抑制UBE2O通过上调BMAL1减轻脓毒症急性肺损伤

Inhibiting UBE2O attenuates sepsis-induced acute lung injury by upregulating BMAL1 expression

摘要

目的 探讨泛素结合酶E2O（UBE2O）对脓毒症急性肺损伤（SI-ALI）的作用及机制。 方法 动物实验部分，将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组、盲肠结扎穿孔（CLP）组和UBE2O敲低（CLP+AAV1）组（通过气管内注射AAV1-UBE2O敲低腺病毒构建小鼠UBE2O敲低模型），CLP术后24 h处死小鼠，取肺组织进行检测，HE染色观察肺组织病理学改变；Smith评分评估肺损伤程度；计算肺组织湿干质量比（W/D）；qPCR及Western Blot检测UBE2O在肺组织中的表达；ELISA检测肺组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。细胞实验部分，将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）分为PBS组、LPS组和LPS+si-UBE2O组，分别通过qPCR和Western Blot实验检测UBE2O及BMAL1的mRNA和蛋白表达水平；ELISA检测细胞上清液中炎症因子水平。 结果 动物实验结果表明，相比于Sham组，CLP组小鼠的肺组织呈明显病理损伤，UBE2O表达显著上调，并伴随组织炎症因子水平升高；与CLP组相比，UBE2O敲低组肺损伤减轻，炎症因子水平下降；在细胞实验中，LPS刺激RAW264.7细胞后，与PBS组相比，UBE2O表达及炎症因子水平均显著升高；在LPS刺激基础上抑制UBE2O可使BMAL1表达增加，并显著减轻巨噬细胞炎症反应。 结论 抑制UBE2O通过上调BMAL1的表达减轻脓毒症急性肺损伤。

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of the ubiquitin-conjugating enzyme E2O (UBE2O) in sepsis-induced acute lung injury (SI-ALI). Methods In vivo, male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups: sham, cecal ligation and puncture (CLP), and CLP+AAV1 (UBE2O-knockdown via intratracheal AAV1 injection). Mice were euthanized 24 hours post-CLP, and lung tissues were collected for histopathological evaluation (HE staining, Smith score, wet/dry weight ratio) and molecular analyses (qPCR and Western Blot for UBE2O expression; ELISA for IL-1β, TNF-α, and IL-6 levels). In vitro, RAW264.7 macrophages were grouped into PBS, LPS, and LPS+si-UBE2O treatments. UBE2O and BMAL1 expression was assessed by qPCR and Western Blot, and inflammatory cytokines in supernatants were measured via ELISA. Results Compared with the Sham group, the CLP group showed significantly aggravated lung injury, elevated UBE2O expression, and increased inflammatory cytokines. In contrast, UBE2O knockdown (CLP+AAV1) alleviated lung damage and reduced inflammatory mediator levels. In vitro, LPS stimulation upregulated UBE2O and promoted cytokine release in RAW264.7 cells. However, UBE2O inhibition further increased BMAL1 expression and attenuated the inflammatory response in LPS-treated macrophages. Conclusion Inhibition of UBE2O attenuates sepsis-induced acute lung injury through upregulation of BMAL1.

Graphical abstract

关键词

脓毒症 / 急性肺损伤 / 泛素结合酶E2O / BMAL1

Key words

Sepsis / Acute Lung Injury / Ubiquitin-Conjugating Enzyme E2O / BMAL1

脓毒症（sepsis）是由严重感染而引发的危及生命的器官功能障碍^［1］。急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是脓毒症最早且最常见的并发症，可进展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ARDS以急性弥漫性炎症性肺损伤为特征，最终可导致急性呼吸衰竭^［2］。尽管近年ARDS治疗方面取得一定进展，但其死亡率仍超过40%，关键在于目前发病机制研究不清，临床缺乏有效的针对性治疗手段^［3］。

泛素结合酶E2O（ubiquitin conjugating enzyme E2O，UBE2O）是一种兼具E2结合酶和E3连接酶活性的杂合酶。其C端含E2结合酶催化结构域，N端兼具底物识别与E3连接酶功能，可直接催化底物多聚泛素化，在蛋白质稳态调控及表观遗传修饰等过程中发挥核心作用^［4］。UBE2O的表达和作用具有高度的疾病类型和组织特异性，在绝大多数癌症中，UBE2O高表达通过降解关键的抑癌蛋白或代谢调控蛋白，驱动肿瘤的恶性进展；而在阿尔茨海默病中，其表达下降或功能缺失从而起到改善突触损伤和认知障碍的作用^［5-7］。UBE2O保守区域2（conserved region-2，CR2）结构域中的半胱氨酸（Cys）残基可与BMAL1相互作用，进而介导BMAL1的泛素化修饰并促进其降解^［8］。然而，其在脓毒症急性肺损伤（sepsis induced acute lung injury， SI-ALI）中的作用机制尚未阐明。本研究旨在探讨UBE2O在SI-ALI中的作用及其潜在的机制，为SI-ALI的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　实验动物

4~6周龄的SPF级野生型C57BL/6小鼠30只，体质量18~22 g，购自鼠来宝生物科技有限公司，在武汉大学人民医院动物实验中心的SPF环境中适应性饲养至少1周，提供标准食物和水。一切实验程序均严格按照中国实验动物管理立法规定进行，该实验经过武汉大学人民医院动物研究伦理委员会批准［编号：WDRM动（福）第20230406A号］。

1.1.2　实验细胞

RAW264.7细胞来自武汉大学人民医院典藏中心，培养于含有10%胎牛血清、1%青霉素+链霉素双抗的DMEM高糖培养基中，培养环境为37 ℃、5% CO₂。

1.1.3　实验仪器与试剂

激光扫描共聚焦显微镜、光学显微镜（Olympus，日本）；流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）；蛋白电泳仪、扫描仪（赛维尔，武汉）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国）；荧光定量PCR仪（BIO-RAD，美国）。AAV1-UBE2O敲低腺病毒（和元生物，上海）；DMEM高糖培养基（源培生物，上海）；IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒以及ROS试剂盒（碧云天，上海）；UBE2O抗体（三鹰生物，武汉）；BMAL1抗体（Cell Signaling Technology，美国）；抗兔及抗鼠IgG单克隆抗体（爱博泰克生物，武汉）。

1.2　实验方法

1.2.1　小鼠分组及UBE2O敲低模型的构建

采用盲肠结扎穿孔术（cecum ligation and puncture，CLP）构建小鼠脓毒症模型，通过气管内注射腺相关病毒1型（adeno-associated virus type 1，AAV1）构建UBE2O敲低模型。将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组（每组10只）：假手术（Sham）组、CLP组和UBE2O敲低（CLP+AAV1）组。AAV1组小鼠经气管内注射AAV1-UBE2O敲低腺病毒，Sham组和CLP组小鼠则注射等剂量空载腺相关病毒作为对照。病毒注射3周后，通过检测确认UBE2O敲低效率。随后，对CLP组和CLP+AAV1组小鼠行盲肠结扎穿孔术，Sham组小鼠行假手术。

1.2.2　小鼠CLP模型构建

所有小鼠均以2%异氟烷行吸入麻醉处理。将CLP组和CLP+AAV1组小鼠放入气麻机，以3 L·min^-1流速通入异氟烷进行诱导麻醉。麻醉成功后，将小鼠仰卧位固定于手术台，鼻部固定气麻导管，并以1.5 L·min^-1流速维持麻醉。常规备皮（手术区域脱毛），75%乙醇溶液消毒腹部皮肤。沿腹正中线作约2 cm切口，打开腹腔。于腹腔右下部定位盲肠，在盲肠远端1/2处行结扎，使用无菌20 G针头在结扎远端贯穿穿刺，挤出少量肠内容物后将盲肠回纳腹腔，逐层缝合关闭腹腔。Sham组小鼠仅行开腹及关腹操作，不进行盲肠结扎穿孔。术后，所有小鼠均经后颈部皮下注射生理盐水（50 mL·kg^-1）进行液体复苏。分组标记小鼠，待其苏醒后放回笼具，观察并记录术后24 h死亡率。

1.2.3　细胞模型构建

采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对UBE2O进行敲低。LPS+si-UBE2O组细胞首先转染靶向UBE2O的siRNA作用48~72 h；PBS组和LPS组则转染等剂量阴性对照作用相同时间。随后，LPS组和LPS+si-UBE2O组加入1 μg·mL^-1 LPS进行刺激，PBS组加入等体积PBS。各组细胞继续处理24 h后收集样本进行检测。

1.2.4　肺组织苏木精-伊红(HE)染色及Smith评分

取肺组织，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后进行HE染色，组织切片数字扫描仪扫描后观察肺组织病理变化并进行Smith评分。每张组织切片选用5个高倍镜视野，根据肺水肿、肺泡及间质的炎细胞浸润、肺泡及间质出血、肺不张及肺透明膜的形成情况进行Smith评分的0~4分半定量分析：正常为0分，轻度损伤（病变范围<25%）为1分，中度损伤（病变范围在25%~50%）为2分，重度损伤（病变范围在50%~75%）为3分，最大损伤（病变范围>75%）为4分。

1.2.5　肺组织湿干质量比（wet/dry weight ratio，W/D）

用吸水纸吸干肺组织表面水分，置于分析天平称取湿重（W）。随后将肺组织转移至1.5 mL EP管中，60 ℃烘箱烘干至恒重后称取干重（D）。计算肺组织W/D比值，用于评估肺水肿程度。

1.2.6　肺组织免疫荧光检测

组织切片经脱蜡及抗原修复（EDTA修复缓冲液）处理后，用含5%牛血清白蛋白的封闭液室温封闭30 min。一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加入相应荧光标记二抗，室温避光孵育1 h。DAPI染色复染细胞核，PBS洗涤，抗荧光淬灭封片剂封片。最后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.7　蛋白免疫印迹检测（Western Blot）

取小鼠肺组织20 mg，加入RIPA裂解液进行研磨，置于冰上充分裂解后离心取上清，采取BCA法测蛋白浓度。配置10%SDS凝胶，加样，电泳，再转移至PVDF膜。转膜结束使用5%脱脂奶粉封闭后4 ℃孵育一抗过夜。次日使用TBST缓冲液洗膜，室温孵育二抗1 h。待结束再次洗膜3次，使用ECL化学发光法显色，行定量分析。

1.2.8　q-PCR法检测mRNA水平

用TRIzol提取总RNA，测浓度，逆转录合成cDNA后进行实时荧光定量PCR检测。以β-actin为内参基因，采用2^-ΔΔCt 法计算相对mRNA水平。引物序列见表1。

1.2.9　流式细胞术检测巨噬细胞M1极化

刺激巨噬细胞诱导M1极化，取100 μL待测细胞加入PE抗小鼠CD86抗体，4 ℃避光孵育30 min，离心弃上清，用预冷的PBS洗涤后再次离心弃上清，再用300 μL PBS重悬细胞。用流式细胞仪在1 h内检测M1型巨噬细胞标志物CD86的表达。

1.2.10　ELISA法检测炎症因子水平

按照ELISA试剂盒说明书，加入标准品和待测样品后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，培养箱孵育60 min后洗涤，再加入显色液和终止液后用酶标仪读取450 nm波长处的光密度（OD）值，绘制标准曲线计算IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。

1.3　统计学分析

运用Graphpad 9.5软件进行数据处理并绘图。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重因素比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1　UBE2O在CLP小鼠肺组织及LPS诱导RAW264.7中高表达

HE染色结果显示，与Sham组相比，CLP组小鼠肺组织呈现显著的病理损伤，包括肺水肿、肺泡及间质出血、炎症细胞浸润增多（P<0.05）（图1A~1C）。Western Blot和qPCR检测结果显示，与Sham组相比，CLP组小鼠肺组织中UBE2O蛋白及mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）（图1D、1F）。在RAW264.7巨噬细胞中，LPS组的UBE2O蛋白及mRNA表达水平较PBS组亦显著升高（P<0.05）（图1E、1G）。

2.2　抑制UBE2O减轻SI-ALI

免疫荧光结果显示，气管内注射靶向UBE2O的AAV1组肺组织可观察到eGFP荧光蛋白表达（图2A）。与CLP组相比，CLP+AAV1组小鼠肺组织中UBE2O蛋白及mRNA水平均显著降低（图2B~2C）。HE染色显示，CLP+AAV1组肺组织损伤程度较CLP组显著减轻，同时其肺组织损伤评分及W/D比值显著降低，炎症指标IL-6、TNF-α的表达亦显著降低（图2D~2H）。以上结果表明，抑制UBE2O可在组织病理层面改善脓毒症诱导的急性肺损伤。

2.3　抑制UBE2O改善巨噬细胞炎症反应

以RAW264.7巨噬细胞为模型，转染靶向UBE2O的siRNA，采用免疫荧光染色法检测UBE2O蛋白的表达水平，以验证siRNA的敲低效果。结果显示，LPS组UBE2O表达水平显著高于对照组，而LPS+si-UBE2O组UBE2O的表达相较于LPS组有所减少，表明转染有效（图3A）。与PBS组相比，LPS刺激显著升高了细胞炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平；而UBE2O低表达则显著抑制了LPS诱导的上述炎症因子释放（图3B~3D）。此外，LPS刺激相较于PBS组促进了巨噬细胞向M1型极化，表现为M1型细胞比例显著升高；相比之下，si-UBE2O转染显著降低了LPS组中M1型巨噬细胞的比例（图3E~3F）。上述结果提示，抑制UBE2O表达可有效减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症反应及M1型极化。

2.4　抑制UBE2O上调BMAL1表达

BMAL1蛋白及mRNA水平检测结果显示，与PBS组相比，LPS组BMAL1表达显著降低；而si-UBE2O处理则显著抑制了LPS诱导的BMAL1表达下调，其表达水平较LPS组显著升高（P<0.05）（图4）。上述结果表明，抑制UBE2O可促进BMAL1的表达。

3 讨论

本研究采用CLP诱导脓毒症急性肺损伤模型，并通过气管内注射腺相关病毒构建UBE2O敲低模型。HE染色结果显示，与Sham组相比，CLP组小鼠肺组织呈现典型SI-ALI病理改变，损伤程度加重，且炎症因子水平、Smith评分和W/D比值均显著升高（P<0.05），抑制UBE2O表达可减轻CLP诱导的上述变化。在细胞实验中，LPS刺激可诱导RAW264.7细胞产生显著炎症反应，其炎症因子表达水平较PBS组显著升高。随后，在动物和细胞模型中敲低UBE2O，证实该操作可上调BMAL1表达并减轻炎症反应。

脓毒症是一种由宿主对感染免疫应答失调引起的、危及生命的器官功能障碍，器官损伤是其主要的并发症^［9］。脓毒症诱发的急性肺损伤可发展为急性呼吸窘迫综合征，甚至导致呼吸衰竭，这是脓毒症患者死亡的重要原因。在肺组织层面，炎症反应与氧化应激是SI-ALI的关键发病机制^［10］。

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system， UPS）是介导真核生物中超过80%蛋白质降解的关键途径，也是最重要的翻译后修饰系统之一。该体系包含泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、蛋白酶体以及去泛素化酶（DUB）^［11］。UBE2O是一种具有E2/E3双功能活性的泛素连接酶，其基因定位于人类染色体17q25区域^［12］。本研究发现，在脓毒症急性肺损伤动物模型（CLP组）及细胞模型（LPS刺激组）中，UBE2O蛋白及mRNA表达水平均显著高于对照组（Sham组/PBS组）（P<0.05）。经UBE2O敲低处理后，其蛋白与mRNA表达均显著下调（P<0.05）。上述结果提示脓毒症可诱导UBE2O表达升高，表明UBE2O可能在SI-ALI中发挥重要作用。

BMAL1作为生物钟的核心转录因子，通过调控巨噬细胞的节律性振荡，在脓毒症诱导的急性肺损伤的免疫稳态维持中发挥关键作用^［13］。维持BMAL1的节律性表达可减轻过度炎症反应（如TNF-α、IL-6释放）并保护肺内皮屏障功能^［14］。然而，脓毒症常导致BMAL1表达失调或缺失，进而加剧线粒体功能障碍、氧化应激、细胞死亡及免疫细胞浸润，加重肺组织损伤^［15］。在人骨肉瘤U2OS细胞中的研究^［16］发现，UBE2O的CR2结构域中的半胱氨酸（Cys）残基可与BMAL1相互作用，进而介导其泛素化修饰并促进降解。基于上述机制，本研究在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中进行了UBE2O敲低处理。结果显示，与PBS组相比，LPS组BMAL1表达水平显著降低；而si-UBE2O处理则显著逆转了LPS诱导的BMAL1表达下调（与LPS组相比，P<0.05）。这提示抑制UBE2O可显著上调LPS刺激下巨噬细胞中BMAL1的表达。

本研究发现UBE2O可能通过调节BMAL1的表达，参与脓毒症急性肺损伤的病理过程。然而，UBE2O与BMAL1是否存在直接相互作用及其具体作用机制尚未阐明，有待后续深入研究。综上所述，UBE2O可作为SI-ALI治疗的潜在靶点，为该疾病的治疗提供了新的理论依据。

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基金资助

新发突发与重大传染病防控国家科技重大专项(2025ZD01902600)

国家重点研发计划(2023YFC2308404)

国家自然科学基金面上项目(82272226)

国家自然科学基金面上项目(82572461)

国家自然科学基金青年科学基金项目（C类）(82502662)