猪圆环病毒3型LAMP-PfAgo检测方法的建立

摘要

【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法，用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因，构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1～PCV3-T4等4组引物（每组包括1对内引物和1对外引物）,以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组，并对LAMP反应的Mg²⁺浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列，设计PCV3-gs1～PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针，进行LAMP-PfAgo反应，筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、 gDNAs浓度、Mn²⁺浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价；并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测，比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列，表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg²⁺终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增，并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn²⁺终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示，LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法，该方法灵敏度高和特异性强，具有潜在的临床应用价值。

关键词

猪圆环病毒3型 / PfAgo / 环介导等温扩增 / 即时检验 / 猪