重复经颅磁刺激改善阿尔茨海默病模型小鼠的突触超微结构

Repetitive transcranial magnetic stimulation improves synaptic ultrastructure in a mouse model of Alzheimer's disease

摘要

目的 探讨重复经颅磁刺激（rTMS）对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠的突触及突触超微结构的影响。 方法 将P301S小鼠随机分为假干预组（P301S-sham组）和干预组（P301S-rTMS组），进行为期8周的rTMS干预。rTMS干预结束后，采用Western Blot检测小鼠脑组织突触后致密蛋白95（PSD95）表达水平；透射电子显微镜检测突触数量、突触后膜致密度（PSD）宽度及突触间隙宽度；高尔基染色检测树突棘数量，并采用Sholl分析评估神经元树突分支复杂性。 结果 与P301S-sham组小鼠比较，P301S-rTMS组小鼠脑组织PSD95表达水平上调，突触和树突棘数量增加，PSD宽度增宽，突触间隙缩短，而树突分支复杂性未见明显改变。 结论 rTMS可增加AD模型小鼠突触及树突棘数量，优化突触超微结构，增强突触可塑性，发挥神经保护作用。

Abstract

Objective To investigate the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) on synapses and synaptic ultrastructure in a mouse model of Alzheimer's disease (AD). Methods P301S mice were randomly divided into a sham intervention group (P301S‑sham group) and an intervention group (P301S‑rTMS group). Mice received rTMS intervention for 8 weeks. After the intervention, the expression level of postsynaptic density protein 95 (PSD95) in mouse brain tissue was detected by Western Blot. The number of synapses, the width of postsynaptic density (PSD), and the width of the synaptic cleft were examined by transmission electron microscopy. The number of dendritic spines was detected by Golgi staining, and Sholl analysis was used to assess the complexity of neuronal dendritic arborization. Results Compared with mice in the P301S‑sham group, the expression level of PSD95 was upregulated, the numbers of synapses and dendritic spines were increased, the width of PSD was widened, and the width of the synaptic cleft was decreased in mice in the P301S‑rTMS group. However, there was no significant difference in dendritic branching complexity between the P301S‑sham group and the P301S‑rTMS group. Conclusion rTMS increased the numbers of synapses and dendritic spines, optimized synaptic ultrastructure, and enhanced synaptic plasticity, thereby exerting neuroprotective effects in AD model mice.

Graphical abstract

关键词

重复经颅磁刺激 / 阿尔茨海默病 / 突触超微结构 / 突触可塑性 / P301S小鼠

Key words

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation / Alzheimer's Disease / Synaptic Ultrastructure / Synaptic Plasticity / P301S Mouse

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以认知障碍和行为损害为临床特征的进行性的神经退行性疾病^［1］。AD特征性病理改变包括β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）斑块沉积和病理性tau蛋白聚集^［2］。tau蛋白过度磷酸化破坏微管稳定性，可引起突触功能障碍等病理改变，从而导致进行性认知功能减退，严重影响患者及照顾者的生活质量^［3］。

重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是一种无创、安全性高的神经调控技术，利用快速变化的磁场刺激大脑某一区域，可调节受刺激脑区及相关联脑区的神经元活动和兴奋性变化，目前已广泛应用于多种神经精神疾病的研究和治疗^［4-7］。近年来，rTMS在AD中的应用展现出广阔的前景。大量临床和动物研究^［8-12］表明，rTMS可以改善AD患者及模型小鼠的认知功能，并减轻包括Aβ负荷、神经炎症、突触损伤、神经元丢失等病理改变。然而，rTMS对突触超微结构的影响并未完全明确。

因此，本研究采用表达突变人源tau蛋白的P301S转基因小鼠，探讨rTMS对突触及突触超微结构的影响，为rTMS在AD临床治疗中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　实验动物

本研究采用3月龄雄性P301S转基因小鼠，购自江苏华创信诺医药科技有限公司。小鼠饲养于无特定病原体环境中，室温（22±2） ℃，可自由获取食物和水，接受12 h光照/12 h黑暗循环。所有动物实验操作均获得武汉大学人民医院伦理委员会的批准（批准号：S2456）。

1.2　rTMS

rTMS采用专为啮齿类动物设计的磁刺激仪（CCY-Ⅱ，武汉依瑞德医疗设备有限公司，湖北武汉），配有圆形线圈（直径：6.4 cm）。P301S小鼠于清醒状态下接受磁刺激，圆形线圈置于小鼠头部上方，线圈中心与小鼠眼间线中点对齐。本研究采用间歇性θ爆发式磁刺激，是rTMS的一种特殊刺激模式。刺激方案由20个序列组成，每个序列持续2 s，包含10组爆发式脉冲，每组爆发脉冲内含3个50 Hz的单脉冲，各组爆发脉冲之间以5 Hz频率重复，每组序列间隔8 s。P301S‐rTMS组rTMS干预每天1次，每周5次，持续8周，共刺激40次。假干预组（P301S‐sham组）小鼠的处理方式与干预组小鼠相同，只听见点击声但并未接受磁刺激。

1.3　蛋白免疫印迹实验（Western Blot）

行为学实验结束后，提取小鼠的脑组织进行后续病理指标检测。小鼠脑组织中加入RIPA裂解液提取总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE凝胶依次进行电泳、转膜，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%BSA室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗（anti-PSD95， 1∶1 000；anti-GAPDH， 1∶5 000）过夜；于次日洗涤后室温孵育对应种属的二抗（1∶4 000） 1 h，再次洗涤后置于ECL曝光液中于化学发光成像仪中进行显影。

1.4　透射电子显微镜

小鼠脑组织经过2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定后，置于梯度乙醇溶液中脱水，环氧树脂包埋，用超薄切片机60~80 nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片。铜网依次经过2%醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色、2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色，清洗后使用透射电子显微镜观察并采集图像。

1.5　高尔基染色

将小鼠脑组织完全浸泡至高尔基染液中避光处理14 d，再置于组织处理液中4 ℃避光处理3 d，用振荡切片机切片60 μm，滴加高尔基显影液30 min显影后水洗，封片后于显微镜下观察并采集图像。

1.6　统计学分析

所有数据分析均采用SPSS 26.0进行统计分析。两组间比较采用t检验，计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　rTMS增加P301S小鼠脑组织PSD95表达水平

突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein95，PSD95）是突触后蛋白，通过Western Blot检测rTMS对PSD95表达水平的影响（图1A）。结果表明，rTMS干预后，P301S小鼠脑组织的PSD95表达水平显著增加（图1B）。

2.2　rTMS对P301S小鼠脑组织突触的影响

通过透射电子显微镜观察rTMS对突触数量（图2A、2B）及突触超微结构（图2C、2D）的影响。结果显示，rTMS干预后，P301S小鼠的突触数量增多，突触后膜致密度（postsynaptic density， PSD）宽度显著增宽，突触间隙明显缩短（图2B、2D）。

2.3　rTMS增加P301S小鼠脑组织树突棘密度

通过高尔基染色观察rTMS对神经元树突棘的影响（图3A）。结果显示，与P301S-sham组小鼠相比，P301S-rTMS组小鼠的神经元树突棘数量显著增加（图3B）。

2.4　rTMS不改变P301S小鼠脑组织树突分支复杂性

通过Sholl分析检测神经元树突分支随离胞体距离变化的交点个数，以反映神经元的复杂性^［13］。结果显示，rTMS干预后，P301S小鼠脑组织的神经元树突分支在距离胞体不同距离的交点个数未见明显改变（图4A、4B）。

3 讨论

在P301S转基因小鼠中，突触丢失和突触功能损伤比tau蛋白纤维缠结更早出现，且与认知功能的下降密切相关^［14］。本研究聚焦于rTMS对P301S小鼠突触及突触超微结构的影响，发现rTMS可通过增加突触及树突棘数量，增宽PSD宽度，缩短突触间隙等多种途径优化突触超微结构，从而发挥神经保护作用。

突触是神经元间信息传递的结构基础，其超微结构的完整性直接影响突触传递效率。突触丢失和功能障碍是AD的核心病理改变之一，并可导致行为和认知损害^［3］。突触的基本结构由突触前膜、突触间隙和突触后膜组成，携带神经递质的突触囊泡从突触前膜中释放，经突触间隙扩散至突触后膜，与膜表面受体结合，产生一系列生化级联反应，完成神经信息的传递。通常认为，适宜的突触间隙宽度和较宽的PSD宽度有利于提高突触传递效率^［15］。PSD95是突触后膜致密区最主要的支架蛋白，通过与谷氨酸受体、黏附分子等相互作用，维持突触结构与功能的稳定性，被认为是突触后结构完整性的标志物^［16］。本研究发现rTMS干预后P301S小鼠脑组织内的PSD95蛋白表达升高，同时伴有PSD宽度增宽及突触间隙缩短。这些结果与既往研究^［17-18］结果一致，表明rTMS可优化突触超微结构，改善突触可塑性，发挥神经保护作用。

树突棘同样是突触后结构的重要组成部分，其密度增加可增强突触前信号的接收与整合能力，从而提高突触传递效率^［19］。此外，树突棘形态结构也呈现高度的动态适应性，其可塑性变化已被认为是突触可塑性的关键机制之一^［20］。本研究发现rTMS刺激后P301S小鼠脑组织的树突棘密度增加，提示突触可塑性的增强。但Sholl分析结果显示rTMS不改变P301S小鼠脑组织树突分支复杂性，提示rTMS的作用靶点可能更趋向于改善突触超微结构及功能，而非神经元整体形态的改变。这需要进一步的研究来验证。

综上，本研究发现rTMS干预可增加突触和树突棘数量，优化突触超微结构，增强突触可塑性，发挥神经保护作用。

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基金资助

湖北省重点研发计划专项(2022BCA029)