外源性亚精胺通过激活AMPK/PGC-1α通路减轻肠缺血再灌注损伤

Exogenous spermidine alleviates intestinal ischemia-reperfusion injury by activating the AMPK/PGC-1α pathway

摘要

目的 探究外源性亚精胺对肠缺血再灌注（IIR）损伤的保护作用，并明确其是否通过激活AMPK/PGC-1α通路发挥作用。 方法 ①动物实验：将24只C57BL/6J小鼠分为假手术组（Sham组）、肠缺血再灌注组（IIR组）、假手术+亚精胺组（Sham+spd组）、肠缺血再灌注+亚精胺组（IIR+spd组），每组6只。制备小鼠IIR损伤模型，留取小肠组织，观察组织改变，行Chiu's病理学损伤评分，TUNEL染色检测细胞凋亡，Western Blot检测钙黏蛋白E-Cadherin、AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白表达，试剂盒检测ROS、MDA、LDH水平及SOD活性，ELISA检测TNF-α、IL-1β的表达水平，RT-qPCR检测Tnf-α、Il-1β、Ampk、Pgc-1α的mRNA表达。②细胞实验：Caco-2细胞随机分为对照组（NC组）、缺氧/复氧组（HR组）、对照+亚精胺组（NC+spd组）、缺氧/复氧+亚精胺组（HR+spd组）。建立缺氧/复氧模型后，CCK-8法检测细胞存活率，试剂盒检测ROS、MDA、LDH水平及SOD活性，Western Blot检测AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白表达，ELISA检测TNF-α、IL-1β的表达水平，RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、AMPK、PGC-1α的mRNA表达。 结果 在动物实验中，IIR组Chiu's病理学评分相较于Sham组显著增高，ROS、MDA、LDH水平升高，SOD活性降低，促炎因子TNF-α、IL-1β表达增多，AMPK、PGC-1α表达降低，p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）；与IIR组相比，IIR+spd组肠组织病理损伤减轻、Chiu's评分降低，ROS、MDA、LDH水平降低，SOD活性升高，细胞凋亡减少，促炎因子表达降低，AMPK、PGC-1α表达升高，p-AMPK/AMPK比值升高（P<0.05）。细胞实验中，Caco-2细胞在HR后存活率降低，ROS、MDA、LDH水平升高，SOD活性降低，促炎因子表达升高，AMPK、PGC-1α表达降低，p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）；而HR+spd组较HR组ROS水平降低，炎症因子表达减少，AMPK、PGC-1α表达升高，p-AMPK/AMPK比值升高（P<0.05）。 结论 外源性亚精胺可能通过激活AMPK/PGC-1α通路减轻IIR损伤。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of exogenous spermidine on intestinal ischemia-reperfusion (IIR) injury and clarify whether it exerts the effect by activating the AMPK/PGC-1α pathway. Methods In vivo, 24 C57BL/6J mice were divided into 4 groups (6 mice in each group): sham operation group (Sham group), intestinal ischemia-reperfusion group (IIR group), sham operation+spermidine group (Sham+spd group), and intestinal ischemia-reperfusion+spermidine group (IIR+spd group). A mouse IIR injury model was prepared, and intestinal tissue samples were harvested, then the histological alterations were observed, Chiu's pathological injury scoring was performed, the apoptosis was detected byvia TUNEL staining, and the protein expression of E-cadherin, AMPK, p-AMPK, and PGC-1α was assessed by Western Blot. Kits were used to measure ROS, MDA, LDH levels, and SOD activity. ELISA was employed to detect TNF-α and IL-1β expression levels. RT-qPCR was performed to assess mRNA expression of Tnf-α, Il-1β, Ampk, and Pgc-1α. In vitro, Caco-2 cells were randomly divided into the control group (NC group), hypoxia/reoxygenation group (HR group), control+spermidine group (NC+spd group), and hypoxia/reoxygenation+spermidine group (HR+spd group). Following establishment of the hypoxia/reoxygenation model, cell viability was assessed using the CCK-8 assay. Reagent kits were employed to measure ROS, MDA, LDH levels, and SOD activity. Western Blot analysis evaluated AMPK, p-AMPK, and PGC-1α protein expression. ELISA assays determined TNF-α and IL-1β expression levels. RT-qPCR quantified mRNA expression of TNF-α, IL-1β, AMPK, and PGC-1α. Results In vivo, the IIR group exhibited significantly higher Chiu's pathological scores compared to the Sham group, along with elevated levels of ROS, MDA, and LDH, reduced SOD activity, increased expression of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-1β, decreased expression of AMPK and PGC-1α, and a reduced p-AMPK/AMPK ratio (P<0.05). Compared with the IIR group, the IIR+spd group exhibited reduced intestinal histopathological damage, decreased Chiu's score, lower ROS, MDA, and LDH levels, increased SOD activity, reduced apoptosis, decreased proinflammatory factor expression, increased AMPK and PGC-1α expression, and elevated p-AMPK/AMPK ratio (P<0.05). In vitro, Caco-2 cells exhibited reduced survival rates after HR exposure, elevated ROS, MDA, and LDH levels, decreased SOD activity, increased pro-inflammatory factor expression, reduced AMPK and PGC-1α expression, and decreased p-AMPK/AMPK ratio (P<0.05). In contrast, the HR+spd group exhibited reduced ROS levels, decreased inflammatory factor expression, increased AMPK and PGC-1α expression, and an elevated p-AMPK/AMPK ratio compared to the HR group (P<0.05). Conclusion Exogenous spermidine may alleviate IIR injury by activating the AMPK/PGC-1α pathway.

Graphical abstract

关键词

亚精胺 / 肠缺血再灌注损伤 / AMPK/PGC-1α通路

Key words

Spermidine / Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury / AMPK/PGC-1α Signal Pathway

肠缺血再灌注（intestinal ischemia-reperfusion injury，IIR）损伤是临床中普遍存在的急性危重疾病。它与各种临床疾病的发病、进展和预后密切相关^［1］。IIR损伤指的是缺血所造成的局部组织损伤在血液再灌注后发生恶化，常由严重创伤、烧伤、休克、肠扭转、肠系膜血栓栓塞和小肠移植引起，会导致肠道黏膜屏障破坏、细菌及毒素入血，从而引起全身炎症反应和多器官功能障碍综合征^［2］。

IIR损伤涉及多种分子机制，其中氧化应激是核心驱动因素^［3］。氧化应激过程包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量产生和抗氧化系统失衡等多个环节。再灌注阶段产生的过量ROS可攻击细胞膜、细胞器及DNA等生物分子，引发脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤，并通过信号通路诱导肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎症介质释放，加剧组织损伤^［4］。当前研究重点在于抑制氧化应激，抗氧化剂在减轻IIR损伤中已得到广泛关注，靶向氧化应激是预防或减轻IIR损伤的有效策略之一^［5-6］。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种细胞内能量传感器和调节剂^［7］。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（PPARγ coactivator-1α，PGC-1α）是一种转录共激活因子，可协调多种组织的生理适应过程，在介导糖异生、糖酵解、脂肪生成、线粒体脂肪酸氧化以及线粒体呼吸效率方面具有多种作用^［8］。作为代谢稳态调控网络中的重要环节，AMPK/PGC-1α通路与氧化应激息息相关^［9］，有研究证实，活化的AMPK通过PGC-1α缓解线粒体紊乱，减少活性氧的产生^［10］；在人视网膜色素上皮细胞中，PGC-1α具有重要的调节氧化代谢作用及抗氧化能力^［11］；AMPK/PGC-1α信号通路的激活，可以减少心肌细胞的氧化应激和线粒体功能障碍，从而减轻心肌缺血再灌注损伤^［12］。因此，调控AMPK/PGC-1α信号通路对代谢稳态的维持至关重要。

多胺是指含有两个以上氨基的脂肪族化合物，广泛分布于原核生物和真核生物中，包括腐胺（putrescine）、亚精胺（spermidine）、精胺（spermine）等。亚精胺已被证明能够参与调控动物机体内生物大分子物质合成、细胞信号转导^［13］和细胞抗氧化^［14］等许多生物学过程。诸多研究证实，补充外源性亚精胺对缺血再灌注损伤能够起到保护作用。既往研究^［15］表明，在缺血再灌注损伤的小鼠心肌细胞中，亚精胺抑制氧化应激，改善了心肌梗死诱导的心功能障碍降低。也有研究^［16］表明，补充亚精胺可减轻缺血再灌注后的肾小管损伤和肾功能障碍。目前尚不明确亚精胺是否对IIR损伤具有保护作用以及是否通过AMPK/PGC-1α通路发挥保护作用。因此本研究旨在通过体内外模型，特异性地探讨亚精胺对IIR损伤的作用以及其与AMPK/PGC-1α信号通路的关系，为临床预防和治疗IIR损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1　试剂与仪器

亚精胺（spd）购于美国MCE公司（货号：HY-B1776）。ROS试剂盒购（货号：CA1410）、人TNF-α酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（货号：SEKH-0047）、鼠TNF-α ELISA试剂盒（货号：SEKR-0009）、人IL-1β ELISA试剂盒（货号：SEKH-0002）、鼠IL-1β ELISA试剂盒（货号：SEKR-0002）购于北京索莱宝公司。丙二醛（MDA）试剂盒（货号：A003-1-2）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（货号：A020-2-2）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（货号：A001-3-2）购于南京建成公司。DAPI（货号：C1002）、CCK-8试剂盒（货号：C0038）、RNA抽提试剂盒（货号：R0017S）、羊抗兔二抗（货号：A0208）购于上海碧云天公司。ABScript Ⅲ RT Master Mix for qPCR试剂盒（货号：RK20428）、2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（货号：RK21203）购于武汉爱博泰克公司。通用型组织固定液（货号：G1101）、RNA稳定保存液（货号：G3019）购于武汉赛维尔公司。兔源钙黏蛋白E-Cadherin单抗（货号：3195）、兔源AMPK抗体（货号：2532）、兔源p-AMPK单抗（货号：50081）、兔源PGC-1α单抗（货号：2178）、兔源β-actin单抗（货号：4970）购于美国Cell Signal Technology公司。液氮研磨仪；NanoDrop；正置显微镜（奥林巴斯BX53）；倒置显微镜（奥林巴斯IX71）；罗氏PCR（Lightcycler 4800Ⅱ）；酶标仪（美国PE公司）；Bio-Rad ChemiDoc化学发光仪。

1.2　实验动物及分组

健康野生型SPF级雄性C57BL/6J小鼠24只，6~8周，体质量20~25 g，购自于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，适应性喂养1周。将C57BL/6J小鼠随机分成4组，分别为假手术组（Sham组）、肠缺血再灌注组（IIR组）、假手术+亚精胺组（Sham+spd组）、肠缺血再灌注+亚精胺组（IIR+spd组），各组均为6只。为了探讨亚精胺对肠缺血再灌注损伤的影响，术前对Sham+spd组、IIR+spd组小鼠经口灌胃20 mg·kg^-1亚精胺7 d。所有实验动物保持正常饮食。

1.3　小鼠肠缺血再灌注模型的建立

腹腔注射浓度为1.5%、剂量5 mL·kg^-1的戊巴比妥钠溶液以麻醉小鼠，使用胶带和缝线以仰卧位固定小鼠。于腹部正中行脱毛、消毒，正中切口进腹，分离肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA），使用微动脉夹夹闭SMA根部，观察动脉搏动及肠壁颜色，确定SMA血流被阻断后，缝合伤口。45 min后拆除缝线，经原切口进腹，松开微动脉夹。Sham组、Sham+spd组行与IIR组相同的开腹等操作，但不夹闭SMA。所有小鼠于再灌注2 h后处死。取离回肠端5 cm的小肠组织，冲洗后分别用4%多聚甲醛固定、液氮冰冻，用于后续实验检测。

1.4　细胞培养及分组

人结肠癌细胞系（Caco-2）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。使用含有10%胎牛血清、1%链霉素-青霉素的MEM培养基，在37 ℃、含有5% CO₂的加湿培养箱中培养Caco-2细胞。将细胞随机分为对照组（NC组）、对照+亚精胺组（NC+spd组）、缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，HR）组（HR组）及缺氧/复氧+亚精胺组（HR+spd组）。对于亚精胺处理组，待Caco-2细胞密度长到70%后，使用50 μmol·L^-1亚精胺预处理2 h，更换培养基2 h后建立缺氧/复氧模型。

1.5　HR模型

为模拟缺氧条件，将细胞在5% CO₂、1% O₂、94% N₂的环境中培养12 h，然后将细胞在常氧条件下培养2 h，完成复氧。

1.6　指标检测及方法

1.6.1　肠黏膜病理学检测

造模完成后取小鼠新鲜缺血区肠组织标本，4%多聚甲醛固定标本、石蜡包埋切片后进行HE染色，光学显微镜观察肠组织病理学变化并采集图像，每个标本取2个切片采集10个不同视野，采用Chiu's评分分别对组织损伤进行独立评分。Chiu's评分标准^［17］：0分，正常小肠上皮绒毛；1分，小肠绒毛顶端上皮下间隙增宽，伴毛细血管淤血；2分，小肠绒毛顶端上皮下间隙扩展，伴上皮层与固有层中度分离；3分，小肠绒毛两侧上皮层与固有层大量分离，绒毛顶端部分破损；4分，小肠绒毛破损，伴固有层毛细血管暴露及炎性细胞增多；5分，固有层破坏、出血和溃疡。

1.6.2　TUNEL染色

取小肠组织样本固定，石蜡包埋切片，进行脱蜡、蛋白酶K修复、破膜、室温平衡等处理后按比例滴加TUNEL反应液，在37 ℃恒温箱孵育2 h，洗涤后滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min，再次洗涤后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于正置荧光显微镜下观察并采集图像，统计分析荧光强度。

1.6.3　Western Blot检测

冰上操作，取各组小鼠小肠组织或Caco-2细胞，按比例加入RIPA裂解液进行裂解，30 min后低温研磨，超声，4 ℃离心取上清后，按照BCA试剂盒的步骤测蛋白浓度，对蛋白进行定量。按比例加入上样缓冲液并煮沸变性10 min。根据蛋白浓度计算上样量，采用10%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，分别使用兔源E-Cadherin、AMPK、p-AMPK、PGC-1α、β-actin单克隆抗体4 ℃摇床敷育过夜，次日TBST室温洗涤3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗室温敷育1 h，再次洗膜，TBST洗涤3次，每次10 min，显影条带，采用Image J分析图像，目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达。

1.6.4　肠道及细胞MDA、SOD及LDH的检测

依照说明书，将小鼠肠组织裂解匀浆后取上清或将细胞提前接种，MDA测定采用硫代巴比妥酸显色法，通过酶标仪在532 nm处读数；SOD活性测定采用水溶性四唑盐法，通过酶标仪在450 nm处读数；LDH测定采用微板法，通过酶标仪在440 nm处读数。

1.6.5　ROS检测

依照说明书，提前将细胞接种于12孔板，去除细胞培养基，加入用无血清培养基稀释至10 μmol·L^-1的DCFH-DA，37 ℃避光孵育20~30 min，孵育完成后用PBS洗涤3次，随后在荧光显微镜下观察并采集图像，使用Image J软件分析图像。

1.6.6　实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

使用无菌无酶物品。使用RNA抽提试剂盒分离小鼠肠组织或Caco-2细胞总RNA，使用ABScript Ⅲ RT Master Mix for qPCR试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，按照2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix的反应体系在罗氏PCR仪进行qPCR。所有引物均由上海碧云天生物技术公司合成，引物序列见表1。

1.6.7　CCK-8检测

根据说明书，将各组细胞用胰蛋白酶消化后再用培养基进行重悬，接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养24 min，每个孔添加CCK-8试剂10 μL，孵育30 min，采用酶标仪测量450 nm处吸光度。

1.6.8　ELISA法检测小肠组织及Caco-2细胞的炎性因子水平

取不同分组的小肠组织和Caco-2细胞，根据ELISA操作说明书，使用相对应的ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β的表达水平。

1.6.9　统计学方法

采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析，正态分布的定量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间采用双因素方差分析，多组间两两比较用Turkey法，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1　亚精胺改善肠缺血再灌注后的组织损伤与屏障破坏

微型动脉夹夹闭小鼠肠系膜上动脉根部后，可见肠管失去血色，逐渐苍白，部分肠管肿胀，45 min取下动脉夹后，可见肠管充血水肿。HE染色切片显示（见图1A），与S组相比，IIR组小鼠肠组织损伤显著增加：小肠绒毛结构被明显破坏，绒毛断裂，可见炎性细胞浸润。Chiu's病理学评分显示（见图1B），IIR组小鼠肠黏膜损伤程度比S组重，Chiu's病理学评分显著增加；与IIR组相比，IIR+spd组的Chiu's损伤评分显著降低（P<0.05）。肠组织机械屏障的完整性方面，结果显示（见图1C、1D），与S组相比，IIR组小鼠肠组织E-Cadherin含量显著降低（P<0.05）；与IIR组相比，IIR+spd组小鼠肠组织E-Cadherin含量显著升高（P<0.05），提示亚精胺可以保护IIR后的肠道机械屏障的完整性。

2.2　亚精胺显著抑制IIR诱导的氧化应激反应

采用DCFH-DA荧光探针标记肠组织中的ROS，通过荧光显微镜观察并定量分析荧光强度。结果显示（见图2A、2B），Sham组仅呈现微弱的红色荧光，表明生理状态下ROS水平较低；IIR组中荧光强度显著增强，提示IIR可诱导肠道内大量ROS生成，引发剧烈的氧化应激反应。而IIR+spd组的荧光强度较IIR组明显减弱（P<0.05）。通过生化检测试剂盒进一步测定肠组织中MDA含量、SOD活性及LDH水平，结果显示（见表2），IIR组MDA、LDH水平较Sham组升高（P<0.05），SOD活性较Sham组降低（P<0.05）。而亚精胺处理后，IIR+spd组MDA、LDH水平较IIR组降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。上述指标的协同变化进一步证实，亚精胺可减少ROS生成、增强内源性抗氧化酶活性，从而减轻IIR诱导的细胞氧化应激损伤。

2.3　亚精胺减少IIR诱导的细胞凋亡和炎症反应

对小鼠肠组织进行TUNEL染色后结果显示（见图3A、3B），IIR组的肠黏膜上皮中出现大量阳性细胞，TUNEL荧光强度显著高于Sham组（P<0.05）。然而，在IIR+spd组中，肠组织TUNEL荧光强度显著降低（P<0.05）。进一步通过实时荧光定量PCR技术检测了炎症因子Tnf-α、Il-1β mRNA的表达水平。结果显示（见图3C），与Sham组相比，IIR组小鼠肠组织中Tnf-α、Il-1β的mRNA相对表达量显著升高（P<0.05），表明肠缺血再灌注引发了强烈的炎症反应。值得注意的是，在给予亚精胺预处理后，Tnf-α、Il-1β的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）。对各组小鼠肠组织进行ELISA检测，结果表明（见图3D），与Sham组相比，IIR组TNF-α和IL-1β水平升高（P<0.05），而IIR+spd组的炎症因子水平则较IIR组降低（P<0.05）。

2.4　亚精胺降低Caco-2细胞HR后氧化应激水平

为进一步验证亚精胺在细胞层面的抗氧化应激作用，我们检测了细胞内的ROS水平，结果显示（见图4A、4B），NC组细胞仅见微弱绿色荧光，ROS水平较低；HR组细胞绿色荧光强度较NC组显著增强（P<0.05），提示HR处理可诱导Caco-2细胞内ROS水平大量增加；而经亚精胺处理的HR+spd组细胞中，绿色荧光强度明显减弱（P<0.05）。通过生化检测试剂盒进一步测定各组细胞MDA含量、SOD活性及LDH水平，结果显示（见表3），HR组MDA、LDH水平较NC组升高（P<0.05），SOD活性较NC组降低（P<0.05）；而HR+spd组MDA、LDH水平则较HR组降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。通过CCK-8法检测细胞存活率，结果显示（见图4C），HR组细胞存活率较Sham组显著下降（P<0.05）；而HR+spd组细胞存活率则显著高于HR组（P<0.05）。实时荧光定量PCR检测结果显示（见图4D），HR组Caco-2细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达量显著高于NC组（P<0.05），而在亚精胺处理后，HR+spd组TNF-α、IL-1β的mRNA表达量较HR组降低（P<0.05）。对各组细胞进行ELISA检测，结果表明（见图4E），与NC组相比，HR组TNF-α和IL-1β水平升高（P<0.05），而HR+spd组的炎症因子水平则较HR组降低（P<0.05）。

2.5　亚精胺通过激活AMPK/PGC-1α抗氧化通路发挥保护作用

在体内实验中，通过Western Blot检测各组小鼠肠组织中AMPK/PGC-1α信号通路蛋白表达（见图5A~5C），与Sham组相比，IIR组中PGC-1α蛋白相对表达量显著下降（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）。在经亚精胺处理后，IIR+spd组的PGC-1α蛋白相对表达量较IIR组显著增加（P<0.05），p-AMPK/AMPK比值也显著升高（P<0.05）。实时荧光定量PCR检测结果进一步验证了AMPK、PGC-1α在转录水平的变化（见图5D、5E）。在IIR组中，Ampk、Pgc-1α的mRNA相对表达量较Sham组显著降低（P<0.05），而IIR+spd组上述基因的mRNA表达量则较IIR组回升（P<0.05）。在体外实验中，通过Western Blot检测各组细胞中AMPK/PGC-1α信号通路蛋白表达（见图5F~5H），HR组中p-AMPK/AMPK比值较NC组降低（P<0.05），PGC-1α蛋白相对表达量也显著下降（P<0.05），而HR+spd组的p-AMPK/AMPK比值则较HR组显著升高（P<0.05），PGC-1α蛋白相对表达量也显著增加（P<0.05）。通过实时荧光定量PCR检测了AMPK、PGC-1α的mRNA相对表达量（见图5I、5J），HR组较NC组显著降低（P<0.05），而亚精胺处理后使上述基因的mRNA表达量较HR组显著回升（P<0.05）。

3 讨论

IIR损伤是临床常见的危重病理过程，其核心机制与氧化应激密切相关。在缺血阶段，肠道组织缺氧导致黄嘌呤脱氢酶不可逆转化为黄嘌呤氧化酶；再灌注时，氧气恢复使黄嘌呤氧化酶催化分子氧生成大量ROS，包括超氧阴离子、羟基自由基及过氧化氢等非自由基，同时线粒体呼吸链电子泄漏和炎症细胞也将释放ROS。过量ROS可攻击细胞内各种生物分子，加剧组织损伤。正常情况下，机体通过超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等酶类抗氧化剂及谷胱甘肽、褪黑素等非酶类抗氧化剂清除ROS，但IIR损伤时ROS的生成远超清除能力，导致严重氧化应激损伤^［4］。在我们的研究中，IIR组肠组织结构遭受严重破坏，肠组织病理学Chiu's评分较Sham组显著升高，E-Cadherin含量显著降低，说明IIR引发的一系列病理反应破坏了肠黏膜上皮细胞间的连接结构，使黏膜屏障功能受损。IIR组小鼠肠组织中的MDA、LDH含量较Sham组升高，SOD活性降低，说明IIR后小鼠发生严重的氧化应激反应。此外，ROS在IIR和HR处理后的肠组织和Caco-2细胞中显著增加，进一步支持了氧化应激的发生。TUNEL染色结果显示，IIR组肠黏膜上皮呈现出大量阳性细胞，表明存在广泛的细胞凋亡现象。进一步分析发现，IIR组肠组织和HR组Caco-2细胞的促炎因子表达水平显著高于S组和NC组，表明IIR引发了强烈的炎症反应。

亚精胺是一种广泛分布于生物体内的多胺类化合物，它在细胞进程中发挥着诸多关键作用，例如稳定DNA、促进细胞生长以及诱导自噬等^［13-14］。同时，亚精胺还具备强抗氧化活性，通过直接与自由基反应，将其转化为稳定物质，抑制自由基对DNA、蛋白质和脂质的损伤；并且在体内能够促进抗氧化酶的表达，增强机体的抗氧化能力^［18］。此外，亚精胺促进谷胱甘肽等非酶抗氧化物质的合成，增强细胞的抗氧化防御，减少氧化损伤^［19］。此前已有不少文献^［16］证实亚精胺对缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究进一步证实了亚精胺对IIR损伤的保护作用。体内实验结果表明，亚精胺处理后，IIR小鼠的黏膜下层水肿减轻，肠道结构损伤减轻，病理学Chiu's评分降低，E-Cadherin含量升高，表明亚精胺能够改善IIR后的肠组织损伤与屏障破坏。在氧化应激方面，亚精胺处理组的小鼠ROS荧光染色强度也较IIR组显著减少，说明亚精胺减少了IIR后ROS的生成；生化指标上，亚精胺处理使得肠组织MDA、LDH水平降低，SOD活性升高，进一步证实了亚精胺可以减少IIR后的氧化应激损伤。亚精胺的保护作用不仅体现在对肠黏膜屏障功能的维护和调节氧化应激，还体现在对炎症反应的抑制。在亚精胺的干预下，IIR后的肠道TUNEL荧光染色强度显著降低，促炎细胞因子分泌减少，说明亚精胺能够减少IIR后的细胞凋亡与炎症反应。而在体外实验中，亚精胺处理组的Caco-2细胞内ROS水平降低，细胞存活率上升，促炎细胞因子分泌减少，进一步证实了亚精胺能够降低细胞HR后氧化应激水平，具有保护作用。综上所述，亚精胺能够改善IIR后的肠道组织损伤与屏障破坏，显著抑制IIR诱导的氧化应激反应，减少细胞凋亡与炎症反应。

AMPK作为细胞能量感知与代谢调控的核心分子，在氧化应激状态下被激活后可磷酸化下游靶蛋白PGC-1α^［20］，后者作为线粒体生物合成与抗氧化应激的关键转录共激活因子，进一步上调抗氧化转录因子的表达，启动抗氧化酶的合成，从而形成级联反应。有文献^［12］证明，AMPK/PGC-1α通路的激活能增强受损心肌细胞的抗氧化应激能力，对受损心肌起到保护作用。而我们的研究结果强烈提示亚精胺的保护效应与AMPK/PGC-1α通路激活之间的关系：亚精胺处理后的IIR组p-AMPK、PGC-1α蛋白表达显著增加；Ampk、Pgc-1α的mRNA表达较IIR组显著回升，类似的趋势同样出现于体外实验中。且有相关研究证实，亚精胺能够调控AMPK磷酸化水平及其下游基因表达，而AMPK抑制剂处理能够一定程度地抑制亚精胺促进AMPK磷酸化的功能^［21］。这一结果进一步佐证了亚精胺功能与AMPK/PGC-1α通路的紧密关联性。而在分子机制层面上，亚精胺激活AMPK的具体途径尚未明确，是直接结合AMPK亚基、间接影响线粒体功能，还是通过影响细胞内AMP/ATP比例、调控自噬通路等方式介导AMPK激活，仍需进一步探索。AMPK/PGC-1α通路下游具有多种潜在的功能效应器，如促进线粒体生物合成、改善线粒体功能、激活自噬通路、减少细胞凋亡等。值得注意的是，上述效应器的功能变化与本研究中观察到的表型形成高度呼应：线粒体生物合成增加与功能改善，直接对应组织氧化应激水平的下降（表现为ROS含量降低、抗氧化酶SOD活性升高等）；自噬激活与凋亡抑制，则与组织病理损伤减轻（如炎症因子水平下降）及细胞死亡数量减少（TUNEL阳性细胞率降低）的结果相契合。这一系列关联验证了AMPK/PGC-1α通路在保护效应中的核心地位，使本研究的保护机制假说更具说服力，也为后续针对性干预靶点的筛选提供了明确的理论框架。

研究结果提示，亚精胺可能通过激活AMPK/PGC-1α通路，显著减轻IIR损伤。后续研究我们将致力于通过条件性基因敲除小鼠构建与特异性抑制剂应用进一步夯实本研究的结论并为机制解析提供直接证据，从而为临床干预IIR提供了新的分子机制和精准的通路靶向策略。

参考文献

[1] WANG F, HUANG H, WEI X, et al. Targeting cell death pathways in intestinal ischemia-reperfusion injury: A comprehensive review [J]. Cell Death Discov, 2024, 10(1): 112.

[2] BALA M, CATENA F, KASHUK J, et al. Acute mesenteric ischemia: Updated guidelines of the World Society of Emergency Surgery [J]. World J Emerg Surg, 2022, 17(1): 54.

[3] GUTIÉRREZ-SÁNCHEZ G, GARCÍA-ALONSO I, GUTIÉRREZ SÁENZ DE SANTA MARÍA J, et al. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Antioxidants (Basel), 2021, 10(6):853.

[4] LI G, WANG S, FAN Z. Oxidative stress in intestinal ischemia-reperfusion [J]. Front Med (Lausanne), 2021, 8: 750731.

[5] WU L Q, XIONG X X, WU X M, et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion Injury [J]. Front Mol Neurosci, 2020, 13:28.

[6] SASAKI M, JOH T. Oxidative stress and ischemia-reperfusion injury in gastrointestinal tract and antioxidant, protective agents [J]. J Clin Biochem Nutr, 2007, 40(1): 1-12.

[7] CAI J, CHEN X Y, LIU X Y, et al. AMPK: The key to ischemia-reperfusion injury [J]. J Cell Physiol, 2022, 237(11): 4079-4096.

[8] HALLING J F, PILEGAARD H. PGC-1α-mediated regulation of mitochondrial function and physiological implications [J]. Appl Physiol Nutr Me, 2020, 45(9): 927-936.

[9] RIUS-PEREZ S, TORRES-CUEVAS I, MILLAN I, et al. PGC-1alpha, inflammation, and oxidative stress: An integrative view in metabolism [J]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020: 1452696.

[10] LI L L, CHU X, YAO Y, et al. (-)-Hydroxycitric acid alleviates oleic acid-induced steatosis, oxidative stress, and inflammation in primary chicken hepatocytes by regulating AMP-activated protein kinase-mediated reactive oxygen species levels [J]. J Agr Food Chem, 2020, 68(40): 11229-11241.

[11] IACOVELLI J, ROWE G C, KHADKA A, et al. PGC-1α induces human RPE oxidative metabolism and antioxidant capacity [J]. Invest Ophth Vis Sci, 2016, 57(3): 1038-1051.

[12] ZHUANG Y, WANG Y, TANG X, et al. Exosomes generated from bone marrow mesenchymal stem cells limit the damage caused by myocardial ischemia-reperfusion via controlling the AMPK/PGC-1alpha signaling pathway [J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2025, 1871(6): 167890.

[13] KURIHARA S. Polyamine metabolism and transport in gut microbes [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2022, 86(8): 957-966.

[14] ZHAO Q, HUANG J F, CHENG Y, et al. Polyamine metabolism links gut microbiota and testicular dysfunction [J]. Microbiome, 2021, 9(1):224.

[15] YAN J, YAN J Y, WANG Y X, et al. Spermidine-enhanced autophagic flux improves cardiac dysfunction following myocardial infarction by targeting the AMPK/mTOR signalling pathway [J]. Brit J Pharmacol, 2019, 176(17): 3126-3142.

[16] KIM J. Spermidine rescues proximal tubular cells from oxidative stress and necrosis after ischemic acute kidney injury [J]. Arch Pharm Res, 2017, 40(10): 1197-1208.

[17] CHIU C J, MCARDLE A H, BROWN R, et al. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. Ⅰ. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal [J]. Arch Surg, 1970,101(4):478-483.

[18] SUN J, XU J, LIU Y, et al. Exogenous spermidine alleviates diabetic cardiomyopathy via suppressing reactive oxygen species, endoplasmic reticulum stress, and Pannexin-1-mediated ferroptosis [J]. Biomol Biomed, 2023, 23(5): 825-837.

[19] MADEO F, EISENBERG T, PIETROCOLA F, et al. Spermidine in health and disease [J]. Science, 2018, 359(6374): eaan2788.

[20] AFINANISA Q, CHO M K, SEONG H A. AMPK localization: A key to differential energy regulation [J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(20):10921.

[21] GAO M Y, ZHAO W, LI C M, et al. Spermidine ameliorates non-alcoholic fatty liver disease through regulating lipid metabolism via AMPK [J]. Biochem Bioph Res Co, 2018, 505(1): 93-98.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(82172155)

国家自然科学基金青年项目(82202410)