延胡索酸通过抑制cGAS-STING通路介导的坏死性凋亡在肠缺血再灌注损伤中的作用

Fumarate attenuates intestinal ischemia-reperfusion injury by suppressing cGAS-STING-mediated necroptosis

摘要

目的 探讨三羧酸循环代谢产物延胡索酸在肠缺血再灌注（IIR）损伤中的保护作用及其可能机制，以及是否通过抑制cGAS‐STING介导的坏死性凋亡通路实现。 方法 动物实验中，将C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（S组）和肠缺血再灌注组（IIR组）。建模后取小肠组织进行HE染色和Chiu's病理评分，qPCR检测延胡索酸水合酶（FH）表达，Western Blot检测cGAS‐STING/RIPK1‐RIPK3‐MLKL信号通路活化水平。细胞实验中，IEC‐6细胞被分为对照组（Con组）、氧糖剥夺组（OGD/R组）、OGD/R+外源性富马酸单甲酯（MMF）处理组及OGD/R+MMF+STING激动剂SR‐717组（STING激动组）。建立OGD/R模型后，qPCR检测FH表达、Western Blot检测信号通路蛋白表达，并通过Calcein AM/PI双荧光染色评估坏死性凋亡的发生程度。此外，使用AlphaFold预测靶蛋白结构，AutoDock完成延胡索酸与靶点蛋白的分子对接，观察两者相互作用残基。 结果 动物实验显示，IIR组较S组小肠组织损伤严重，FH表达显著下降，cGAS‐STING及RIPK1‐RIPK3‐MLKL信号通路显著激活（P<0.05）。细胞实验中，在OGD/R后IEC‐6的FH表达下降，cGAS‐STING和RIPK1‐RIPK3‐MLKL信号通路激活；给予外源性延胡索酸后可有效逆转上述变化，STING激动剂可显著削弱延胡索酸的保护作用。分子对接结果提示延胡索酸可与相关靶蛋白发生稳定结合。 结论 延胡索酸可通过抑制cGAS‐STING信号通路，阻断下游RIPK1‐RIPK3‐MLKL介导的坏死性凋亡，从而减轻IIR损伤。

Abstract

Objective To investigate the protective role of fumarate, a key tricarboxylic acid (TCA) cycle metabolite, in intestinal ischemia-reperfusion (IIR) injury and to explore whether its effects are mediated through the inhibition of the cGAS-STING-mediated necroptosis pathway. Methods In the animal experiment, C57BL/6J mice were randomly divided into a sham group (S group) and an IIR model group (IIR group). After modeling, intestinal tissues were collected for histological evaluation using HE staining and Chiu's scoring. The expression of fumarate hydratase (FH) was detected by qPCR, and the activation of cGAS-STING and RIPK1-RIPK3-MLKL signaling pathways was assessed via Western blot. In the cell experiment, IEC-6 cells were divided into four groups: control (Con), oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R), OGD/R + fumarate (monomethyl fumarate, MMF), and OGD/R + MMF + STING agonist SR-717 (STING activation group). An OGD/R model was established. FH expression and signaling pathway activation were analyzed using qPCR and Western blot, respectively. Calcein AM/PI double-fluorescence staining was used to evaluate necroptosis. Additionally, AlphaFold was used to predict protein structures, and AutoDock was employed to simulate the molecular docking of fumarate with target proteins and observe interacting residues. Results In vivo, the IIR group exhibited significantly more severe intestinal injury compared with the sham group, with decreased FH expression and enhanced activation of the cGAS-STING and RIPK1-RIPK3-MLKL pathways (P<0.05). Similarly, in vitro, OGD/R-treated IEC-6 cells showed decreased FH expression and activation of necroptosis pathways. Exogenous fumarate (MMF) treatment reversed these changes, while the STING agonist significantly attenuated the protective effects of fumarate. Molecular docking results revealed that fumarate could stably bind to target proteins. Conclusion Fumarate alleviates intestinal ischemia-reperfusion injury by suppressing the cGAS-STING pathway and downstream necroptosis signaling mediated by RIPK1-RIPK3-MLKL.

Graphical abstract

关键词

肠缺血再灌注损伤 / cGAS‐STING信号通路 / 坏死性凋亡 / 三羧酸循环 / 延胡索酸

Key words

Intestinal Ischemia‐Reperfusion Injury / cGAS-STING Signaling Pathway / Necroptosis / Tricarboxylic Acid Cycle / Fumarate

肠缺血再灌注（intestinal ischemia‐reperfusion，IIR）损伤是一种临床病理生理过程，可导致黏膜上皮广泛死亡，绒毛和隐窝丧失，肠屏障功能障碍，进而引起严重并发症，死亡率高达50%~90%。临床上，IIR见于急慢性肠梗阻、急性肠系膜栓塞、小肠移植、低血压休克等病例。研究表明，许多过程如氧自由基的积累、cGAS‐STING信号通路的激活和多种细胞死亡途径，包括铁死亡^［1］、自噬^［2］、焦亡^［3］和坏死性凋亡^［4］，都与IIR的发病机制有关。

糖酵解是糖代谢的初始阶段，产物丙酮酸在线粒体中通过三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环进一步氧化。在多种疾病模型中，TCA循环易发生紊乱，伴随中间代谢物显著变化和促炎因子的释放。部分代谢产物在此背景下可作为免疫代谢因子参与细胞功能调节，如抑炎代谢物衣康酸^［5-6］和促炎代谢物琥珀酸^［7-8］。延胡索酸作为TCA循环中间产物，近年来因其抗炎作用而受到关注，临床上被用于治疗银屑病和多发性硬化；而在延胡索酸水合酶（fumarate hydratase，FH）缺陷的肾癌中，延胡索酸的异常累积则与促炎环境有关，提示其可能具有双向调控作用^［9-10］。

cGAS‐STING为环鸟苷酸‐腺苷酸合成酶‐干扰素基因刺激因子（cyclic GMP‐AMP synthase‐stimulator of interferon genes），cGAS‐STING信号通路是细胞识别胞质双链DNA（dsDNA）并激活先天免疫反应的关键机制。当胞内DNA积聚时，cGAS被激活并合成cGAMP，后者与内质网膜上的STING结合，启动TANK结合激酶1‐干扰素调节因子3（TBK1‐IRF3）、蛋白激酶R样ER激酶‐真核细胞起始因子2α（PERK‐eIF2α）及Janus激酶‐信号传导和转录激活蛋白（JAK‐STAT）等多个通路，促进Ⅰ型干扰素（IFN‐Ⅰ）、干扰素刺激基因（ISGs）和炎症因子（如TNF‐α、IL‐6、IL‐1α）表达，并在疾病模型中被证实可诱导坏死性凋亡，成为近年来的研究热点^{［11‐14］}。

坏死性凋亡是以细胞肿胀、质膜破裂和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）释放为特征的程序性死亡形式，其核心机制为受体相互作用蛋白激酶1‐受体相互作用蛋白激酶3‐混合谱系激酶结构域样蛋白（receptor interacting protein kinase 1‐receptor interacting protein kinase 3‐mixed lineage kinase domain‐like protein，RIPK1‐RIPK3‐MLKL）信号通路的激活，RIPK3与MLKL蛋白被视为该通路的关键标志物。研究^{［15‐18］}已证实坏死性凋亡在缺血再灌注损伤中的关键作用，抑制该通路可显著减轻肠上皮细胞损伤并改善屏障功能。

本研究中，我们通过小鼠IIR模型和IEC‐6细胞氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，探讨延胡索酸是否通过调控cGAS‐STING，进而发挥抑制坏死性凋亡、缓解IIR损伤的作用，为代谢干预在IIR治疗中的应用提供理论依据与新靶点。

1 材料与方法

1.1　试剂与仪器

RIPK1（3493，1∶1 000）和STING（50494，1∶1 000）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；p‐RIPK1（66854‐1‐Ig，1∶1 000）、β‐actin（66009‐1‐Ig，1∶1 000）和MLKL（66675‐1‐Ig，1∶1 000）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；磷酸化的抗体p‐MLKL（AF7420，1∶1 000）和p‐STING（AF7416，1∶1 000）抗体购自江苏亲科生物有限公司；Calcein AM/碘化丙啶（PI）双荧光检测试剂盒（E‐CK‐A354）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；外源性延胡索酸富马酸单甲酯（monomethyl fumarate，MMF；HY‐103252）和STING激动剂SR‐717（HY‐131454）购自美国MedChemExpress公司；RNA提取试剂盒（RC102‐01）购自南京诺唯赞公司；cDNA合成试剂（RK20400）与qPCR试剂（RK21203）购自武汉爱博泰克公司。

1.2　动物

选用SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠12只，6~8周龄，体质量20~25 g，购自三峡大学医学院。小鼠适应性饲养1周，环境温度（22±2） ℃，湿度40%~60%，自由进食饮水。

1.3　小鼠肠缺血再灌注模型的建立

术前禁食12 h（不禁水），称重后腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg·kg^-1）麻醉小鼠。仰卧位固定，常规腹部消毒并正中开腹，分离肠系膜上动脉，用血管夹夹闭45 min后复灌120 min，取小肠组织并于-80 ℃冷冻保存。假手术组仅分离血管，不进行夹闭。

1.4　实验分组

本实验选择成年健康雄性C57BL/6J小鼠12只，随机数表法将小鼠分为2组，分别为假手术组（Sham组，n=6）、肠缺血再灌注组（IIR组，n=6）。

1.5　细胞培养

肠上皮细胞系（IEC‐6）购自上海赛百慷生物科技有限公司，在含有10%胎牛血清和1%青‐链霉素的DMEM完全培养基中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。每2 d用胰蛋白酶分离细胞进行传代培养。OGD/R模型建立：细胞换用无糖DMEM培养基，并置于95% N₂/5% CO₂培养箱中缺氧处理4 h，然后恢复正常培养条件复氧3 h。

IEC‐6细胞根据处理方式被分为对照组（Con组）、氧糖剥夺组（OGD/R组）、OGD/R+延胡索酸（MMF）处理组及OGD/R+MMF+STING激动剂SR‐717组。

1.6　检测指标与方法

1.6.1　肠组织病理学评估

再灌注结束后取小肠组织，一部分置于-80 ℃保存，另一部分固定于10%中性甲醛，常规石蜡包埋，切片厚度5 μm，进行苏木精‐伊红（HE）染色。使用光学显微镜观察，并根据Chiu's法进行病理学评分。

1.6.2　qPCR检测基因表达

取组织或细胞样本，采用Super FastPure试剂盒提取总RNA。每1 μg RNA使用HiScriptⅢ RT Master Mix合成cDNA；实时荧光定量PCR使用2×SYBR Green Fast qPCR Mix完成，内参为β‐actin，基因相对表达量通过2^-ΔΔCt 法计算。

1.6.3　Western Blot检测蛋白质表达

组织与细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂与PMSF，采用RIPA缓冲液裂解后，使用BCA法定量蛋白浓度。等量蛋白样本在100 ℃加热10 min，12%SDS‐PAGE分离，转膜至0.45 μm PVDF膜；5%脱脂奶室温封闭1 h，加入一抗孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，再次洗涤后使用ECL发光液显影，图像由Bio‐Rad成像系统采集，ImageJ软件分析条带灰度值。

1.6.4　Calcein AM/PI双荧光染色检测坏死性凋亡

采用双染色试剂盒检测细胞活性和坏死程度。Calcein AM标记活细胞，呈绿色荧光；PI标记死亡细胞，呈红色。细胞处理结束后弃去培养液，用PBS洗涤3次，加入染色缓冲液孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.7　统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism 9.1.0软件分析，数据以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。两组间比较使用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析（one‐way ANOVA），两两比较采用Tukey法，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1　IIR诱导延胡索酸代谢紊乱并激活cGAS‐STING和坏死性凋亡通路

肠缺血再灌注后，小鼠肠组织出现明显病理改变，包括黏膜水肿、绒毛断裂、隐窝结构丧失及间质大量炎症细胞浸润（图1）。qPCR结果显示，IIR组小鼠小肠中FH mRNA表达水平显著下降；Western Blot结果提示cGAS‐STING及RIPK1‐RIPK3‐MLKL通路显著激活（图2），提示坏死性凋亡参与IIR病理过程。

2.2 氧糖剥夺处理致IEC‐6细胞延胡索酸代谢紊乱并激活cGAS‐STING和坏死性凋亡通路

在体外模型中，IEC‐6细胞经氧糖剥夺/复氧4 h/3 h处理后，FH表达水平显著降低。cGAS‐STING及RIPK1‐RIPK3‐MLKL通路被显著激活（图3）；Calcein AM/PI双荧光染色显示坏死性凋亡细胞比例明显上升（图4），提示体外模型与体内结果一致。

2.3　外源性延胡索酸缓解OGD/R诱导的cGAS‐STING及坏死性凋亡激活

MMF是人工合成的富马酸类似物，外源性给予MMF可提高组织或细胞内部延胡索酸的浓度。为了探究延胡索酸在IIR中的作用，我们在对IEC‐6进行OGD/R处理前6 h在培养基中加入50 μmol·L^-1的MMF。Western Blot结果显示给予MMF后cGAS‐STING/RIPK1‐RIPK3‐MLKL通路激活减少（图5），同时降低坏死性凋亡细胞比例（图6）。结果表明，延胡索酸在OGD/R模型中具有保护作用，可能通过抑制cGAS‐STING介导的坏死性凋亡机制发挥作用。

2.4　STING激动剂逆转延胡索酸的保护作用

为验证延胡索酸是否通过cGAS‐STING通路发挥作用，我们采用AlphaFold预测STING结构，并与延胡索酸进行AutoDock分子对接，发现STING蛋白与延胡索酸的THR‐267、GLY‐166和ARG‐238残基形成稳定结合（图7），且两者结合能为-5.8 kcal·mol^-1。通常当结合能<-5.0 kcal·mol^-1，表明结合活性良好。此外在细胞实验中，给予MMF的同时再给予STING特异性激动剂SR‐717，可逆转MMF的保护作用，重新激活STING及RIPK1‐RIPK3‐MLKL通路（图8），证实延胡索酸通过抑制STING激活来抑制坏死性凋亡从而发挥保护作用。

3 讨论

IIR损伤具有较高的发病率和死亡率，严重威胁患者生命健康，并对医疗体系构成沉重负担，因此迫切需要探索有效的治疗策略。近年来，代谢重编程在炎症性疾病中的免疫参与机制受到广泛关注，尤其是代谢中间产物在免疫应答中的非经典功能逐渐被认识。延胡索酸作为TCA循环的重要中间产物，除参与能量代谢外，在某些炎症疾病中表现出免疫调节作用，但其在IIR及相关细胞死亡机制中的作用尚未得到系统阐明。

坏死性凋亡（necroptosis）是一种依赖RIPK1、RIPK3和MLKL信号轴的程序性细胞死亡方式，兼具坏死和凋亡的特征。与凋亡不同，坏死性凋亡导致细胞膜完整性丧失和炎性因子外泄，从而加剧组织炎症反应。越来越多研究表明，坏死性凋亡在IIR过程中发挥重要作用——RIPK3或MLKL缺陷的小鼠对IIR具有显著的抗损伤能力，提示该通路的异常激活是肠黏膜屏障破坏和炎症放大的关键环节。因此，探索调控坏死性凋亡的上游信号成为缓解IIR损伤的重要方向。已有研究^［19］表明，cGAS‐STING通路与坏死性凋亡的发生密切相关。cGAS‐STING通路作为胞质DNA的关键感应系统，不仅介导抗病毒免疫，也被证实与多种无菌性炎症及程序性细胞死亡密切相关。已有研究表明，cGAS‐STING激活可通过上调IFN-Ⅰ和TNF‐α等炎性因子，诱导RIPK1/RIPK3复合物形成，从而触发坏死性凋亡。

在本研究中，我们通过建立IIR动物及OGD/R细胞模型发现，FH表达显著下调，提示延胡索酸在组织内可能发生异常积聚。与此同时，cGAS‐STING信号通路被激活，并伴随RIPK1和MLKL的磷酸化水平升高，表明cGAS‐STING与坏死性凋亡通路在IIR过程中处于过度激活状态。值得注意的是，外源性补充延胡索酸可显著抑制STING激活并降低细胞坏死性凋亡水平，这一结果提示延胡索酸可能通过抑制STING活性而发挥保护作用。

为进一步验证延胡索酸与STING的作用关系，我们进行了分子对接分析，发现延胡索酸可与STING蛋白多个关键残基（如THR‐267、GLY‐166、ARG‐238）形成稳定氢键与疏水相互作用，且结合能为-5.8 kcal·mol^-1，提示其可能直接干预STING的构象活化。在功能验证实验中，加入STING特异性激动剂SR‐717后，延胡索酸的保护作用被显著削弱，信号通路重新激活，进一步证实了cGAS‐STING通路是延胡索酸抗IIR损伤效应的关键靶点。

综上所述，本研究证实了延胡索酸在IIR中的保护作用，并揭示其通过抑制cGAS‐STING及下游坏死性凋亡通路，减轻肠道屏障破坏。这一发现为延胡索酸作为代谢重编程干预策略提供了理论依据，并提示其可能作为未来IIR治疗的新型代谢靶点药物。

然而，本研究仍存在一定局限性。一方面，cGAS‐STING是否通过直接调控RIPK1‐RIPK3‐MLKL轴介导坏死性凋亡尚需进一步机制验证；另一方面，延胡索酸与STING的结合虽然通过分子对接预测具备结合潜力，但缺乏生物物理或生化实验（如表面等离子共振、免疫共沉淀等）进一步佐证。此外，未采用FH基因敲除模型验证延胡索酸代谢障碍在IIR中的病理作用，亦缺乏临床样本支持研究结果的外部一致性。未来研究可从遗传干预和临床转化两个维度，进一步明确延胡索酸在IIR中的调控机制及其干预潜力。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(82172155)

国家自然科学基金青年项目(82202410)