余甘子果实斑点病菌LAMP可视化检测方法的建立

摘要

【目的】建立余甘子果实斑点病菌快速、便捷、灵敏、可视的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测方法，为该病害的风险预判和科学防治提供依据。【方法】以余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌（Diaporthe phoenicicola）的翻译延伸因子EF-1α基因为靶序列，设计LAMP特异性扩增引物；以余甘子间座壳菌DNA为模板，优化反应温度、反应时间、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度和内外侧引物浓度比，建立LAMP检测最佳反应体系，测试其特异性和灵敏性，并对余甘子发病果实进行实际检测。【结果】适用于余甘子果实斑点病LAMP检测的最佳引物为引物组合4（EF4-F3/EF4-B3和EF4-FIP/EF4-BIP）;LAMP检测最佳反应条件为dNTPs浓度1.0 mmol/L,Mg²⁺浓度4 mmol/L,内外侧引物质量比6∶1,反应温度63℃,反应时间50 min。优化后的LAMP检测方法可特异性地检出余甘子间座壳菌（D.phoenicicola）,检测灵敏度可达0.01 ng/μL,且在实际应用中准确率高达100%。【结论】首次建立了余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌LAMP可视化快速检测方法，该方法特异性强、灵敏度高，操作简单，可用于田间余甘子果实斑点病菌的快速检测。

关键词

余甘子 / 间座壳菌 / 环介导等温扩增技术 / 灵敏性 / 特异性 / 可视化