为内部对照同时测定GAPDH基因表达。使用2^-ΔΔCt 方法测定基因相对表达。所有样品一式三份运行。

1.2.9　Western Blot法检测Beclin1、P62和LC3Ⅰ/Ⅱ自噬相关蛋白及LKB1、AMPK和p‐AMPK通路相关蛋白表达

收集细胞后用强裂解液在冰上裂解细胞，之后在冰浴条件下用超声破碎仪破碎用以提取各组细胞蛋白。将样品与5×SDS样品缓冲液混合，并在95 ℃下孵育10 min。定量后取10 μg总蛋白上样、10% Tris‐甘氨酸凝胶电泳，之后将蛋白转到0.45 μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后一抗4 ℃孵育过夜。第2天加入二抗孵育1 h，最后进行ECL显影。采用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析，所有样品一式三份。

1.3　统计学分析

使用GraphPad Prism 9.5软件对数据进行统计分析。采用t检验测量两组之间的差异，同时采用单因素方差分析（ANOVA）评估组间差异。实验数据以均数±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　辣椒活性化合物及靶点的获取

在TCMSP数据库中获得辣椒化学成分222个，按照OB≥30%、DL≥0.18的条件进行筛选，获取辣椒的活性化合物为14个（见表2）。以Probability>0.1为筛选标准，获得各活性化合物的靶点基因共有220个。DHC作为辣椒中的重要活性成分之一，在众多已发表的文献^［12-14］中，均被报道在改善心血管疾病方面展现出显著疗效。鉴于此，本研究特选取DHC作为深入探究的目标对象。

2.2　糖尿病心肌病靶点及辣椒-糖尿病心肌病共同靶点的获取

共获得糖尿病心肌病相关靶点基因7 086个，将上述数据库的靶点按照相关性分数进行筛选，获得糖尿病心肌病相关靶点基因共有887个。将辣椒活性化合物的作用靶点与糖尿病心肌病相关作用靶点导入在线网站Venny 2.1，筛选出辣椒-糖尿病心肌病共同靶点共41个，并绘制Venn图（见图1A）。

2.3　PPI网络的构建以及筛选核心靶点

将辣椒-糖尿病心肌病的41个交集基因导入STRING数据库，构建PPI网络图，并导出tsv文件。使用Cytoscape 3.9.1软件分析PPI结果，依据Degree、Closeness和Betweenness值筛选出11位核心靶点（见图1B、1C）。

2.4　GO功能富集分析和通路富集分析

将41个辣椒-糖尿病心肌病交集靶点基因进行GO功能富集分析和通路富集分析。共富集到236个条目，其中生物学过程167条，分子功能46条，细胞组成23条，按照P值大小排序取前10位进行富集分析，绘制富集气泡图（见图2A~2C）。同时进行通路富集分析，富集的前20条相关通路如图2D，其中，LKB1通路被富集。过往研究显示，该通路具有改善DCM的潜力，且这一过程与自噬机制密切相关^［15］。因此，我们进一步探究了辣椒活性成分是否能够通过LKB1/AMPK通路调节自噬过程，进而改善DCM。

2.5　高糖和DHC对心肌细胞活力的影响

给予不同浓度的D‐glu作用于H9C2细胞48 h，结果显示当D‐glu浓度为60 mmol·L^-1时细胞活性率下降至约67%，此时高糖环境对心肌细胞活力有显著影响，因此选取60 mmol·L^-1D‐glu作为后续造模浓度（见图3A）。根据网络药理学分析辣椒的有效化学成分，选取DHC进行进一步验证。结果发现，与CN组（5.5 mmol·L^-1D‐glu）相比，10 mmol·L^-1的DHC对细胞增殖有促进作用，因此选取10 mmol·L^-1的DHC进行后续实验（见图3B）。同时，实验结果提示，给予DHC能够显著提高高糖环境下H9C2 细胞活性（见图3C）。

2.6　高糖处理H9C2细胞自噬情况影响

激光共聚焦结果显示，高糖（HG）处理H9C2细胞后，同CN组比较，HG组自噬流（黄色荧光点）明显降低，高糖环境下给予DHC后，与HG对比，自噬流呈现升高的趋势（见图4）。

2.7　DHC对高糖环境下H9C2细胞自噬相关基因及LKB1/AMPK通路基因的影响

根据网络药理学研究结果筛选出LKB1关键通路并给予实验验证。结果发现，相比于CN组，HG组Beclin1、AMPK和LKB1 mRNA表达下调，而P62 mRNA表达升高；相比于HG组，HG+DHC组Beclin1、AMPK和LKB1 mRNA表达上调，而P62 mRNA表达下调（见图5A）。结果表明，高糖抑制自噬，DHC可增强自噬，LKB1/AMPK信号通路被激活。

2.8　DHC对高糖环境下H9C2细胞自噬蛋白及LKB1/AMPK通路蛋白的影响

如图5B所示，相比于CN组，HG组LC3‐Ⅱ/LC3‐Ⅰ比值下降，Beclin1表达下调，而P62表达升高；相比于HG组，HG+DHC组LC3‐Ⅱ/LC3‐Ⅰ比值升高，Beclin1表达上调，而P62表达下降。结果提示，高糖可抑制自噬水平，给予DHC可增强自噬，改善心肌细胞凋亡。相比于CN组，HG组P‐AMPK/AMPK比值下降，LKB1表达下调；相比于HG组，HG+DHC组P‐AMPK/AMPK比值升高，LKB1表达上调。结果提示LKB1/AMPK信号通路被激活。

3 讨论

糖尿病心肌病（DCM）作为一种与糖尿病密切相关的心肌功能障碍疾病，自1954年被提出后，其复杂的病理生理机制逐渐被揭示^［16］。在这一系列的研究进展中，LKB1/AMPK/ULK1、AMPK/SIRT1介导的IRE1α/PINK等自噬相关信号通路在DCM的发生与发展过程中表现出重要的调节功能。自噬作为细胞内的分解代谢机制，通过选择性降解受损细胞器及冗余生物大分子，在维持细胞功能稳态中发挥核心调控作用。在DCM的环境下，自噬功能的异常可能涉及心肌细胞对持续高糖环境的适应性不足，进而触发一系列有害的病理生理过程，如心肌细胞死亡、纤维化及心功能下降等^［17-18］。值得注意的是，尽管持续高糖状态诱发的细胞应激反应是导致DCM进展的关键因素之一，但目前针对DCM的有效治疗手段仍然有限。此外，近年来有研究^［19-20］表明，辣椒中辣椒素、二氢辣椒素（DHC）和一些类胡萝卜素是具有抗癌和心脏保护的主要活性化合物。然而，关于辣椒是否含有针对DCM的特定有效成分、这些成分作用于哪些靶基因以及通过何种信号调节通路发挥保护作用，目前科学界尚缺乏明确的认识。

本研究首先基于中药网络药理学数据库，筛选出辣椒中14种具有显著生物活性的核心化学成分，包括DHC、辣椒素、类胡萝卜素等。研究^［21］报道，辣椒素通过激活TRPV1和Nrf2/HMOX1通路抑制心肌细胞铁死亡，进而减轻2型糖尿病小鼠心肌梗死后的心脏损伤。DHC可以通过PPARγ/LXRαDHC通路显著减少高脂肪/高胆固醇饮食的apoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成^［13］。这些丰富的有效成分为辣椒改善DCM奠定了基础，具有较高的临床应用价值。针对辣椒的有效成分初步筛选出220个靶基因，通过运用STRING数据库对交集基因进行PPI网络分析，筛选到PPARα、PPARγ、ESR1、TP53和AKT1等41个互作基因。其中PPARα被认为是DCM发展的重要参与者，如PPARα的过表达导致小鼠发生严重的心肌病^［22］，而抑制PPARα会阻止DCM的发展^［23］。另外，进一步对41个互作基因进行KEGG富集，其中LKB1通路、甲状腺激素的产生和外周下游信号效应等通路与DCM密切相关^{［15， 24］}，具备进一步深入探究的价值。

既往研究^［15］已经证实LKB1/AMPK/ULK1通路介导的自噬能够改善DCM。本研究用高糖刺激H9C2细胞，发现LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1等自噬相关基因和蛋白表达降低，P62基因和蛋白表达升高；同时LKB1、p‐AMPK/AMPK的基因和蛋白表达均降低，提示高糖刺激诱导自噬通过LKB1/AMPK信号通路来影响心肌细胞。后续研究中，在高糖培养的心肌细胞培养皿内加入不同浓度的DHC，发现10 μmol·L^-1 DHC组的细胞活性最适宜，因此选择10 μmol·L^-1 DHC为后续实验组。实验结果表明，DHC组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LKB1、p‐AMPK/AMPK的表达水平均较HG组升高，而P62基因和蛋白表达降低，说明DHC可以通过LKB1/AMPK通路促进心肌细胞自噬过程。有研究^［25］证实，DHC通过诱导内质网应激介导的自噬从而保护WI38肺上皮成纤维细胞，这与本研究中DHC增强心肌细胞自噬进而改善DCM的结果相似。本研究结果提示DHC可通过促进自噬相关LKB1/AMPK信号通路减轻高糖诱导的心肌细胞损伤，但是尚未进一步对DHC改善DCM进行深入的体内研究。同时，未对辣椒中其他活性成分发挥的药理作用和机制进行深入探讨。

综上，本研究网络药理学结果表明辣椒通过多靶点、多信号的机制在改善DCM中发挥作用。细胞学实验揭示了辣椒关键成分DHC可通过促进自噬相关LKB1/AMPK信号通路减轻高糖诱导的心肌细胞损伤，从而改善DCM的作用机制。本研究为辣椒的活性成分改善DCM的进一步研究开发和临床应用提供了实验依据。

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基金资助

珠海市科技计划项目(2220004000275)

深圳市科技计划项目(JCYJ20210324105614039)